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Artigo de método

Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

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DOI:

10.3791/57516

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25 de abril de 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

Neste artigo

Resumo

Desthiobiotin rotulagem de um sintético 25-nucleotide oligo de RNA, que contém um motivo de adenina-rico elemento (são), permite a ligação específica da proteína de ligação são citosólica.

Resumo

O em vitro RNA-pulldown é ainda amplamente usado nos primeiros passos de protocolos que visam identificar RNA-proteínas que reconhecem estruturas de RNA e motivos específicos. Neste protocolo de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente são rotuladas com uma forma modificada de biotina, desthiobiotin, no terminal 3' da strand, RNA, que se liga reversivelmente para streptavidin e permite assim a eluição das proteínas sob mais fisiológica condições. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar a interação entre proteínas de ligação de RNA conhecidas e uma 25-nucleotide (nt) longo RNA sonda contendo uma sequência de interesse. Isso é útil para completar a caracterização funcional de estabilização ou desestabilizar os elementos presentes em moléculas de RNA alcançadas usando um ensaio de vetor de repórter.

Introdução

Expressão gênica e o nível final do produto do gene podem ser fortemente regulamentados por afetar a estabilidade do mRNA e o mRNA tradução taxa1. Estes mecanismos de regulação pós-transcricional são exercidos através de interações de não-codificantes do RNA e/ou ligação de RNA proteínas (RBPs) com mRNA alvo. Geralmente é a região untranslated 3' do mRNA (3' UTR - pertencentes à porção não-codificantes do genoma2) que contém específica cis-elementos reguladores (CRE), que são reconhecidos pelo trans-agindo fatores como miRNA ou RBPs 3. o mais bem estudadas cis-elemento dentro do 3' UTR, é motivo de adenina-rico elemento (são), que é reconhecido por proteínas específicas de AU-ligação (AUBP) e, por sua vez, induz qualquer degradação do mRNA/deadenylation (decaimento são-mediada) ou de estabilização do mRNA4.

O tamanho da 3' UTR de desnutridos mRNA (CALB2) é 573 bp longa e contém um pentâmero AUUUA putativo, como previsto pelos AREsite2, uma ferramenta de bioinformatic5. Consistente com a presença de um putativo são motivo, o ensaio de vetor-repórter pmirGLO demonstrado um papel de estabilização deste elemento dentro do mRNA CALB26. Finalmente, o em vitro RNA-pulldown foi usado para identificar a AUBP que estabiliza desnutridos mRNA através do motivo de são.

Desde que todos os RNAs não codificantes interagirem com proteínas7, o em vitro RNA-pulldown é um ensaio de primeira escolha para a identificação de RNA-interactianos e boa maneira para ajudar a decifrar os mecanismos moleculares. Neste método de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente, que foram rotuladas com uma forma modificada de biotina (desthiobiotin) no terminal 3' da strand, RNA, foram usadas. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o limite-RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. Essas proteínas RNA-limite são eluídas dos grânulos magnéticos, executado através de um gel de SDS-PAGE 12%, transferido para uma membrana e sondado com anticorpos diferentes.

O procedimento de purificação padrão estreptavidina-biotina afinidade, dura desnaturação requeridas para romper o vínculo forte irreversível biotina-streptavidin para Eluir o limite proteínas8, que pode levar a dissociação de complexos de proteínas. Ao contrário de biotina, desthiobiotin reversível vincula streptavidin e competitivos é deslocada com uma solução tamponada de biotina, permitindo a eluição suave de proteínas e evitando o isolamento de naturalmente biotinilado moléculas9, sugerindo que a técnica é ideal para isolar os complexos da proteína nativa sob condições nativas.

