Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.
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Artigo de método
Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Enquanto a introdução de medicamentos de modulador de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) revolucionou a cuidados na fibrose cística (CF), o modelo de terapia genótipo-dirigido, atualmente em uso tem várias limitações. Grupos de primeira, raro ou pouco estudado de mutação são excluídos dos ensaios clínicos definitivos. Além disso, como drogas adicionais modulador entrarem no mercado, ele se tornará difícil de otimizar as escolhas de modulador para um sujeito individual. Estas duas questões são tratadas com o uso de sistemas de paciente-derivado, individualizado pré-clínicos modelo de função CFTR e modulação. Células epiteliais nasais humanas (HNEs) são uma fonte facilmente acessível de tecido respiratório para esse modelo. Aqui, descrevemos a geração de um modelo tridimensional esferoide de função CFTR e modulação usando HNEs primários. HNEs são isolados de indivíduos de uma forma minimamente invasiva, expandiu-se em condições de reprogramação condicionais e semeado na cultura esferoide. Dentro de duas semanas de semeadura, culturas de esferoide geram esferoides HNE que podem ser estimulados com 3', 5'-cíclico adenosina monofosfato (cAMP)-gerando agonistas para ativar a função CFTR. Inchaço de esferoide é então quantificado como um proxy de atividade CFTR. Esferoides HNE capitalizar a origem minimamente invasiva, mas respiratória das células nasais para gerar um modelo acessível e personalizado relevante para um epitélio refletindo a mortalidade e a morbidade da doença. Em comparação com as culturas HNE interface ar-líquido, esferoides são relativamente rápidas amadurecer, que reduz a taxa de contaminação global. Na sua forma atual, o modelo é limitado pela baixa taxa de transferência, mas isso é compensado pela relativa facilidade de aquisição de tecido. Esferoides HNE podem ser usados para confiantemente quantificar e caracterizar a atividade CFTR no nível individual. Um estudo em curso para amarrar esta quantificação na vivo resposta droga irá determinar se esferoides HNE são verdadeiro pré-clínicos preditor de resposta do doente à modulação de CFTR.
Introdução
Fibrose cística (CF) é uma doença fatal, autossômica recessiva, afetando mais de 70000 pessoas em todo o mundo1. Esta doença genética da vida-gordura é causada por mutações na condutância transmembranar de fibrose cística regulador proteína (CFTR)2. CFTR é um membro da família de gaveta de trifosfato de adenosina-ligação e funções como um canal iônico, permitindo a circulação de cloreto e bicarbonato através das membranas apicais de epitélios polarizadas múltiplos, incluindo o trato gastrointestinal, glândulas sudoríparas, respiratória e árvore, entre outros3,4. ....
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Protocolo
Amostras HNE foram obtidas de indivíduos recrutados através de Hospital Medical Center CF Research Center Cincinnati infantil. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB), do Hospital Medical Center infantil de Cincinnati. Obteve-se consentimento escrito de todos os indivíduos antes do teste.
1. prepare a expansão Media e Media antibiótico
- Reunir os componentes de mídia listados na tabela 1. Descongelar materiais congelados à temperatura ambiente e fazer as necessárias soluções conforme indicado na tabela 1 em "Mídia de expansão".
Nota: Tenha cuidado ao ....
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Resultados
HNEs deve anexar para o prato de cultura e formam pequenas ilhas de células dentro de 72 h de semeadura; exemplos de formação de ilha de bom e pobre em uma semana são mostrados na figura 1A e 1B, respectivamente. Estas ilhas devem expandir para cobrir o prato ao longo de 15-30 dias. Amostras de pequenas ou de qualidade inferior podem levar mais tempo e muitas vezes não renderá esferoides útil. Contaminação com agentes infecciosos é evidenciad.......
