Artigo de método

Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

DOI:

10.3791/57492

⸱

11 de abril de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Aqui nós descrevemos um método para gerar culturas esferoide tridimensional de células epiteliais nasais humanas. Esferoides são então estimulados a unidade de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR)-íon dependente e secreção fluida, quantificar a mudança no tamanho luminal esferoide como um proxy para função CFTR.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enquanto a introdução de medicamentos de modulador de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) revolucionou a cuidados na fibrose cística (CF), o modelo de terapia genótipo-dirigido, atualmente em uso tem várias limitações. Grupos de primeira, raro ou pouco estudado de mutação são excluídos dos ensaios clínicos definitivos. Além disso, como drogas adicionais modulador entrarem no mercado, ele se tornará difícil de otimizar as escolhas de modulador para um sujeito individual. Estas duas questões são tratadas com o uso de sistemas de paciente-derivado, individualizado pré-clínicos modelo de função CFTR e modulação. Células epiteliais nasais humanas (HNEs) são uma fonte facilmente acessível de tecido respiratório para esse modelo. Aqui, descrevemos a geração de um modelo tridimensional esferoide de função CFTR e modulação usando HNEs primários. HNEs são isolados de indivíduos de uma forma minimamente invasiva, expandiu-se em condições de reprogramação condicionais e semeado na cultura esferoide. Dentro de duas semanas de semeadura, culturas de esferoide geram esferoides HNE que podem ser estimulados com 3', 5'-cíclico adenosina monofosfato (cAMP)-gerando agonistas para ativar a função CFTR. Inchaço de esferoide é então quantificado como um proxy de atividade CFTR. Esferoides HNE capitalizar a origem minimamente invasiva, mas respiratória das células nasais para gerar um modelo acessível e personalizado relevante para um epitélio refletindo a mortalidade e a morbidade da doença. Em comparação com as culturas HNE interface ar-líquido, esferoides são relativamente rápidas amadurecer, que reduz a taxa de contaminação global. Na sua forma atual, o modelo é limitado pela baixa taxa de transferência, mas isso é compensado pela relativa facilidade de aquisição de tecido. Esferoides HNE podem ser usados para confiantemente quantificar e caracterizar a atividade CFTR no nível individual. Um estudo em curso para amarrar esta quantificação na vivo resposta droga irá determinar se esferoides HNE são verdadeiro pré-clínicos preditor de resposta do doente à modulação de CFTR.

Introdução

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Fibrose cística (CF) é uma doença fatal, autossômica recessiva, afetando mais de 70000 pessoas em todo o mundo1. Esta doença genética da vida-gordura é causada por mutações na condutância transmembranar de fibrose cística regulador proteína (CFTR)2. CFTR é um membro da família de gaveta de trifosfato de adenosina-ligação e funções como um canal iônico, permitindo a circulação de cloreto e bicarbonato através das membranas apicais de epitélios polarizadas múltiplos, incluindo o trato gastrointestinal, glândulas sudoríparas, respiratória e árvore, entre outros3,4. Como tal, disfuncional CFTR leva à disfunção epitelial multissistêmica, com maior mortalidade decorrente da doença respiratória1. No pulmão CF, perda do CFTR-conduzido as vias aéreas superfície líquida (ASL) regulamento e muco lançamento leva ao muco espessado, obstrução das vias aéreas, infecção crônica e remodelação progressiva das vias respiratórias e perda de função de pulmão1,5.

Apesar da identificação de disfunção CFTR como a causa da doença, terapias em CF tradicionalmente focada na atenuação dos sintomas (por exemplo, terapia de reposição de enzimas pancreáticas, terapias de limpeza das vias respiratórias)1. Esta abordagem foi revolucionada recentemente pelo advento da novela terapêutica, denominado "Moduladores CFTR," que destino diretamente CFTR disfuncional. Esta abordagem mudou a paisagem clínica de gestão sintoma para doença-modificando conta mas carrega várias limitações6,7,8,9,10. Atividade do modulador é específico para o defeito de proteína que acompanham cada mutação CFTR e limitada para selecionar populações genéticas11. Essa limitação é impulsionada pela natureza heterogênea dos defeitos de proteína, mas também pelo impracticality de ensaios clínicos em grupos de rara mutação. Além disso, entre indivíduos com genótipos estudados (por exemplo, F508del/F508del CFTR, o mais comum mutação CFTR), há grande variabilidade na doença fardo e modulador resposta6,7,8 ,9,11.

Para superar esses dois problemas, os investigadores propuseram o uso de modelos personalizados para testes pré-clínicos12. Este conceito utiliza tecido do paciente específico para gerar um sistema individualizado ex vivo modelo para testes de compostos, prevendo na vivo resposta assunto para terapias de forma personalizada. Uma vez validado, tal modelo poderia ser usado por médicos para terapia de precisão unidade independentemente do genótipo CFTR subjacente do paciente.