In vitro as condições de vinculação e o rigor, que são determinados pela concentração de sal, agentes redutores e porcentagem de detergente, devem ser próximo aos presentes no contexto celular a fim de identificar interações de verdade na vivo . As condições de ligação implementadas neste documento foram anteriormente demonstradas conforme apropriado para a identificação da HuR como uma proteína ligadora AU10. Esta abordagem poderia poupar tempo, desde que a otimização das condições de vinculação adequada pode ser demorada e desafiador. Além disso, esse método poderia ser usado como um protocolo de partida para qualquer experiência de RNA-pulldown e pode ser otimizado progressivamente alterando a concentração de sais e detergentes, mudando a porcentagem de glicerol, e adicionando outros sais. Além disso, demonstrar que mesmo uma curta 25-nucleotídeo do RNA-sonda abrigando um pentâmero são-motivo poderia ser usado para demonstrar a interação com um específico AUBP.

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Protocolo

1. preparação da fração de proteína citosólica e Nuclear

  1. Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células num balão de cultura de célula T150 cultivadas em RPMI - 1640 meio suplementado com 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) e 2 mM L-glutamina (200 mM). Quando as células alcançam uma confluência de 80-90% (~5-5.5 x 106 células), prosseguir com a extração da proteína da fração nuclear e citosólica.
    Nota: ACC-MESO-4 linha de celular foi obtida o RIKEN BioResource centro11.
  2. Aspire médio, lavar as células adicionando-se 15 mL de 1X PBS, incline a placa suavemente algumas vezes e aspire a PBS 1x. Adicionar 3 mL de 0,25% Trypsin-EDTA e incubar o frasco de cultura a 37 ° C por 3 min.
    Nota: Veja as células sob o microscópio para destacamento; se ainda ligado a torneira o frasco contra a palma de sua mão 3 vezes.
  3. Adicionar 7 mL de RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100 x) e L-glutamina (200 mM) de 2 mM, coletar as células em um tubo de 15 mL e spin para baixo a 200 x g por 5 min.
  4. Médio, Aspire e resuspenda o pellet de células com 1,5 mL de 1X PBS e, em seguida, transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Spin para baixo a x 500 g e a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante.
    Nota: A partir deste passo em diante, executar todas as etapas de centrifugação a 4 ° C e manter todos os reagentes no gelo.
  5. Ressuspender as células com gelada 1,5 mL de 1X PBS e spin-down as células a x 500 g e a 4 ° C por 3 min. descartar o sobrenadante.
    Nota: As quantidades necessárias de CER I, II CER e reagentes NER são 10, 0,55 e 5 volumes de centrifugado estimado embalado volume, respectivamente; o protocolo seguinte assume um volume de 20 µ l. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente CER eu.
  6. Adicionar 200 µ l de reagente de extração citoplasmática gelada (CER eu) suplementado com 2 µ l de 1x do inibidor da protease, por exemplo, diluir 1 comprimido de inibidor de Protease (EDTA-livre) em 500 µ l de água para obter 100 ações de x. Esta quantidade de reagente CER chega a lyse 20 µ l de uma pelota de célula embalado volume.
    1. Para estimar o volume de sedimento embalado de célula, compare o tubo contendo o centrifugado com um tubo de 1,5 mL cheio com 10, 20, 50 ou 100 µ l de PBS 1x.
  7. Resuspenda o pellet de células por vigorosamente num Vortex o tubo por 15 s e incubar o tubo no gelo por 10 min. Adicionar 11 µ l de reagente de extração citoplasmática gelada II (II CER) para o tubo, vórtice vigorosamente por 5 s e incubar 1 min no gelo.
  8. Vórtice vigorosamente durante 5 s e centrifugar o tubo a 16.000 x g e 4 ° C por 5 min. Transfira o sobrenadante no tubo limpo previamente refrigerados no gelo. O sobrenadante é a fração citoplasmática que é mais usado no experimento de RNA-pulldown.
  9. Ressuspender o restante em 100 µ l de reagente de extração nuclear gelada (NER) suplementado com 1 µ l de inibidor de proteinase (100x) e vigorosamente vórtice por 15 s. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente NER suplementado com inibidores de protease.
  10. Incubar a amostra no gelo por 40 min com ocasional num Vortex por 15 s (a cada 10 min).
  11. Centrifugar o tubo a 16.000 x g durante 10 min. transferência do sobrenadante (isto é a fração de proteína nuclear) para um tubo limpo previamente refrigerado.
  12. Proceder imediatamente por medir a concentração de proteína usando o método bicinchoninic (BCA) (ver Tabela de materiais). Para controlar a pureza da proteína de cada fração, execute immunoblotting (Figura 1) contra a α-tubulina (detecção positivos somente na fração citosólica) e poli ADP-ribose polimerase - PARP (detecção positivos somente na fração nuclear). Para visualização de proteína, consulte a seção 4.
  13. A fim de manter a atividade de proteína e seu estado nativo, prepare 25 µ l de alíquotas dos extratos citosólico e nucleares. Snap-congelar essas alíquotas, colocando-os em nitrogênio líquido para 5 s e loja diretamente a-80 ° C.