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Discussão
Este protocolo descreve a geração de culturas de esferoide de paciente-derivado nasal células capazes de produzir um modelo individualizado, específico da função CFTR. Existem várias etapas-chave no processo que deve ser atendido de perto para evitar a dificuldade. Primeiro é uma aquisição de boa amostra do nariz do paciente. Deve ter uma boa amostra > 50.000 células, limitada muco/detritos e estar pronto para processamento dentro de 4 h (apesar de sucesso também é facilmente alcançável com pernoite no gelo do transporte.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela terapêutica de fundação de fibrose cística, conceder número CLANCY14XX0 e através da Fundação de fibrose cística, conceder o número CLANCY15R0. Os autores desejam agradecer a Kristina Ray pela sua assistência no recrutamento de paciente e fiscalização regulamentar. Os autores também desejam agradecer ao grupo de trabalho HNE, apoiado pela Fundação de fibrose cística, que ajudou na geração de recursos de cultura HNE: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomão Marty e Katherine Tuggle.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo Eppendorf de 1,5 mL | USA Scientific | 4036-3204 | |
| Frasco de Filtro de 150 mL | Midsci | TP99150 | Para filtrar Mídia |
| 15 mL Tubo Cônico | Midsci | ||
| Frasco de Filtro de 1 L | Midsci | TP99950 | Para filtrar Mídia |
| 35 mm Prato com Fundo de Vidro | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Opcional |
| 3-Isobutil-1-Metilxantina (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Preparar uma solução-mãe de 100 mM de 22,0 mg em 1 ml de DMSO |
| Tubo Cônico Midsci de 50 mL | |||
| Accutase | Tecnologias Celulares Inovadoras, Inc. | AT-104 | Solução de desprendimento de células |
| Adenina | Sigma-Aldrich | A2786-25G | Veja a Tabela 1 |
| Anfotericina B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Veja a Tabela 1 |
| Extrato de Cérebro Bovino (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | Veja a Tabela 2 |
| Hidrato de Ceftazidima | Sigma-Aldrich | C3809-1G | Veja a Tabela 1 |
| Raspadores de Células 20 cm | Midsci | ||
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,0 mg em 1 mL de DMSO |
| Toxina da cólera B (de Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | Veja a Tabela 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Escova de citologia |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes | Tecnologias de Vida | 11330-057 | Meio Base; Veja as Tabelas 1 e 2 |
| Fator de Crescimento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Livre de Origem Animal) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 Veja a | Tabela 1 |
| Epinefrina | Sigma-Aldrich | E4250-1G | Veja a Tabela 2 |
| Etanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Etanolamina | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16,6 mM solução; Veja a Tabela 2 |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS de alto desempenho) | Invitrogen | 10082147 | Consulte a Tabela 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,1 mg em 1 mL de DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Matriz de Membrana Basal Reduzida pelo Fator de Crescimento Corning Matrigel (TFG), Sem Vermelho de Fenol, Sem LDEV, 10 mL. |
| Hemacitômetro | Hausser Scientific | 1483 | |
| Solução de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Solução de Colágeno |
| HyClone (também conhecido como FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | Veja a Tabela 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | Veja as Tabelas 1 e 2 |
| Insulina, recombinante humana, solução de zinco | Technologies | 12585014 | solução de 4 mg/mL; ver Tabela 2 |
| Prato de fertilização in vitro de 4 poços, | NUNC não tratado (via Fisher Scientific) | 12566350 | placa de 4 poços para esferoides; tamanho de poço semelhante a uma placa de 24 poços |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Fibroblastos embrionários murinos irradiados |
| Metamorfo 7.7 | Dispositivos | MolecularesSoftware de Análise; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para uma cotação | |
| Microscópio invertido Olympus IX51 | descontinuado | Olympus Corporation | . Substituição: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ para uma cotação |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | Consulte a Tabela 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | Consulte a Tabela 2 |
| Ácido retinóico | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Consulte a Tabela 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 Livro de | de cureta nasal |
| 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | de imagem descontinuado | . Substituição: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para uma cotação |
| Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Água Estéril | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Placa de cultura de tecidos 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Placa de cultura de tecidos para expansão |
| Tobramicina | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Veja a Tabela 1 |
| Transferrina (Transferrina Humana 0,5 mL) | Lonza | CC-4205 | Veja a Tabela 2 |
| Triiodotrionine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; Ver Tabela 2 |
| Tripsina do Pâncreas Suíno | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL de pó lipofilizado; Consulte a Tabela 2 |
| Cloridrato de vancomicina de Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | Consulte a Tabela 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare uma solução-mãe de 1 mM de 0,4 mg em 1 mL de DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Adquira ou prepare uma solução-mãe de 10 mM de 4,5 mg em 1 mL de |
| dicloridrato de DMSO Y-27632 Inibidor de ROCK | Enzo Ciências da Vida | ALX-270-333-M025 | Veja a Tabela 1 |
Referências
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al.
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Reimpressões e permissões
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