Brônquico epitelial (HBE) as células humanas obtidas de explant tecido no momento do transplante de pulmão estabeleceram a possibilidade de tal modelo para CF13,14. HBEs crescidos em uma interface ar-líquido (ALI) permitem a quantificação de CFTR funcional diretamente por meio de testes eletrofisiológicos, ou indiretamente através de medidas de ASL homeostase13,15. Este modelo tem sido fundamental para a compreensão de biologia CFTR e foi um impulsionador essencial no desenvolvimento do CFTR moduladores16. Infelizmente, HBE modelos não são defensáveis como um modelo personalizado devido a natureza invasiva da aquisição (transplante de pulmão ou escovagem brônquica) e falta de amostras para aqueles com mutações raras ou doença leve. Por outro lado, tecido intestinal, obtido a partir de espécimes de biópsia retal ou duodenal, pode ser usado para medição de corrente intestinal (ICM) ou um ensaio baseado em inchaço organoides para estudo individualizado CFTR função17,18, 19. ensaios de organoides, em particular, são modelos muito sensíveis de CFTR atividade20,21,22. Ambos os modelos são limitados pela fonte de tecido (tecido intestinal, enquanto a maioria das doenças de patologia é respiratória) e o método semi-invasivo de aquisição. Como alternativa, vários investigadores estudaram nasal epitelial (HNE) as células humanas para modelo CFTR restauração23,24,25. HNEs podem com segurança ser colhidas pelo pincel ou curetagem em indivíduos de qualquer idade e, quando cultivadas em ALI, recapitular muitas características da HBEs25,26,,27,28. Culturas de monocamada HNE tradicionalmente tem sido limitadas pela transformação escamosa e há muito tempo a maturidade29. Além disso, relatou um curto-circuito atuais medições em HNEs são menores do que aqueles em HBEs, sugerindo uma janela menor para detectar a eficácia terapêutica25.

Dada a necessidade de um modelo de cultura de tecidos personalizados, não-invasivo, respiratória da função CFTR, procuramos mesclar a sensibilidade de um ensaio de organoides inchaço-baseado, com carácter invasivo e respiratória da HNEs. Aqui, descrevemos o nosso método de gerar culturas "esferoide" 3-dimensional da HNEs para estudo individualizado de CFTR em um ensaio baseado em inchaço30. Esferoides HNE polarizar confiantemente com o ápice epitelial para o centro da esfera, ou o lúmen. Este modelo recapitula a numerosas características de um epitélio respiratório inferior e amadurece mais rapidamente do que as culturas ALI. Como um ensaio funcional, esferoides HNE confiantemente quantificam uma gama de CFTR função, bem como a modulação em grupos de mutação estudada (por exemplo, F508del CFTR). Este ensaio baseado em inchaço capitaliza sobre as propriedades de transporte de íon/sal de CFTR, indiretamente, medindo influxo de fluidos para o spheroid como água segue apical efluxo de sal. Desta forma, esferoides estimuladas com CFTR funcional incham robustamente, enquanto aqueles com CFTR disfuncional menos incham ou encolhem. Isto é quantificado através de análise de imagens de pré e esferoides pós-estimulação de 1 h, medindo a área luminal e determinar a porcentagem mudam. Esta medida pode ser comparada em seguida através de grupos experimentais para triagem de bioatividade de drogas de forma paciente específico.

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Protocolo

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Amostras HNE foram obtidas de indivíduos recrutados através de Hospital Medical Center CF Research Center Cincinnati infantil. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB), do Hospital Medical Center infantil de Cincinnati. Obteve-se consentimento escrito de todos os indivíduos antes do teste.

1. prepare a expansão Media e Media antibiótico

  1. Reunir os componentes de mídia listados na tabela 1. Descongelar materiais congelados à temperatura ambiente e fazer as necessárias soluções conforme indicado na tabela 1 em "Mídia de expansão".
    Nota: Tenha cuidado ao manusear a toxina da cólera, que é tóxico quando ingerido e é um irritante respiratório, olhos e pele. Fazer e combinar todas as soluções e meios de comunicação em condições limpas no armário a biossegurança.
  2. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, remova e descarte a 50 mL de meio base (Dulbecco modificado águia médio/F12) de um recipiente para compensar a adição de outros materiais. Despeje todos os meios de base à mão em um frasco de vidro de 1 L esterilizada.
  3. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL ou 1 mL pipeta conforme o caso, transferi todos os componentes restantes da seção de "meios de comunicação expansão" da tabela 1 para o frasco de vidro esterilizado contendo os meios de comunicação. Agite suavemente o frasco com a mão para misturar.
  4. Meios de filtro em um fresco, estéril 1L, 0,22 µm polietersulfona (PES) balão usando as instruções do fabricante do filtro e anotar com data e "meios de comunicação expansão".
  5. Prepare a mídia antibiótica. Fazem necessárias soluções antibióticas de estoque conforme indicado na tabela 1 em "Mídia antibiótica."
    1. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, transferi 150 mL de expansão de mídia para uma garrafa de vidro esterilizada fresco 250ml.
    2. Utilizando uma pipeta de 1 mL, adicione todos os componentes da seção "Antibiótico Media" da tabela 1 para o frasco de vidro esterilizado contendo os meios de comunicação. Agite com a mão até que a mídia é uniforme na aparência.
    3. Meios de filtro em um fresco, esterilizado 250ml, 0.22 balão de filtro do PES µm usando as instruções do fabricante e anotar com "meios de comunicação antibiótico" e a data.
  6. Armazenar mídia a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado, sugerindo a contaminação.

