Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.
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Artigo de método
Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar de numerosos estudos que tentam desenvolver modelos animais confiáveis que refletir o primário processa neurodegeneração subjacente, muito poucos foram amplamente aceites. Aqui, propomos um novo procedimento adaptado de conhecidos ex vivo cérebro fatia técnica, que oferece um mais perto na vivo-como cenário do que em vitro preparações para investigar os eventos iniciais provocando degeneração celular, como observada na doença de Alzheimer (AD). Esta variação consiste em etapas simples e facilmente reproduzíveis, que permitem a preservação do cytoarchitecture anatômica da região selecionada do cérebro e sua funcionalidade local em um ambiente fisiológico. Diferentes áreas anatômicas podem ser obtidas o mesmo cérebro, proporcionando a oportunidade de realizar várias experiências com os tratamentos em questão em um local-, dose e tempo-dependente. Limitações potenciais que poderiam afetar os resultados relacionados com esta metodologia estão relacionadas com a conservação do tecido, ou seja, a manutenção da sua integridade anatômica durante as etapas de corte e a incubação e a espessura de corte, que pode influenciar a análise bioquímica e imuno-histoquímica. Esta abordagem pode ser utilizada para diferentes fins, tais como explorar mecanismos moleculares envolvidos em condições fisiológicas ou patológicas, triagem de drogas ou ensaios de dose-resposta. Finalmente, este protocolo também poderia reduzir o número de animais utilizados em estudos comportamentais. O aplicativo aqui relatado foi recentemente descrito e testado pela primeira vez na ex vivo fatias cérebro rato contendo o prosencéfalo basal (BF), que é uma das regiões cerebrais afetadas principalmente no AD. Especificamente, foi demonstrado que a administração de um peptídeo tóxico derivado do C-terminal da acetilcolinesterase (AChE) poderia solicitar um AD-como o perfil, provocando, ao longo do eixo antero-posterior do BF, uma expressão diferencial de proteínas alteradas na AD, como o receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).
Introdução
AD é que uma patologia crônica caracterizada por imparidade neurodegenerativa progressiva, afetando áreas diferentes do cérebro, tais como o córtex entorhinal (CE), BF, hipocampo (HC) e bulbo olfatório (OB)1,2,3, 4,5. Estágios finais de desenvolvimento AD conduzem a um progressivo declínio cognitivo, tornando esta doença, a forma mais comum de demência, representando aproximadamente 70% de todos os casos6. Apesar das tentativas extensas para entender os estágios iniciais, causando A....
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Protocolo
Todos os estudos em animais foram realizados sob protocolos aprovados.
Nota: Nesta seção, a sequência das principais fases executadas durante o procedimento experimental e o intervalo de tempo sugerido é fornecido (Figura 1). Além disso, uma descrição passo a passo do protocolo é complementada por um painel ilustrativo, mostrando ações críticas que variam de remoção do cérebro a homogeneização do tecido após o período de incubação (Figura 2). Os detalhes sobre os materiais e instruções para construir o aparelho e a fase subsequente para a análise de WB são descritas anteriormente
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Resultados
O protocolo aqui apresentado indica que a administração de um peptídeo tóxico, T30, modula de forma local-dependente da expressão do nAChR, α7-p-Tau e Aβ nas seções contendo BF (Figura 3A). O receptor nicotínico mostra um aumento significativo no hemislice rostral-tratados, comparado ao seu homólogo de controle (fatia 1, p = 0.0310) (Figura 3B), enquanto a fatia intermediária não revela qualquer alteração entre o (duas c.......
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Discussão
O principal aspecto do presente protocolo, baseado na técnica cérebro bem-estabelecida ex vivo , permite testar sincronicamente duas hemislices especulares, obtidas no mesmo plano anatômico, monitorando sua resposta após a aplicação de um determinado condição (controlar ou tratados); Este, portanto, oferece uma paradigma experimental tão rigidamente controlada quanto possível. A possibilidade de avaliar em um tempo - dose- e site-specific maneira diferente neuroquímicos relacionados com comprometimento neuronal,.......
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Divulgações
Os autores declaram concorrentes interesses financeiros. Susan A. Greenfield é o fundador e presidente da Neuro-Bio Limited, uma empresa canadense e detém ações da empresa. Emanuele Brai e Antonella Cogoni são empregados da Neuro-Bio Ltd.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Neuro-Bio Ltd. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) para seus comentários e conselhos sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich, Alemanha | S7653 | Reagente para preparação de aCSF |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich, Alemanha | P9333 | Reagente para preparação de aCSF |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Alemanha | S5761 | Reagente para preparação de aCSF |
| Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Alemanha | 63138 | Reagente para preparação de aCSF |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Alemanha | P5655 | Reagente para preparação de aCSF |
| Sal de hepes | Sigma-Aldrich, Alemanha | H7006 | Reagente para preparação de aCSF |
| Ácido de hepese | Sigma-Aldrich, Alemanha | H3375 | Reagente para preparação de aCSF |
| Glicose | Sigma-Aldrich, Alemanha | G7528 | Reagente para preparação de aCSF |
| Cloreto de cálcio desidratado | Sigma-Aldrich, Alemanha | 223506 | Reagente para preparação de aCSF |
| Peptídeo T30 | Genosphere Biotechnologies, França | Peptídeo derivado de AChE testado | |
| Kit de dissecação cirúrgica | World Precision Instruments, EUA | Item #: MOUSEKIT | Etapa de remoção do cérebro |
| Lâminas cirúrgicas | Swann-Morton, Reino Unido | BS 2982 | Etapa de remoção do cérebro |
| Papel de filtro | Fisher Scientific, EUA | 11566873 | Preparação do cérebro para fatiar |
| Cola | Preparação do cérebro para fatiar | ||
| Vibratome | Leica, Alemanha | VT1000 S | Escovas |
| Manuseio de tecidos | |||
| Recipiente | de oxigênioFase de seccionamento e incubação | ||
| 1x Tampão fosfato salino (PBS) | Fisher Scientific, EUA | BP2438-4 | Etapa de homogeneização |
| Inibidores de fosfatase | Fisher Scientific, EUA | 1284-1650 | Etapa de homogeneização |
| Inibidores de protease | Roche complete PIC, EUA | 4693116001 | Etapa de homogeneização |
| Pilões | Starlab, Reino Unido | I1415-5390 | Etapa de homogeneização |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, EUA | 22660 | Concentração de proteína |
Referências
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's diseas....
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Reimpressões e permissões
