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Artigo de método

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

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DOI:

10.3791/57499

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15 de maio de 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Resumo

Mutagénese aleatória de um gene alvo é comumente usado para identificar as mutações que produzem o fenótipo desejado. Dos métodos que podem ser usados para alcançar o mutagenesis aleatório, propenso a PCR é uma estratégia eficiente e conveniente para a geração de um pool diversificado de mutantes (i. e., uma biblioteca de mutante). Propenso a PCR é o método de escolha quando um pesquisador procura para transformar uma região pré-definidos, tais como a região da codificação de um gene, deixando outras regiões genômicas não afetado. Depois que a biblioteca mutante é amplificada por PCR propensa, isso deve ser clonado em um plasmídeo adequado. O tamanho da biblioteca gerada pelo PCR propensa é restringido pela eficiência da etapa de clonagem. No entanto, no fermento de fissão, Schizosaccharomyces pombe, passo a clonagem pode ser substituído pelo uso de uma fusão de uma etapa altamente eficiente do PCR para gerar construções para transformação. Mutantes de fenótipos desejados então podem ser selecionados usando repórteres apropriados. Aqui, descrevemos esta estratégia em detalhe, tomando como exemplo, um repórter inserido no heterocromatina centromérica.

Introdução

Genética para a frente é um método clássico em que pesquisadores buscam naturalmente mutantes que exibem um fenótipo específico e realizar análises genéticas. Em genética reversa, mutações são introduzidas em um gene de interesse e o fenótipo é examinado. Neste último caso, mutagênese aleatória de um gene alvo muitas vezes é usado para gerar um grupo de mutantes que posteriormente são selecionados para desejado fenótipos, tais como a sensibilidade à temperatura ou alterado a atividade enzimática. Podem ser utilizados vários métodos para alcançar o mutagenesis aleatório, incluindo propenso a PCR1; De irradiação UV2; mutagênicos químicos, tais como Metanossulfonato de etila (EMS) ou ácido nitroso3; o uso de cepas de modificador temporário, tais como aqueles excesso expressando mutD5 4; e DNA baralhar5.

Aqui, descrevemos uma estratégia reverso-genética em que utilizamos PCR propensa para gerar piscinas mutantes para um gene alvo no fermento a fissão. Como se pode adivinhar seu nome, este método gera mutações deliberadamente introduzindo erros durante a PCR. Ao contrário de outros métodos de mutagénese, propenso a PCR permite ao usuário definir a região a ser mutagenized. Isto o torna particularmente útil nos esforços para estudar a função de um domínio/proteína de interesse.

Para demonstrar este procedimento de mutagênese aleatória, aqui usamos o rpt4 +, que codifica a subunidade de proteossomo 19S, como exemplo. Rpt4 tem sido demonstrado que têm funções independente de proteólise em organismos que não sejam fissão fermento6,7,8,9, e um defeito na proteólise pode causar efeitos indiretos, alterando as proteínas níveis. Nós, portanto, selecionados para mutantes que desencadeou mudanças de proteólise-independente, com o objetivo de investigar a função da Proteassoma em heterocromatina.

Propenso a PCR pode ser aplicado a qualquer região do gene ajustando o local em que as primeiras demão vincular. Mutantes que apresentam a mudança fenotípica desejada podem ser identificados com repórteres apropriados. Aqui, utilizamos um repórter ade6 + inserido no Centrómero 1 exterior repetição (otr) região10. Heterocromatina constitutiva é formada nesta região11, então o repórter ade6 + é silenciado na condição de tipo selvagem; Isto é indicado por colônias vermelho10. Uma mutação que desestabiliza a heterocromatina constitutiva no Centrómero conduzirá à expressão do repórter ade6 + , que é visualizada como colônias brancas.