2. preparar a mídia de diferenciação

  1. Reunir os componentes de mídia listados na tabela 2. Descongelar materiais congelados à temperatura ambiente e fazer as necessárias soluções conforme indicado na tabela 2.
    Nota: Tenha cuidado ao manusear o ácido retinoico, que é uma toxina reprodutiva, pode ser tóxico se for ingerido e causa irritação de pele. Make, alíquota e combinar todas as soluções e meios de comunicação em condições limpas no armário a biossegurança.
  2. Remova e descarte a 52 mL do meio de base de um recipiente para compensar a adição de outros materiais. Despeje todos os meios de base em um frasco de vidro de 1 L esterilizada.
  3. Usando uma pipeta sorológica de 25 mL ou 1 mL pipeta conforme o caso, transferir todos os componentes restantes da tabela 2 para o frasco de vidro esterilizado contendo a mídia e agitar suavemente o frasco à mão para misturar.
  4. Meios de filtro em um fresco, estéril 1L, 0,22 µm polietersulfona (PES) balão usando as instruções do fabricante do filtro e anotar com "meios de comunicação diferenciação" e a data.
  5. Armazenar mídia a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado, sugerindo a contaminação.

3. casaco cultura pratos e fibroblastos alimentador da placa

Nota: Execute todas as etapas em condições limpas no armário a biossegurança.

  1. Misture 0,5 mL de estoque do colágeno e 37,5 mL de água estéril em um tubo cónico de 50 mL.
  2. Pipete 4-5 mL de solução de colágeno para cada prato limpo de cultura P100, garantindo que toda a superfície é coberta.
  3. Cobrir pratos com tampas e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
  4. A gabinete de segurança biológica, remova todas as tampas do prato. Agite a solução para cobrir o prato e, em seguida, Aspire.
  5. Esterilize por exposição à radiação ultravioleta (UV) luz para tampas de lugar h. 1 volta sobre os pratos, pratos de pilha e cubra com papel alumínio.
  6. Pratos de loja revestido a 4 ° C, por 3-6 meses, re-esterilização sob UV luz 15-30 min antes do uso de cultura de células.
  7. 24 h antes de obter uma amostra HNE, esterilizar um prato pré-pintados e o rótulo como Mouse embrionárias fibroblastos (MEF) e a data.
  8. Adicione a mídia de expansão para cobrir a placa (cerca de 5 mL), com uma pipeta sorológica.
  9. Descongele um frasco de 2 x 106 irradiados MEFs em banho-maria 37 ° C. Assim que os MEFs são descongelados, adicione metade do frasco (aproximadamente 106 células) no prato com uma pipeta de 1 mL, rodopiando à mão para dispersar.
  10. Incube a 37 ° C e 5% CO2 durante a noite em preparação para cultura HNE.
    Nota: Se necessário, passos 3.7-3.10 podem ser realizada até 60 min antes de chapeamento de células, embora durante a noite é ideal.

4. obter e processar amostra HNE

  1. Certifique-se de IRB-aprovado o consentimento/favorável é obtido para todas as disciplinas.
  2. Tem golpe paciente nariz para limpar o muco solto.
  3. Visualize inferior corneto usando um rhinoscope. Certifique-se de sem lesões ou pólipos são presente que pode impedir a coleta de amostra.
  4. Colete células nasais de narina primeira curetagem ou escovando.
    1. Curetagem: Cureta de curva no seu ponto médio para criar um ligeiro, ângulo de ~ 135° com o ápice longe da Copa de cureta. Introduza a cureta na narina e avançar a Copa cureta sob corneto inferior. Delicadamente pressione o copo cureta contra os inferiores corneto e raspar o corneto, puxando a cureta para a frente, repetição total de 3 - 4 vezes.
    2. Escova: Passe a citologia escovar abaixo do inferior Corneto, então girar e mover o pincel entrar e sair um pouco de 4 - 5 vezes, sem sair da narina.
  5. Cureta de lugar/escova em um cônico de 15 mL cheio de mídia antibiótico. Repita as etapas 4.3-4.4 para a outra narina, colocando a cureta/escova no mesmo tubo cónico.
  6. Loja cónica no gelo até que esteja pronto para processamento. Certifique-se que o processamento ocorre dentro de 4 h de aquisição da amostra, mas pode ocorrer tão tarde quanto 24 h após a aquisição, se necessário.

