Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.
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Artigo de método
Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mutagénese aleatória de um gene alvo é comumente usado para identificar as mutações que produzem o fenótipo desejado. Dos métodos que podem ser usados para alcançar o mutagenesis aleatório, propenso a PCR é uma estratégia eficiente e conveniente para a geração de um pool diversificado de mutantes (i. e., uma biblioteca de mutante). Propenso a PCR é o método de escolha quando um pesquisador procura para transformar uma região pré-definidos, tais como a região da codificação de um gene, deixando outras regiões genômicas não afetado. Depois que a biblioteca mutante é amplificada por PCR propensa, isso deve ser clonado em um plasmídeo adequado. O tamanho da biblioteca gerada pelo PCR propensa é restringido pela eficiência da etapa de clonagem. No entanto, no fermento de fissão, Schizosaccharomyces pombe, passo a clonagem pode ser substituído pelo uso de uma fusão de uma etapa altamente eficiente do PCR para gerar construções para transformação. Mutantes de fenótipos desejados então podem ser selecionados usando repórteres apropriados. Aqui, descrevemos esta estratégia em detalhe, tomando como exemplo, um repórter inserido no heterocromatina centromérica.
Introdução
Genética para a frente é um método clássico em que pesquisadores buscam naturalmente mutantes que exibem um fenótipo específico e realizar análises genéticas. Em genética reversa, mutações são introduzidas em um gene de interesse e o fenótipo é examinado. Neste último caso, mutagênese aleatória de um gene alvo muitas vezes é usado para gerar um grupo de mutantes que posteriormente são selecionados para desejado fenótipos, tais como a sensibilidade à temperatura ou alterado a atividade enzimática. Podem ser utilizados vários métodos para alcançar o mutagenesis aleatório, incluindo propenso a PCR1; De irradiação UV2; mutag....
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Protocolo
1. preparação dos meios de comunicação
- Prepare extracto de levedura com suplementos (Sim), sim sem adenina (Sim Ade de Low), média de Pombe Glutamate (PMG12) e PMG sem adenina (PMG-Ade) misturando os componentes conforme descrito na tabela 1. Sim-Ade (Ade de baixo) e placas de PMG-Ade têm todos os mesmos componentes, mas a adenina é omitida do último.
- Usar o estoque de sal (50 x) a seguir: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2G/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2G/L at2para4 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e ....
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Resultados
Os mutantes Rpt4 adquiridos, seguindo os procedimentos descritos na Figura 1 podem ser analisados, avaliando as cores das colônias. As cores das colônias são vistas nas chapas de relevantes na diminuição do número de células na Figura 2. O repórter ade6 + inserido na região de heterocromatina é silenciado no selvagem-tipo e mostra vermelhas colônias em placa de Sim-Ade. Uma vez que a heterocromatina é desestabilizada e o.......
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Discussão
Mutagénese aleatória através de PCR propensa é uma ferramenta poderosa para gerar um pool diversificado de mutantes em uma determinada região. Esta técnica é especialmente útil para estudos que visam avaliar a função de uma proteína em uma circunstância específica. Por exemplo, usamos aqui PCR propensa para avaliar a função da subunidade de proteossomo 19S, Rpt4, em manutenção de heterocromatina. Variando a região alvo de PCR propensa e ajustando as condições de triagem, fomos capazes de transformar células na região gen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Financiamento apoio para este projeto foi fornecido pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (2016R1A2B2006354).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Mídia | |||
| Glucose | Extrato de levedura Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| BD Biosciences | 212720 | ||
| L-Leucina | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Sulfato de adenina | ACR | 16363-0250 | |
| Uracila | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidina | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Ftalato | de potássio Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4• 7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2• 4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Molibdato de sódio di-hidratado | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4• 5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-mio-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantotenato | YAKURI | 26003 | |
| Ácido Nicotínico | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticina | LPS | G41805 | |
| 2. Reações enzimáticas | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | Para mutagênese dirigida ao local |
| GeneMorphII Kit de mutagênese aleatória | Aglient | 200500 | Para PCR propenso a erros |
| Phusion DNA Polimerase de alta fidelidade | Thermo Fisher | F-530L | Para PCR de fusão |
| Ex Taq DNA Polimerase | Takara | RR001b | Para PCR geral |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipamento | |||
| Velveteen quadrado, preto | VWR | 89033-116 | Para réplica |
| Replica-chapeamento ferramenta | VWR | 25395-380 | Para réplica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | Para transformação de levedura de fissão |
| Cubetas de Eletroporação, 0,2 cm de folga | Biorad | 1652086 | Para transformação de levedura de fissão |
| Termociclador | Bioer | BYQ6078 | Para reação de rampa de PCR de fusão |
Referências
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
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Reimpressões e permissões