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Protocolo

1. preparação dos meios de comunicação

  1. Prepare extracto de levedura com suplementos (Sim), sim sem adenina (Sim Ade de Low), média de Pombe Glutamate (PMG12) e PMG sem adenina (PMG-Ade) misturando os componentes conforme descrito na tabela 1. Sim-Ade (Ade de baixo) e placas de PMG-Ade têm todos os mesmos componentes, mas a adenina é omitida do último.
    1. Usar o estoque de sal (50 x) a seguir: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2G/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2G/L at2para4 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.
    2. Use a seguinte vitamina (1, 000 x) estoque: pantotenato de 1 g/L, inositol 10 g/L, 10 g/L ácido nicotínico, biotina 10 mg/L em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.
    3. Use o seguinte mineral (10, 000 x) estoque: 5 g/L ácido bórico, 4G/L MnSO4, 4G/L ZnSO4·7H2O, 2G/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1G/L de KI, 0,4 g/L de CuSO4·5H2O , 10 g/L ácido cítrico em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm e armazenar a 4 ° C.
      Nota: Sim líquido de cobertura pode ser feito omitindo o ágar-ágar.
  2. Autoclave a médio e resfriá-lo para abaixo de 60 ° C, agitando com uma barra de agitação, à taxa de 200 rpm.
  3. Para placas de Sim + G418 (geneticin), adicione 1 mL/L G418 de solução para o meio de Sim.
    1. Use o seguinte G418 (1, 000 x) estoque: 100 mg/mL G418 em água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 µm, alíquota para tubos de centrífuga de 1,5 mL e loja a-20 ° C.
  4. Mexa por mais 5-10 min e alíquota da mídia em pratos de Petri-90mm (1L de alíquotas médias de aproximadamente 40 pratos de Petri. Armazenar as placas a 4 ° C.

2. clonagem de rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs

  1. Realizar PCR com primers p1 e p2 (figura 1A) usando fissão fermento DNA genômico (gDNA) como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x), e aplicando os ciclos de reação descritos na tabela 2 para amplificar uma 3.315-base fragmento de par (bp) compreendendo rpt4 + e seus 5' / 3' UTRs. Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação13 conforme indicado pelo fabricante (figura 1A).
  2. Digerir o pBlueScript KS(-) vector14 e o fragmento de DNA amplificado contendo rpt4 + com sua 5' / 3' UTRs com BamH1 e Xho1 em um volume total de 20 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, 1 tampão de digestão x) a 37 ° C em banho-maria para 16-18 h (figura 1B).
  3. Gel de purificar o vetor digerido (gel de agarose 1,2%) e DNA inserir pela realização de eletroforese em gel de agarose TAE-baseado (100 V, 1 h), extirpando as bandas de DNA dos tamanhos desejados e isolar o DNA com um gel de extração kit15.
  4. Ligam o vetor e inserção de DNA usando T4 DNA ligase realizando uma reação de ligadura de 20 µ l contendo 50-100 ng de DNA, vetor um ~ 3 vezes excesso molar de ligadura tampão 1x, 400 ligase do DNA de T4 U e o DNA de inserção. Incube a mistura a 18 ° C, durante 16-18 h.
  5. Transformar o DNA ligado em 100 µ l de e. coli DH5α aplicando choque térmico para 70 s a 42 ° C. Adicionar 1 mL de LB e incubar durante 1 h a 37 ° C, para a recuperação. Realizar a centrifugação (13.800 x g), descartar a sobrenadante, placa todos os transformado Escherichia coli células em placas LB-ampicilina (LA) e incubar a 37 ° C, durante 16 h.
  6. Escolha 4-8 colônias com palitos de dente e crescer durante a noite a 37 ° C, no meio de 3 mL de LA.
  7. Isolar o plasmídeo com um plasmídeo purificação kit16 usado de acordo com o protocolo do fabricante e executar analítica enzima de restrição digestões com 5 µ l do plasmídeo isolado, 5 U de cada enzima de restrição (BamH1 e Xho1) e 1 x buffer de restrição. Incube a mistura a 37 ° C em banho-maria por 3 h. confirmar a clonagem por sequenciamento plasmídeos de candidato.

3. introdução da mutação silenciosa (Xho1 Site de restrição)

  1. Desenha um par de primers 33-bp (p3 e p4) que contêm a mutação desejada na sequência de outra forma complementar.
  2. Realizar o PCR com alta fidelidade do polymerase17 (Figura 1) em um volume total de 25 µ l (10 ng de plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x) usar os ciclismo parâmetros listados na tabela 3.
  3. Digeri o plasmídeo de modelo com DpnI em um volume total de 20 µ l (20 U enzima, 1x tampão de digestão) a 37 ° C em uma água de banho para 1 h.
  4. Transformar, propagar, isolar e sequenciar o plasmídeo contendo a mutação silenciosa, conforme descrito nas etapas 2.5-2.7.
    Nota: A mutação silenciosa também pode ser introduzida usando um método de clonagem que permite a junção de vários fragmentos de DNA em uma única reação de18.