5. processo e expandir HNE células em pratos

Nota: Execute todas as etapas em condições limpas no armário a biossegurança.

  1. Usando uma pipeta de 1 mL e mídia da amostra cónica, lave todas as células de escovas de curetas/citologia no mesmo tubo cónico. Uma vez limpo, descartar curetas / brushes.
  2. Centrífuga cônico no 360 x g e 4 ° C por 5 min.
  3. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
  4. Ressuspender o sedimento celular em 3 mL de solução de desprendimento de célula, pipetagem com uma ponta de 1 mL para homogeneizar a mistura.
  5. Centrífuga cônico no 360 x g e 4 ° C por 5 min.
  6. Repita os passos 5.3-5.5 uma vez.
  7. Aspire o sobrenadante restante, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
  8. Ressuspender o pellet em 1 mL de antibiótico Media e contagem de células com um hemocytometer.
  9. Utilizando uma pipeta de 1 mL, chapa de células gota a gota sobre o prato revestido, fibroblasto-semeado, preparado na etapa 3.10. Adicione mídia antibiótico para totalmente, cubra o prato e dispersar as células em toda a superfície. Rotular o prato com o conteúdo e data e incubar a 37 ° C e 5% de CO2.
  10. Após 48 h, certifique-se de que as células estão conectadas para o prato de cultura. Aspire a mídia e substituir com bastante fresco Media antibiótico para cobrir a placa.
  11. Mudar a mídia 3 x semanal, aspirando a velha mídia com uma linha de vácuo e pipeta Pasteur e substituindo com suficiente mídia fresca para cobrir a placa. Depois de 5 dias na mídia de antibiótico, altere os meios de comunicação para mídia de expansão, continuando a substituir três vezes por semana.
    Nota: O risco de contaminação é alto na primeira semana da cultura. Manter amostras frescas numa incubadora separado para minimizar o risco de contaminação cruzada.
  12. Verifique o crescimento celular várias vezes por semana. Uma vez que as células são aproximadamente 70-80% de confluencia, prossiga para as células de passagem.

6. passagem HNE células

  1. Prepare a solução de tripsina 0,1% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
    Nota: Tenha cuidado de manipulação tripsina, que é um irritante de olhos e pele, respiratória.
    1. Pesa 15 mg de tripsina do pâncreas dos suínos em um tubo cônico.
    2. Pesa 56 mg de EDTA em um tubo cônico separado.
    3. O gabinete de segurança biológica, transferi tripsina e EDTA para uma garrafa de vidro esterilizada 250ml. Use uma pequena alíquota de salina tampão fosfato (PBS) para lavar os tubos de tripsina/EDTA para garantir a transferência completa.
    4. Adicione PBS estéril para trazer a solução total para 150 mL. Feche a tampa firmemente.
    5. Incube a solução de tripsina em um banho-maria 37 ° C até dissolver totalmente. Verifique cada 15 min e remova prontamente uma vez dissolvido.
      Nota: Não deixe desmarcada por períodos prolongados de tempo (por exemplo, durante a noite), como tripsina em solução irá desnaturar se aquecido por muito tempo.
    6. Limpe a garrafa com 2-3 jatos de 70% de etanol e retornar para a biossegurança do armário.
    7. Filtrar a solução de tripsina-EDTA 0,1% para um fresco, estéril 250ml, 0.22 balão de filtro do PES µm usando as instruções do fabricante e anotar com conteúdo e data.
    8. Armazenar a solução de tripsina-EDTA a 4 ° C por até um mês, descartando-se nublado.
  2. Trazer meios de diferenciação, 0,1% solução de tripsina-EDTA e PBS estéril à temperatura mais 30 min. Clean com etanol a 70% e a transferência para uma gabinete de biossegurança limpa.
  3. Na biossegurança do armário, use uma linha de vácuo e pipeta Pasteur para aspirar e descarte de meios de cultura de tecidos o prato. Lave o prato adicionando, agitando, e 5 mL de PBS usando uma pipeta limpa serológica de aspiração.
  4. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,1% para o prato de cultura de tecidos e retornar para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 5 min.
  5. Visualize as células em um microscópio invertido em 4-10 X. Verificar que as células desanexar do prato, tornar-se redondo e flutuam. Bata levemente o lado do prato cultura para desalojar as células, e/ou re-incubar por um adicional 5 min, até que a maioria das células são desanexados.
    Nota: Tenha cuidado para não remover rapidamente as células uma vez retiradas o prato de cultura; exposição prolongada a 0,1% Trypsin-EDTA irá prejudicar a viabilidade celular.
  6. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicionar 5 mL de expansão de mídia para o prato e coletar todo conteúdo líquido (10 mL no total) em um tubo cônico de 50ml rotulados, estéril.
  7. Se as células permanecem aderentes ao prato de cultura, repita os passos 6,4 6,6 através de de duas vezes, coletando conteúdo no mesmo tubo cónico.
    1. Se as células permanecem aderentes ao prato de cultura após três rodadas de exposição de solução de tripsina, use um raspador de célula estéril remover suavemente o restante. Depois de raspar o prato, lavar o raspador e o prato com 5 mL de mídia de expansão e recolher no mesmo tubo cónico rotulado.
      Nota: Se a passagem de esferoides, modifica este procedimento para executar uma tripsinização diferencial. Após a adição de tripsina solução (etapa 6.4.), verifique se o prato com frequência até fibroblastos têm destacado (tipicamente 1-2 min), deixar as células epiteliais só poligonais anexado ao prato. Coletar e Reserve este sobrenadante, que podem ser passadas para a frente para expansão. Repita as etapas de 6.4-6.6 usando a mesma solução de tripsina e coletar apenas as células epiteliais remanescentes para cultura de esferoide.
  8. Centrífuga cônico a 360 x g por 5 min e 4 ° C. Aspire a mídia de cônica.
  9. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de expansão Media e contagem de células usando um hemacytometer.
  10. Uma vez quantificado, as células podem ser divididas, se necessário, e passadas encaminhar para um novo prato de cultura (incluindo a preparação de co-cultura de fibroblasto, etapa 3 e chapear pilhas para expansão, passos 5.9-5.12) ou cultivadas como esferoides (etapa 7).
    Nota: Se passagem para um novo prato de cultura para a expansão, uma densidade de semeadura de 0.5-1 × 106 células em um prato de P100 é recomendado.

