Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

Summary

Este artigo demonstra os princípios de uma injeção rápida, minimamente invasiva de micropartículas fluorescentes para a circulatory system de peixes pequenos e a visualização na vivo das micropartículas em sangue de peixe.

Abstract

A administração sistémica de tamanho micro partículas em um organismo vivo pode ser aplicada para a visualização da vasculatura, drogas e entrega de vacina, implantação de células transgénicas e pequenos sensores ópticos. No entanto, microinjeções intravenosas em animais de pequenos porte, que são principalmente usados em laboratórios biológicos e veterinários, são muito difíceis e exigem pessoal treinado. Aqui, vamos demonstrar um método robusto e eficiente para a introdução de micropartículas no sistema circulatório do adulto peixe-zebra (Danio rerio) por injeção para o rim de peixe. Para visualizar as micropartículas introduzidas na vasculatura, propomos uma técnica simples de intravital imagem em guelras de peixe. In vivo , monitoramento do zebrafish pH sangue foi realizada utilizando um fluorescente microencapsulado injetado sonda, SNARF-1, para demonstrar uma das possíveis aplicações da técnica descrita. Este artigo fornece uma descrição detalhada do encapsulamento do corante sensíveis ao pH e demonstra os princípios da injeção rápida e visualização das microcápsulas obtidas para in vivo de gravação do sinal fluorescente. O método proposto de injeção é caracterizado por uma taxa de mortalidade baixa (0-20%) e alta eficiência (70-90% de sucesso) e é fácil de instituir utilizando equipamentos comumente disponíveis. Todos os procedimentos descritos podem ser executados em outras espécies de peixes pequenos, tais como guppies e medaka.

Introduction

A administração de microtamanho de partículas em um organismo animal é uma tarefa importante em áreas como a droga e vacina entrega¹, vasculatura visualização², implantação de célula transgénicos³e implantação minúsculo sensor óptico ^{4 , 5}. no entanto, o procedimento de implantação para microescala partículas dentro do sistema vascular dos animais de laboratório pequeno é difícil, especialmente para os organismos aquáticos delicados. Para amostras de pesquisa populares como zebrafish, aconselha-se que estes procedimentos ser esclarecido us....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a directiva da União Europeia 2010/63/UE para experiências em animais e foram aprovados do Animal temas pesquisa Comissão do Instituto de biologia na Universidade Estatal de Irkutsk.

1. fabricação de microcápsulas

Nota: Microcápsulas carregando uma tintura fluorescente são preparadas usando um conjunto de camada por camada de polieletrolitos oposta carregado^7,8. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente.

1. Para sintetizar porosa CaCO₃ microco....

Results

Os resultados obtidos vêm de um dos três principais categorias do protocolo apresentado: a formação de micropartículas fluorescentes por encapsulamento de um corante fluorescente (Figura 1), a injeção de rim de microcápsulas com mais visualização no Gill capilares (Figura 2 e 3) e, finalmente, na vivo espectral gravação de fluorescência SNARF-1 para monitorar níveis de pH (