4. random Mutagenesis de rpt4 + pelo PCR propensa

  1. Realizar PCR propensa, usando o plasmídeo com a mutação silenciosa (Xho1 site) como o modelo de primeiras demão p5 e p6, um volume total de 50 µ l (a quantidade de modelo definido na etapa 4.1.1, 2 µ l de mistura de primeira demão 10 pmol, enzima de U 2.5, 1 amortecedor da reação x) , e uma polimerase especial que foi projetada para gerar um erro de alto taxa19 (Figura 1). Realize PCR conforme descrito na tabela 2.
    1. Use 4-5 µ g de plasmídeo de modelo para controlar a frequência de mutação para 1 bp/kb (quilobase).
      Nota: Uma alta concentração (> 500 ng / µ l) de plasmídeo, que pode ser obtido usando um prep mini kit20, é necessário.
  2. Use a electroforese do gel para confirmar um produto do PCR da bp 2670 (gel de agarose 1,2%). Gel de purificar este produto PCR conforme descrito na etapa 2.5.

5. preparação de fragmentos PCR de fusão (KAN, 3' UTR)

  1. Realizar PCR usando pFA6a-KANMX621 como o modelo, as primeiras demão p7 e p8, e as condições listadas na tabela 4 para obter o fragmento de marcador (KAN). Gel de purificar o fragmento resultante de 1.480-bp, conforme descrito na etapa 2.5 (Figura 1E).
    1. Verifique se o códon de parada do gene alvo de mutação e região codificante do gene sua adjacente são separados por mais de 500 bp. O terminador endógeno não pode ser utilizado quando esta região é inferior a 500 bp; em vez disso, o exterminador de ADH deve ser usado em vez do Exterminador do futuro endógena. As mudanças de protocolo necessárias para usar o terminador de ADH são apresentadas na tabela 5.
      Nota: Essas alterações só se aplicam quando o exterminador de ADH , que está disponível no plasmídeo pFA6a-3HA-KANMX6, é usado em vez do Exterminador do futuro endógena.
  2. Realizar PCR com o clonado rpt4 +-contendo o vetor como o modelo e as primeiras demão p9 e p10 em um volume total de 50 µ l (20 ng do plasmídeo clonado, 2 µ l de 10 pmol cartilha mix, enzima de U 2, tampão de reação 1x), usando as condições apresentadas na tabela 6. Gel de purificar obtidos 506-bp 3' UTR fragmento (Figura 1E).

6. geração de construção de transformação pela fusão do PCR (Figura 1E)

  1. Prepare os 3 fragmentos (mutagenized + rpt4, KAN e os 3' UTR) em 50 ng / µ l.
  2. Realize fusão que PCR dos três fragmentos usando as primeiras demão p11 e p12, conforme descrito na tabela 7. (O protocolo para fusão do PCR é uma modificação do protocolo original22). Purifica o principal produto do PCR 4.398-bp.
    1. Usar rpt4 +: KAN:3'UTR fragmentos na proporção de 1:3:1 para obter melhores resultados.
      Nota: A quantidade total de DNA da inserção não deve exceder 500 ng. A quantidade recomendada de rpt4 +: KAN:3'UTR é 50 ng:150 ng:50 ng. A região mutagenized é aproximadamente 1,6 kb, então o número mínimo de colônias de levedura que seriam responsáveis por todas as combinações possíveis de cada base, sendo uma mutação para os outros três é 1.600 x 3 = 4.800 colônias. Como uma reação de transformação normalmente produz colônias de 400-500, pelo menos 10 reações vale de fusão PCR construir é necessária. Esta necessidade pode ser satisfeita, simplesmente aumentando a quantidade de reação (isto é, o número de tubos PCR) por um fator de dez.