7. a propagação de células para culturas de esferoide HNE

Nota: Realizar todos os procedimentos nesta etapa, além de centrifugação, em uma armário de biossegurança limpa.

  1. Descongele a matriz da membrana basal no gelo por instruções do fabricante (100 µ l por esferoide bem).
    Nota: Considere fazer estéril alíquotas de 500 µ l da matriz da membrana basal na recepção; Este montante será propagar uma única placa de 4.
  2. Separe um número adequado de células diferencialmente trypsinized, passadas (da etapa 6,9), para uma concentração final de 500.000 células por mL da matriz. Para uma placa de 4, use 200.000 células. Colete em um tubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugue a mistura celular e mídia a 360 x g por 5 min a 4 ° C. Completamente, mas cuidadosamente Aspire e descartar a mídia usando uma pipeta de 1 mL, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.
  4. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, adicione 100 µ l por planejado bem da matriz da membrana basal ao tubo de 1,5 mL contendo as células. Mantenha o tubo no gelo.
  5. Pipetar acima e para baixo para cuidadosamente e completamente Ressuspender as células na matriz da membrana basal. Agir rapidamente para evitar a solidificação da matriz. Evite esvaziar completamente a ponta da pipeta para assegurar-se de bolhas de ar não sejam introduzidas a mistura de célula/matriz.
  6. Sementes de alíquotas de matriz 100 µ l em cada poço de uma placa de cultura 4-fertilização in vitro.
    1. Usando um par limpo da tesoura, retire o distal 3 a 4 mm de uma ponta de pipeta de 200 µ l.
    2. Usando a ponta aparada, cuidadosamente Pipete 100 µ l da mistura de célula/matriz para o centro de cada poço. Pipete lentamente, com o objetivo de fazer uma única matriz "gota" no centro de cada poço. A queda deve continuar a ser esférica e não deve tocar os lados do poço. Ao mover a placa, faça então com cuidado a evitar perturbar estas gotas.
    3. Incube as gotas de matriz de membrana basal em 37 ° C e 5% CO2 por 30 min, até sólido.
    4. Cuidadosamente Pipete 500 µ l de mídia de diferenciação em cada poço, tomando cuidado para não perturbar a queda de matriz. Certifique-se de que a mídia só um disfarce da matriz cair e adicione mais se necessário.