2. rotulagem do RNA com Desthiobiotin

  1. Sondas de RNA sintetizado comercialmente e HPLC purificado. Resuspenda com água livre de nuclease a 10 µM.
    Nota: Sonda sequências estão listadas na tabela 1.
  2. Use 50 pmol de RNA por reação de RNA-pulldown. Descongelar e manter todos os reagentes no gelo exceto para PEG-30%, usado para rótulo 3' terminus de RNA oligo.
  3. Transferência de 5 µ l de 10 sondas de RNA µM, rotulado como CALB2 3' UTR (são), CALB2 3' UTR (mtARE) e independentes-RNA (IRE), em 0,5 mL microcentrifuga de parede fina tubos e incubá-los em uma máquina PCR a 85 ° C por 5 min. Coloque os tubos imediatamente no gelo.
    Nota: Este passo é importante, como promove o relaxamento e a acessibilidade da sonda para a rotulagem do RNA.
  4. Para uma única reação de 30 µ l, adicionar ao tubo de RNA, contendo a mistura de 10 µ l a seguir: 3 µ l de água livre de nuclease, 3 µ l de RNA Ligase Buffer de reação, 1 µ l de RNase inibidor de 10x (40 U / µ l), 1 µ l de Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 2 µ l de RNA T4 ligase do (20 U / µ l).
    Nota: Para preparar A mistura de mestre 3 amostras em excesso (3.2), misturar 9,6 µ l de nuclease água livre, 9,6 µ l de RNA Ligase Buffer de reação, 3,2 µ l de RNase inibidor de 10x (40 U / µ l), 3,2 µ l de Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 6.4 µ l de RNA T4 ligase do (20 U / µ l).
  5. Adicione cuidadosamente 15 µ l de PEG-30% para a reação. Use outra dica de misturar a reação. Incubar a reação durante a noite a 16 ° C.
  6. No dia seguinte, prepare-se o seguinte: 5 M NaCl (fresco/nuclease-free), clorofórmio: álcool isoamílico na proporção 24:1 (por exemplo, por reação - 96 µ l clorofórmio e 4 µ l de álcool isoamílico), gelada 100% de etanol e gelada 70% de etanol.
  7. Adicione 70 µ l de água livre de nuclease aos tubos de reação de RNA-rotulagem. Adicione 100 µ l de clorofórmio: isoamílico álcool e vórtice brevemente. Desativação da rotação a 13.000 x g por 3 min. retire apenas a fase superior e transferência para um novo tubo isento de nuclease 1,5 mL; Evite tocar a fase inferior.
  8. Adicione 10 µ l de NaCl 5m, 1 µ l de glicogênio e 300 µ l de etanol gelado a 100%. Coloca o tubo a-20 ° C durante 2 h.
    Nota: Neste passo, o experimento pode ser continuado no dia seguinte.
  9. Cuidadosamente, centrifugar 13.000 x g e 4 ° C por 15 min. desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Adicione 300 µ l de etanol a 70% gelado e centrifugar novamente a 13.000 x g e 4 ° C por 5 min.
  10. Descartar o sobrenadante completamente e deixe secar naturalmente a pelota (15 min). Resuspenda o pellet em 20 µ l de água livre de nuclease.
    Nota: Proceda com RNA-pulldown no mesmo dia.
  11. Incubar o RNA a 90 ° C por 2 min e colocar no gelo. Coloque o RNA rotulados no gelo durante a etapa seguinte de pre-lavagem dos grânulos magnético estreptavidina.
    Nota: Um tempo de incubação pode danificar a sonda de RNA.