7. transformação de leveduras de fissão por eletroporação (Figura 1F)

  1. Inocule o fermento para 10 mL de meio de sim a saturação incubando-o por mais de 16 h.
  2. Diluir as células de uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,2 em 200 mL de meio de Sim e incubar a 30 ° C, com agitação por 5-6 h, a OD600 = 0.6 - 0.8.
  3. Concentre-se em células para OD600 = 30, dispense a quatro tubos de Erlenmeyer de 50 mL e relaxar no gelo por 10 min.
  4. As células da colheita, realizando a centrifugação a 1.050 x g por 3 min a 4 ° C. Coloque os tubos e 10 electro-cubetas no gelo. Execute as etapas 7.3-7,8 no gelo.
  5. Desprezar o sobrenadante e adicionar 15 mL de sorbitol de 1,2 M. Agite os tubos para Ressuspender as células.
  6. Centrifugar as células a 1050 x g, durante 3 min a 4 ° C.
  7. Repita os passos de 7.4 e 7.5. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 500 µ l de sorbitol 1,2 M para cada tubo, Ressuspender as células e coletar todas as células em um tubo cônico de 15 ml.
  8. Adicionar o sorbitol 1,2 M a 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Mantenha o tubo no gelo.
  9. Adicionar 200 µ l de células de sorbitol-suspenso (certifique-se que eles são totalmente suspensos) para um tubo novo EP contendo a fusão do PCR construir, misture bem e transferir a amostra para um electro-cubeta.
  10. Electroporate as células com as seguintes opções: fungos, ShS (2.00kV, 1 pulso).
  11. Adicionar 600 µ l de sorbitol 1,2 M para cada electro-cubeta para um volume total de 800 µ l e em seguida, espalhe as células em quatro placas Sim (200 µ l/placa). Electro-10 cubetas dispensará a 40 sim placas.
  12. Incube as placas a 30 ° C por 24 h.
  13. Executar o chapeamento de réplica para Sim + G418 e incubar as placas a 30 ° C durante 3 dias.

8. seleção de heterocromatina-desestabilizando mutantes e verificação de falsos positivos

  1. Para cada placa de Sim + G418, execute o chapeamento de réplica para Sim-Ade (Ade baixo) e placas de PMG-Ade (Ade n). Incube as placas réplica por 1-2 dias a 30 ° C, até algumas das colônias nas placas Sim-Ade mostram uma coloração vermelha (Figura 1).
  2. Compare placas Sim-Ade e PMG-Ade e selecione células que mostram rosa ou branco na placa sim-Ade e também crescem na placa PMG-Ade. Não selecione colônias sem crescimento na PMG-Ade, como eles são falsos positivos (por exemplo, refletindo que a gaveta de KAN foi integrada em um local não-alvo Noutras partes do genoma).
  3. Pegue aproximadamente 1 x 105 células de cada colônia e incubar em 10 µ l de solução SPZ contendo 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C durante pelo menos 30 min. utilizar 1 µ l desta solução para executar como o modelo inicial para colônia PCR (Figura 1 H).
    1. Fazer SPZ (50 mL) pela mistura de 30 mL de sorbitol 2m, 4,05 mL de 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 e 15 mL de água destilada (pH final, 7,5). Amostras (5 mL) podem ser suplementadas com zymolyase e armazenadas em alíquotas de 500 µ l a-20 ° C até o uso.
  4. Realize a eletroforese em gel (gel de agarose 1,2%, 180V, 20 min) para visualizar os resultados de + a PCR de colônia. Selecione as reações que apresentam bandas PCR de tamanho adequado e digerem 5 µ l de cada produto da reação com XhoI (4 enzima U, 1 tampão de digestão x, banho-maria a 37 ° C, 1 h) para filtrar falsos positivos (Figura 1 H).
  5. Realize a eletroforese em gel para visualizar os sumários de XhoI (gel de Agarose 1,2%, 180 V, 20 min). Marca as colônias cujos produtos PCR são cortados por XhoIe passe-os para Sim + G418 placas (Figura 1I).
  6. Isolar gDNA partir de células de levedura de fissão e realizar o sequenciamento da PCR produtos23. Compare a sequência obtida com sequência de tipo selvagem para identificar mutações (Figura 1I).
  7. Diretamente Re-Introduza o mutation(s) de células de tipo selvagem, transformando-os com construções de fusão amplificadas por PCR de células mutantes23. Use a mancha para confirmar o fenótipo nas células mutantes recém-feitos (Figura 1J).
    1. Construção de transformação de fusão pode ser facilmente amplificada por PCR com primers p1 e p10 usando o DNA genômico de mutantes como o modelo em um volume total de 50 µ l (~ 1 µ g DNA, enzima de U 20, tampão de reação 1x) e aplicando os ciclos de reação descritos no tabela 2 . Transformação da construção pode ser feita seguindo as etapas 7.1-7.13.