8. diferenciar e amadurecer HNE esferoides

  1. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL, suavemente, Aspire toda a mídia do poço; Evite aspirar a matriz, que irá destruir esferoides em parte da matrix, que, embora qualquer esferoides que deixaram para trás podem permanecer viáveis.
  2. Usando uma ponta de pipeta de 1ml fresco, suavemente adicione 500 µ l de mídia de diferenciação para o poço em torno da matriz. Não toque a matriz com a pipeta e evitar perturbar a queda de matriz.
  3. Volte esferoides a incubadora a 37 oC e 5% de CO2 para o crescimento contínuo. Repita os passos de 8,1 8,3 por três vezes semanais.
  4. Avalie a morfologia de esferoide diariamente sob um microscópio invertido em 20 X. Esferoides devem formar dentro de 3-5 dias de chapeamento e atingir a maturidade dentro de aproximadamente 10 dias.

9. pré-tratamento, estimular e esferoides HNE para análise da imagem

  1. Pré-tratamento esferoides como desejado antes da imagem como descrito anteriormente,30.
    Nota: Para o pré-tratamento de VX809, adicione 3 µM de VX809 para a mídia para 48-72 h antes da imagem latente. Misture 1 µ l de 10mm VX809 estoque (veja a Tabela de materiais) em 3,3 mL de mídia para esta concentração.
  2. Mudar cada um bem de esferoides de 1ml de fresco de diferenciação de mídia, incluindo pré-tratamento (etapas 8.1-8.3) antes de imagem esferoides.
  3. Prepare a estimulação fresca drogas soluções (forskolina, 3-isobutil-1-methylxanthine [IBMX], VX770 e CFTR inibidor 172 [Inh172]) de estoques (ver Tabela de materiais). Para forskolin/IBMX, adicione 1 µ l de cada unidade populacional a 98 µ l de água estéril em um único rotulado tubo de 1,5 mL. Para VX770 e Inh172, adicione 1 µ l de cada unidade populacional a 99 µ l de água estéril em tubos separados etiquetados 1,5 mL. Fazer um volume total permitindo a 50 µ l de solução para cada bem testados. Prepare soluções sob condições estéreis no armário a biossegurança.
  4. Transferi a placa de esferoide para uma câmara incubada conjunto para 37 ° C e 5% CO2, montado em um microscópio invertido equipado com software de captura de imagem eletrônica e um estágio mecânico para ajuste XY. Ligue o microscópio e câmera, bem como o computador de imagem.
  5. Capture imagens de linha de base de esferoides em um poço.
    1. Abra o software de captura de imagem (5.5 Slidebook para instruções abaixo). Uma vez inicializado, abra um novo arquivo, clicando em "Arquivo", depois "Novo". Nesse sentido o nome do arquivo e clique em "Salvar".
    2. Cuidadosamente, retire a tampa de placa de cultura e centralize uma gota de matriz sobre o objetivo.
    3. Começando no topo da gota matriz, mova em uma grade para encontrar esferoides ampliação de 20 x com a ocular do microscópio. Concentre-se acima e para baixo para capturar a esfera no seu ponto mais largo. Anote a localização de cada esferoide no mapa da gota matriz para re-identificar depois da imagem latente.
    4. No software, clique em "Captura de imagem". Para exposição, selecione "Manual" e digite 50 ms. Certifique-se de outras configurações são apropriadas (fator de Bin: 1 x 1, w: 512, 512 h:, X e Y Offset: 0). Digite um nome apropriado para cada imagem na caixa "Nome" (por exemplo, esferoide 1 linha de base). Clique em "Start" para exibir uma imagem ao vivo e "Salvar" para capturar uma imagem de linha de base.
    5. Repita etapas 9.5.1-9.5.4 até gol número é atingido, ou soltar toda matriz é fotografada.
      Nota: As diferenças de grupo podem ser detectadas com tão poucos como esferoides de 3-5 por condição, no entanto, tornou-se nossa prática de esferoides de 10 ou mais por condição para aumentar o poder da imagem. Variabilidade do ensaio é demonstrada na Figura 2 da seção "Representante resultados", com amostras de esferoides de 8-10 por assunto, por exemplo.
  6. Estimule esferoides.
    1. Utilizando uma pipeta de 200 µ l, adicione 50 µ l da droga da estimulação adequada para a mídia dentro do poço, tomando cuidado para não perturbar a matriz.
      Nota: Após esta diluição 10 vezes (50 µ l em 500 µ l de mídia), a concentração de fármaco final será: forskolina 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Para o campo apenas, adicione única forskolin/IBMX.
    3. Para cAMP + VX770, adicione forskolin/IBMX primeiro, depois o VX770 depois de 2 min.
    4. Para condições de inibida, adicionar Inh172 primeiro, depois a forskolina/IBMX depois de 2 min.
  7. Imediatamente após a estimulação, monitore esferoide inchaço por timelapse imagiologia por 1h. No software, clique em "Captura de imagem". Clique em "Timelapse" e defina o intervalo de 30 s, com uma duração de 60 min. Enter um nome apropriado e clique em "Salvar" para iniciar o timelapse.
    Nota: Timelapse padrão é para capturar imagens de um esferoide único cada 30 s para assegurar uma alta qualidade de vídeo. Alternativamente, realizar captura de ampliação inferior do poço inteiro (por exemplo, 4 X), e menos imagens capturadas se desejado. Se for usado um palco automatizado, executar timelapse de esferoides todos usando coordenadas predefinidas; caso contrário, use o timelapse de um subconjunto de esferoides para fornecer uma análise qualitativa de inchaço e assegurar que sem problemas sistemáticos surgem durante a imagem (por exemplo, descolamento de matriz do poço).
  8. Imediatamente após a conclusão da imagem timelapse 1 h, capturar imagens pós-estimulação de todos os esferoides (por passo 9.5) usando o mapa criado na etapa 9.5.3.
    1. Referem-se a pré-estimulação imagens para garantir que o mesmo plano de foco é usado para imagens de acompanhamento (a qualidade focal de em torno de células, esferoides ou detritos grandemente facilitar este processo).
    2. Salve arquivos com uma anotação emparelhada da etapa 9.5.4 (por exemplo, esferoide 1 pós-estimulação).
      Nota: concluir esta etapa imediatamente após o timelapse, como esferoides podem continuar a inchar.
  9. Substitua a mídia na imagem bem com Media de diferenciação fresco.
  10. Repita as etapas de 9.5 através de 9,9 para cada poço/condição, ajustando a drogas de estimulação, como indicado para condições experimentais.
  11. Uma vez que todas as imagens é concluída, retorne esferoides para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: Dependendo da esterilidade da câmara microscópio incubadas, contaminação pós-estimulação de esferoides pode ser bastante comum. Manter imagem de esferoides numa incubadora separado, para minimizar o risco de contaminação cruzada, ou descartar esferoides imediatamente após a imagem.