3. RNA-proteína Pulldown

  1. Pré-lavagem grânulos streptavidin-magnético e incubação com desthiobiotin-RNA
    1. Use 50 µ l de estreptavidina grânulos magnético por 50 pmol de RNA. No entanto, isto deve ser otimizado dependendo do experimento.
    2. Vórtice com grânulos streptavidin-magnético para 15 s e rapidamente remover 200 µ l (mestre mistura; suficiente para reações de 3 + 1) em um limpa 1,5 mL tubo cofre-bloqueio usando o tubo de corte pontas de pipetas. Coloque o tubo num suporte magnético para que os grânulos recolher ao lado do tubo e esperem 1 min. Retire o líquido de ressuspensão.
    3. Lave os grânulos, remover o tubo do suporte magnético, adicione 400 µ l de NaOH 0,1 M, 0,05 M NaCl solução e suavemente pipeta subindo e descendo várias vezes. Coloque o tubo de volta a depor magnético. Espere 1 minuto e recolher o sobrenadante. Repita este passo novamente.
    4. Lave os grânulos com 200 µ l de 100 mM de NaCl. Remova o sobrenadante.
    5. Adicione 200 µ l de 20 mM Tris (pH 7,5), resuspenda grânulos pipetando, colocar o tubo no stand magnético, esperar 1 min e remover o sobrenadante. Repita a etapa.
    6. Retire o tubo do suporte magnético, adicionar 200 µ l de buffer de captura do RNA de 1x e ressuspender streptavidin grânulos magnético vortexing brevemente. Remover 50 µ l de grânulos magnético streptavidin e adicionar a cada tubo rotulado-RNA usando uma ponta de pipeta de corte. Incube os tubos por 30 min à temperatura ambiente em um rolo.
  2. Ligação de proteínas de RNA
    1. Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e retirar o sobrenadante.
    2. Adicionar 50 µ l de 20 mM Tris (pH 7,5) para as contas e ressuspender pipetando. Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e retirar o sobrenadante. Repita este passo.
    3. Adicionar 100 µ l de tampão de ligação proteína-RNA 1x aos talões e ressuspender pipetando.
    4. Entretanto, prepare a seguinte mistura: 10 µ l de 10x buffer de ligação proteína-RNA, 30 µ l de glicerol a 50%, 50 µ g de proteínas citoplasmáticas e livre de nuclease até 100 µ l de água.
      Nota: Preparar mistura mestre B para 3 amostras em excesso (3.3) da seguinte forma: 33 µ l de 10x buffer de ligação proteína-RNA, 99 µ l de glicerol a 50%, 165 µ g de proteínas citoplasmáticas e água livre de nuclease até 330 µ l. Mantenha o tubo de mistura mestre B no gelo.
    5. Coloque os tubos no suporte magnético, espere 1 minuto e recolher o sobrenadante. Adicionar 100 µ l do mix master B, resuspenda suavemente pipetando acima e para baixo e evitar a criação de bolhas. Incube os tubos de reação para 60 min a 4 ° C em um rolo.
  3. Lavagem e eluição
    1. Coloque os tubos em um carrinho magnético, recolher o sobrenadante (que é o fluxo através de - FT) e transferir para um tubo novo.
      Nota: Mantenha esta FT no gelo para análise posterior.
    2. Pipetar 100 µ l de 1x tampão de lavagem sobre os grânulos, Ressuspender delicadamente, colocar de volta no carrinho magnético, esperar 1 min e descartar o sobrenadante. Repita essa etapa 2 vezes.
    3. Adicionar 40 µ l de tampão de eluição para as esferas magnéticas, misturar pipetando para cima e para baixo e incubar a 37 ° C num agitador de tubo (950 rpm) por 30 min.
    4. Coloque os tubos em um carrinho magnético, esperar 1 min e coletar amostra de eluted (que é eluído - E). Coloque no gelo e usar para análise a jusante.
      Nota: Neste passo, cada sonda RNA testada consiste em uma passagem (FT) e amostra de eluato (E).