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Resultados

Os mutantes Rpt4 adquiridos, seguindo os procedimentos descritos na Figura 1 podem ser analisados, avaliando as cores das colônias. As cores das colônias são vistas nas chapas de relevantes na diminuição do número de células na Figura 2. O repórter ade6 + inserido na região de heterocromatina é silenciado no selvagem-tipo e mostra vermelhas colônias em placa de Sim-Ade. Uma vez que a heterocromatina é desestabilizada e o...

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Discussão

Mutagénese aleatória através de PCR propensa é uma ferramenta poderosa para gerar um pool diversificado de mutantes em uma determinada região. Esta técnica é especialmente útil para estudos que visam avaliar a função de uma proteína em uma circunstância específica. Por exemplo, usamos aqui PCR propensa para avaliar a função da subunidade de proteossomo 19S, Rpt4, em manutenção de heterocromatina. Variando a região alvo de PCR propensa e ajustando as condições de triagem, fomos capazes de transformar células na região gen...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Financiamento apoio para este projeto foi fornecido pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (2016R1A2B2006354).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1. Mídia
GlucoseExtrato de levedura Sigma-AldrichG8270-10KG
BD Biosciences212720
L-LeucinaJUNSEI87070-0310
Sulfato de adeninaACR16363-0250
Uracila Sigma-AldrichU0750
L-HistidinaSigma-AldrichH8125
KH2PO4Sigma-Aldrich1.05108.0050
NaClJUNSEI19015-0350
MgSO4• 7H2OSigma-Aldrich63140
CaCl2Sigma-Aldrich12095
Ftalatode potássio Sigma-AldrichP6758-500g
InositolSigma-AldrichI7508-50G
BiotinaSigma-AldrichB4501-100MG
Ácido bóricoSigma-AldrichB6768-1KG
MnSO4Sigma-AldrichM7634-500G
ZnSO4• 7H2O JUNSEI83060-031
FeCl2• 4H2OKANTOCB8943686
Molibdato de sódio di-hidratadoYAKURI31621
KIJUNSEI80090-0301
CuSO4• 5H2OYAKURI09605
D-mio-inositolMP biomedicals102052
PantotenatoYAKURI26003
Ácido NicotínicoSigma-AldrichN4126-500G
(NH4)2SO4 Sigma-AldrichA4418-100G
AgaroseBiobasicD0012
G418, geneticinaLPSG41805
2. Reações enzimáticas
PfuUltra II Fusion HS DNA PolymeraseAglient600380Para mutagênese dirigida ao local
GeneMorphII Kit de mutagênese aleatóriaAglient200500Para PCR propenso a erros
Phusion DNA Polimerase de alta fidelidadeThermo FisherF-530LPara PCR de fusão
Ex Taq  DNA PolimeraseTakaraRR001bPara PCR geral
BamH1New England BioLabsR0136S
Xho1New England BioLabsR0146S
Dpn1New England BioLabsR0176S
3. Equipamento
Velveteen quadrado, pretoVWR89033-116Para réplica
Replica-chapeamento ferramentaVWR25395-380Para réplica
MicroPulser ElectroporatorBiorad1652100 Para transformação de levedura de fissão
Cubetas de Eletroporação, 0,2 cm de folgaBiorad1652086 Para transformação de levedura de fissão
TermocicladorBioerBYQ6078Para reação de rampa de PCR de fusão

Referências

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  13. QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
  14. pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
  15. QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
  16. QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
  17. PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
  18. Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
  19. GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
  20. Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
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