10. analisar imagens de esferoide HNE

  1. Exporte imagens capturadas tudo para um formato compatível com software de análise de imagem. No software, clique em "Exibir", passe o mouse sobre "Exportação" e selecione "Default vistas de todas as imagens como TIFF...". Salve para o disco rígido ou uma unidade flash para análise.
    Nota: A análise comercial software (Tabela de materiais) e arquivos. TIFF executam bem e são descritos aqui, embora análise também pode ser realizado usando outras plataformas. Ao nomear arquivos, analisando imagens de pessoal deve ser cego para as condições experimentais, mas consciente de que as imagens estão emparelhadas (pré e pós-estimulação) para garantir a análise equivalente.
  2. Usando o software de análise, delinear a área luminal de cada imagem de esferoide e exportar em um software de análise de dados.
    1. Software de análise aberta. Clique em "Arquivo", depois "abrir" e navegue até a pasta do arquivo que contém imagens de esferoide. Selecione todas as imagens para análise e clique em "Abrir".
    2. Clique em "Medida" e selecione "Medições de região". Região medições caixa de diálogo, selecione o droptab "Configuração" e certifique-se de caixas "Nome da imagem" e "Área" são verificadas.
    3. Clique em "Log" e selecione "Abrir dados Log". Clique em "Okey" sobre dados diálogo caixa e nome do arquivo de Log em conformidade (por exemplo, condição X, Data). Isto irá transferir todas as medições para uma planilha.
    4. Selecione o botão de ferramenta "Região de rastreamento" e cuidadosamente rastrear o lúmen do spheroid na primeira imagem para análise. Na caixa de diálogo de medição da região, clique em "Dados de Log" para efetuar a medição em Excel.
    5. Repita etapas 10.2.2-10.2.4 até que todos os esferoides são analisados.
  3. Calcular a variação percentual (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) na área luminal da linha de base para cada individual esferoide par de imagem e compilar dados para análise.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNEs deve anexar para o prato de cultura e formam pequenas ilhas de células dentro de 72 h de semeadura; exemplos de formação de ilha de bom e pobre em uma semana são mostrados na figura 1A e 1B, respectivamente. Estas ilhas devem expandir para cobrir o prato ao longo de 15-30 dias. Amostras de pequenas ou de qualidade inferior podem levar mais tempo e muitas vezes não renderá esferoides útil. Contaminação com agentes infecciosos é evidenciad...