4. análise do borrão ocidental e eletroforese em poliacrilamida

Nota: Ver tabela 2 receitas para os buffers usados nesta seção. Realizar um Western blot de acordo com o método de Laemmli12.

  1. Handcast 12% geles de SDS-PAGE (10-poços, espaçador de 1,5 mm, 66 µ l). Preparar uma mistura de gel de execução: 4 mL de solução 30% do acrilamido-bisacrylamide, 2,4 mL de Tris inferior do buffer, 3,2 mL de dH2O, 9,6 µ l de TEMED, 96 µ l da solução de persulfato de amónio de 10% (APS). Preparar a mistura de gel de empilhamento: 3,25 mL de dH2O, 0,5 mL de acrilamida 30% - solução bisacrylamide, 1,3 mL de tampão Tris superior, 10 µ l de TEMED, 20 µ l de 10% APS.
  2. Adicione 16,6 µ l de tampão de x Laemmli 6 (por exemplo, 14 mL de pH Tris/HCl/SDS 6,8 (tampão Tris superior), 2 g de SDS, 1,86 g de TDT, 6 mL de glicerol e 0,012% bromofenol; armazenado a-20 ° C) para a amostra FT e 6.6 µ l de buffer de x Laemmli 6 em amostra E. Incubar as amostras durante 5 min à 95 ° C.
  3. Carregar as amostras (20 µ l de FT e toda a eluir ~ 40 µ l) e executá-los por 30 min a 60 V, continuando com 20 V durante a noite.
  4. Usando um sistema eletroblotting semi-seco, transferência de proteínas para uma membrana PVDF para 80 min em 15 V.
    Nota: A membrana PVDF deve ser ativada antes de executar a transferência de proteína. Incube a membrana em metanol 100% por 1 min, seguido de uma incubação de 2 min em água ultrapura.
  5. Após a transferência da proteína, incube o gel de SDS-PAGE com Coomassie solução para 3 h, seguido por três etapas de lavagem com água ultrapura, a cada 30 min.
  6. No final da transferência de proteína, deixe-a membrana PVDF secar por 1 h. reativar a membrana como indicado no ponto 4.5. Bloquear a membrana 1 h com 5% BSA em 1 x TTBS.
  7. Incubar a membrana com o primeiro anticorpo: HuR ou mesothelin, ambos diluído 1: 1000 em 5% BSA em 1 x TTBS por 4 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  8. Lavar a membrana três vezes por 7 min em 1 x TTBS e incubar com peroxidase de coelho anti-rato rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado diluído 1:10,000 em 5% BSA, 1 x TTBS.
  9. Visualize as proteínas utilizando quimioluminescência aprimorada e um sistema de imagem digital.

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Resultados

Neste experimento, utilizou-se um fragmento de tempo 25-nt de desnutridos 3' UTR abrigando são motivo (CALB2) 3' UTR (são) 25-nt para testar se liga-se especificamente à proteína antígeno humano-R (HuR), um conhecido estabilizador de mRNA. Para testar a especificidade do elemento são, um RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contendo uma mutação são-motivo, que anteriormente foi mostrada para abolir o efeito de estabilização do motivo são, foi usado6. O RNA terceiro...