Discussion

Para demonstrar a injeção de micropartículas no rim zebrafish, usamos semi-permeável microcápsulas carregadas com um corante indicador. Assim, o protocolo contém instruções para a preparação das microcápsulas usando o assembly de camada por camada de polieletrolitos oposta carregado^{7,8,15,16,17 ,18} (figu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Sonda fluorescente. Qualquer outro corante fluorescente ligado a polímero apropriado pode ser usado como enchimento de microcápsula
Conjugado de isotiocianato de albumina-fluoresceína (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonda fluorescente
Isotiocianato de rodamina B-Dextrano (RITC-dextrano)	SIGMA	R9379	Sonda fluorescente
Cloreto de cálcio	SIGMA	C1016	CaCO3 formação
de modelosCarbonato de sódio	SIGMA	S7795	CaCO3 formação de modelos
Poli(cloridrato de alilamina), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Polímero catiônico
Poli(4-estirenossulfonato de sódio), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Polímero aniônico
Poli-L-lisina [20 kDa] enxertado com polietilenoglicol [5 kDa], g = 3,0 a 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Polímero final para aumentar a biocompatibilidade de microcápsulas Cloreto de
sódio	SIGMA	S8776	Para dissolver polímeros aplicados
Sistema de Purificação de Água	Millipore	SIMSV0000	Para preparar água deionizada
Agitador magnético	Stegler		Para formação
de modelos de CaCO3Eppendorf  Pesquisa  mais pipeta, 1000 µ L	Eppendorf		Soluções de dosagem
Eppendorf  Pesquisa  mais pipeta, 10 µ L	Eppendorf		Soluções de dosagem Ponteiras de
pipeta, faixa de volume de 200 a 1000 µ L	F.L. Medical	28093	Soluções de dosagem
Pontas de pipeta, faixa de volume 0.1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Soluções de dosagem
Mini-centrífuga Microspin 12,	BioSan		Para procedimento de centrifugação-lavagem de microcápsulas
Tubos de microcentrífuga, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Síntese e armazenamento de microcápsulas
Agitador Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		Para reduzir a agregação de microcápsulas
		ultrassônica	Para reduzir a agregação de microcápsulas
Fones de ouvido			Para proteger os ouvidos do ultrassom
Ácido etilenodiaminotetracético	SIGMA	EDS	Para dissolver os modelos de CaCO3
Fosfato monossódico	SIGMA	S9638	Preparação de tampões de pH
Fosfato dissódico	SIGMA	S9390	Preparação de tampões de pH
Hidróxido de sódio	SIGMA	S8045	Para ajustar o pH da solução de EDTA e tampões
Câmara do termostato			Para secar microcápsulas em lâmina de vidro
Hemocitômetro câmara			Para investigar a distribuição de tamanho e concentração das microcápsulas preparadas
Microscópio fluorescente Mikmed 2	LOMO		Visualização in vivo de microcápsulas em sangue
de peixeConjunto de filtros fluorescentes para SNARF-1 (deve ser escolhido dependendo do modelo do microscópio; o exemplo é fornecido)	Chroma	79010	Visualização de microcápsulas com sondas fluorescentes
Espectrômetro de fibra QE Pro	Ocean Optics		Calibração de microcápsulas sob microscópio
Fibra óptica QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m		Oceânica	Para conectar o espectrômetro com a porta do microscópio
Colimador F280SMA-A	Thorlabs	Para conectar o espectrômetro com a porta do microscópio
			sob microscópio
Microcapilares de vidro Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	Para coletar sangue de peixe
Óleo de cravo	SIGMA	C8392	Anestesia de peixe
Lanceta nº 11	Apexmed international B.V.	P00588	Para cortar a cauda do peixe e soltar a agulha de aço da ponta do autoinjetor de insulina
Heparina, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Para tratar todas as superfícies que entram em contato com o sangue de peixe durante a coleta de sangue de peixe
Seven 2 Go Pro pH-meter com um microeletrodo	Mettler Toledo		Para determinar o pH do sangue de peixe
Agulhas de caneta de insulina Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Para procedimento de injeção. Qualquer agulha fina (Ø 0,33 mm ou menos) é apropriada
Capilares de vidro, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Para procedimento de injeção
Tocha			de gás Para soldar agulha de aço ao capilar de vidro
Microinjetor IM-9B	NARISHIGE		Para dosagem precisa de microcápsulas suspensão Placas de
Petri, 60 mm x 15 mm, poliestireno	SIGMA	P5481	Para manipulações com peixes sob anestesia
Colher			de plásticoPara manipulações com peixes sob anestesia
Esponja			Para manipulações com peixes sob anestesia
Tesoura de dissecção	Thermo Scientific	31212	Para remover a cobertura branquial da cabeça do peixe
Pipeta Pasteur, 3,5 mL	MARCA	Z331767	Para umedecer as guelras dos peixes