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Discussão

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Este protocolo descreve a geração de culturas de esferoide de paciente-derivado nasal células capazes de produzir um modelo individualizado, específico da função CFTR. Existem várias etapas-chave no processo que deve ser atendido de perto para evitar a dificuldade. Primeiro é uma aquisição de boa amostra do nariz do paciente. Deve ter uma boa amostra > 50.000 células, limitada muco/detritos e estar pronto para processamento dentro de 4 h (apesar de sucesso também é facilmente alcançável com pernoite no gelo do transporte...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela terapêutica de fundação de fibrose cística, conceder número CLANCY14XX0 e através da Fundação de fibrose cística, conceder o número CLANCY15R0. Os autores desejam agradecer a Kristina Ray pela sua assistência no recrutamento de paciente e fiscalização regulamentar. Os autores também desejam agradecer ao grupo de trabalho HNE, apoiado pela Fundação de fibrose cística, que ajudou na geração de recursos de cultura HNE: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomão Marty e Katherine Tuggle.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo Eppendorf de 1,5 mLUSA Scientific 4036-3204
Frasco de Filtro de 150 mLMidsci TP99150Para filtrar Mídia
15 mL Tubo CônicoMidsci 
Frasco de Filtro de 1 LMidsci TP99950Para filtrar Mídia
35 mm Prato com Fundo de VidroMatTek CorporationP35G-0-20-COpcional
3-Isobutil-1-Metilxantina (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Preparar uma solução-mãe de 100 mM de 22,0 mg em 1 ml de DMSO
Tubo Cônico Midsci de 50 mL 
AccutaseTecnologias Celulares Inovadoras, Inc.AT-104Solução de desprendimento de células
AdeninaSigma-AldrichA2786-25GVeja a Tabela 1
Anfotericina BSigma-AldrichA9528-100MGVeja a Tabela 1
Extrato de Cérebro Bovino (9mg/mL)Lonza CC-4098Veja a Tabela 2
Hidrato de CeftazidimaSigma-AldrichC3809-1GVeja a Tabela 1
Raspadores de Células 20 cm Midsci 
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,0 mg em 1 mL de DMSO
Toxina da cólera B (de Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGVeja a Tabela 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Escova de citologia
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes Tecnologias de Vida 11330-057Meio Base; Veja as Tabelas 1 e 2
Fator de Crescimento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Livre de Origem Animal)Thermo Fisher ScientificPHG6045 Veja aTabela 1
EpinefrinaSigma-AldrichE4250-1GVeja a Tabela 2
EtanolFisher Scientific 2701
EtanolaminaSigma-AldrichE0135-500ML16,6 mM solução; Veja a Tabela 2
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)TCI America E0084
Soro Fetal Bovino (FBS de alto desempenho)Invitrogen 10082147Consulte a Tabela 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Prepare uma solução estoque de 10 mM de 4,1 mg em 1 mL de DMSO
Growth Factor-Reduced MatrigelCorning, Inc.356231Matriz de Membrana Basal Reduzida pelo Fator de Crescimento Corning Matrigel (TFG), Sem Vermelho de Fenol, Sem LDEV, 10 mL.
HemacitômetroHausser Scientific1483
Solução de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ASolução de Colágeno
HyClone (também conhecido como FetalClone II) GE Healthcare SH30066.03HIVeja a Tabela 2
HydrocortisoneStemCell Technologies07904Veja as Tabelas 1 e 2
Insulina, recombinante humana, solução de zincoTechnologies 12585014solução de 4 mg/mL; ver Tabela 2
Prato de fertilização in vitro de 4 poços,NUNC não tratado (via Fisher Scientific)12566350placa de 4 poços para esferoides; tamanho de poço semelhante a uma placa de 24 poços
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GFibroblastos embrionários murinos irradiados
Metamorfo 7.7DispositivosMolecularesSoftware de Análise; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para uma cotação
Microscópio invertido Olympus IX51descontinuadoOlympus Corporation. Substituição: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  para uma cotação
Pen StrepLife Technologies 15140122Consulte a Tabela 2
PhsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5GConsulte a Tabela 2
Ácido retinóicoSigma-AldrichR2625-50MGConsulte a Tabela 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905 Livro dede cureta nasal
5.53i, Intelligent Imaging Innovationsde imagem descontinuado. Substituição: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para uma cotação
Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Água EstérilSigma-AldrichW3500-6X500ML
Placa de cultura de tecidos 100Techno Plastic Products93100Placa de cultura de tecidos para expansão
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGVeja a Tabela 1
Transferrina (Transferrina Humana 0,5 mL)Lonza CC-4205Veja a Tabela 2
TriiodotrionineSigma-AldrichT6397-1G3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; Ver Tabela 2
Tripsina do Pâncreas SuínoSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (via Fisher Scientific)NC039302420 mL de pó lipofilizado; Consulte a Tabela 2
Cloridrato de vancomicina de Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GConsulte a Tabela 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Prepare uma solução-mãe de 1 mM de 0,4 mg em 1 mL de DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Adquira ou prepare uma solução-mãe de 10 mM de 4,5 mg em 1 mL de
dicloridrato de DMSO Y-27632  Inibidor de ROCK Enzo Ciências da Vida ALX-270-333-M025 Veja a Tabela 1
TP91015TP91050TP99010 Life Microscópio de imagem da slides Software

Referências

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