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Discussão

3' UTRs pertencem ao não-codificantes do genoma3, e todos os RNAs não codificantes podem interagir com as proteínas a fim de exercer sua função7. Quando o genoma de mamíferos foi encontrado para ser comodamente transcrito e produzido uma parcela significativa de tempo não-codificante RNAs16, emergentes evidências demonstraram que estes RNAs long-não-codificante função na regulação da expressão gênica como eles interagem com cromatina-remodelação comp...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation Sinergia concessão CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NE-PER Kit de extração nuclear e citoplasmáticaThermo Fisher Scientific 78833
Comprimidos Inibidores de Protease Pierce, sem EDTAThermo Fisher ScientificA32965
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Thermo Fisher Scientific20164Inclui contas magnéticas e, portanto, o kit precisa ser armazenado a 4 &graus; C
Perfurar RNA 3' Kit de Destiobiotinilação FimThermo Fisher Scientific20163O kit faz parte do "Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce", e precisa ser armazenado a -20 &graus; C ao contrário do kit pull-down (4 ° C).
Suporte magnético DynaMag-2, Thermo Fisher
Scientific-Oanticorpo está incluído no Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce  - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-rato coelho 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - α - tubulina (MOUSE) anticorpo monoclonalSanta Cruz80351:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-camundongo coelho 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (COELHO) Anticorpo policlonalSinalização Celular95421:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-coelho de cabra 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesotelina (MOUSE) Anticorpo Monoclonal Rockland200-301-A87
Anticorpo secundário anti-coelho para cabrasSinalização Celular7074
Anticorpo secundário anti-rato para coelhosSigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 mediumSigma-AldrichR8758
FBS - Soro Bovino FiltradoPan Biotech P40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)Sigma-Aldrich P4333
Solução de L-Glutamina (200 mM)Sigma-Aldrich G7513
0.25% Tripsina-EDTA (1x)Gibco da Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3 CellBio-Rad1653301
Mini Protean System Placas de Vidro PlacasBio-Rad 1653308
Mini-PROTEAN com espaçador integrado de 1,5 mmMini-PROTEAN 1653312Bio-Rad
, 10 poços, 1,5 mm, 66 µ LBio-Rad1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting ModulesBio-Rad1658050
RNaseZap Solução de Descontaminação RNaseThermo Fisher ScientificAM9780
Rotiphorese gel 30 - solução estoque aquosa de 30% de acrilamida e bisacrilamida na proporção de 37.5:1Roth3029
20% SDS PanReac AppliChemA3942
PVDF Perkin ElmerNEF1002Precisa ser ativado incubando em metanol puro por 1 min seguido de lavagem em água por 2 min 
Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SDBio-Rad1703940
Clareza Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
FusionFX  Imager DigitalVilber-RNA
oligo synthesisMycrosynth AG,Suíça-aescala de síntese - 0.04 µ mol - Albumina
de soro bovinoSigma-AldrichA7030
Ácido clorídrico (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific15567027
Glicerol Thermo Fisher Scientific17904Alíquotas 50% estéreis para serem armazenadas a -20° C
Pierce Streptavidin contas magnéticas Thermo Fisher Scientific88817Por favor, note que estas contas magnéticas têm um diâmetro médio de 1 µ m (intervalo de 0,5 - 1,5 µ m). Além disso, Dynabeads-M280 Streptavidin, que são grânulos de tamanho homogêneo 2,8 µ m, também são usados no pulldown de RNA, mas esteja ciente de que isso pode afetar o processo de purificação.
TEMEDSigma-AldrichT9281
Persulfato de amônio Sigma-AldrichA3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate Sigma-Aldrich368458
ácido ortofosfórico AplicativoA0637
Anticorpo monoclonal Anti-HuR (MOUSE) Anti-HuR da Espaçadoras Pente Membrana de transferência purificada por HPLC

Referências

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  2. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
  3. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
  4. von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
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