Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Recentes avanços tecnológicos têm radicalmente transformada e acelerou a capacidade de genomas de engenheiro precisamente. Em particular, o sistema CRISPR-Cas9, que depende da endonuclease guiada por RNA Cas9 para induzir uma pausa de fita dupla (DSB) perto da sequência alvo do interesse, tem sido extensivamente usado para engenheiro com precisão o genoma da maioria dos organismos modelo usados no investigação biomédica^1,2,3,4. Significativamente, o uso de CRISPR-Cas9 destravou genoma edição mesmo em espécies de difícil como c. elegans⁵. Independentemente da espécie, gerar mutações pontuais com o genoma de CRISPR-Cas9 baseado editando o sistema se baseia em três componentes principais: 1) Cas9 endonuclease, 2) um guia único RNA (sgRNA) que direciona a endonuclease Cas9 para uma sequência do alvo e 3) um usuário projetado modelo de reparação de homologia-dirigido (HDR) contendo o desejado edit(s) de juros².

Existem vários métodos que podem ser usados para introduzir o direcionamento sgRNA e Cas9 nuclease em células incluindo plasmídeo, RNA e de métodos de entrega baseada em viral⁶. Recentemente, entrega direta de ribonucleoproteínas sgRNA pre-complexado-Cas9 (RNPs) surgiu como uma ferramenta poderosa e eficiente no genoma baseados em CRISPR-Cas9 edição⁷. A entrega direta de pre-complexado CRISPR-Cas9 RNPs tem várias vantagens distintas, a saber: 1) RNPs ignorar a necessidade de transcrição celular e tradução, 2) RNPs são limpas rapidamente, que pode aumentar a especificidade, reduzindo o tempo disponível para o alvo clivagem e 3) RNPs contêm elementos de DNA/RNA não estrangeiros que contorna a introdução de sequências não-nativas no genoma hospedeiro através da integração aleatória. Juntos, esses atributos prováveis fornecem uma rajada curta duração de edição de CRISPR no alvo, minimizando os efeitos fora do alvo.

Descreveremos um protocolo simples e eficiente para a introdução de alterações genômicas site-specific em c. elegans. Este protocolo inclui a segmentação sgRNA design de modelo HDR único encalhado do oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 complexantes de RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem para a identificação inequívoca dos animais devidamente editados. Usando essa estratégia, não só as alterações desejadas e site-specific podem ser recuperadas, mas outras mutações indel inespecíficos também podem ser recuperadas. Assim, nossa estratégia permite a geração de uma série alélica usando uma estratégia simples, onde ambos mono-alélica, bi-alélica e indel mutantes podem ser gerados na geração₁ F.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais seguiram a diretriz do National Institutes of Health e cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Michigan. Usar soluções livre de RNase e pipetar dicas em todo o protocolo. Limpe a área de trabalho, pipetas, tubos e centrífuga com solução de RNase descontaminação seguindo as orientações do fabricante (ver Tabela de materiais).

1. sgRNA seleção de alvo

1. Usando um navegador da web, abra a página da Web: http://crispor.tefor.net⁸
   1. ~ 60 pares de bases (bp) da sequência flanqueando a edição desejada de interesse de entrada (ou seja, 30 bp 5' e 3' da edição desejada).
   2. Selecione o genoma elegans de Caenorhabditis no menu pulldown.
   3. Selecione o motivo de Protospacer adjacentes (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) no menu suspenso.
   4. Clique em enviar. Na página de resultados, escolha a sequência de top ranking destino mais próxima para a edição de interesse. Se não há alvo apropriado sites dentro de flanqueamento 60 bp sequência de entrada, expandir a sequência de consulta até 100 bp (ou seja, 50 bp ambos os lados do desejado editar).
2. De uma fonte disponível, por exemplo, synthego, obter um 20-mer alvo sgRNA com as seguintes especificações: 3 nmol; sem modificações.
3. Após a recepção, centrifugue sgRNA liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 60 µ l de TE nuclease-livre para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200. A concentração final é 50 µM.

2. homologia-dirigido reparação Template Design

1. Desenha um HDR ssODN modelo que contém: 1) a mutação de interesse, 2) um site exclusivo em-frame endonuclease de restrição, 3) uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência de NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços flanqueando a primeira e última mutação. (Figura 1) ^{9 , 10}.
   1. Se a mutação da sequência NGG PAM não é possível, introduza mutações silenciosas de 5-6 dentro da sequência de reconhecimento do alvo de sgRNA para evitar clivagem mediada por sgRNA do ssODN modelo HDR.
2. De uma fonte disponível, por exemplo, idtdna, obter um "do oligonucleotide Ultramer DNA" com os seguintes parâmetros: escala: nmol 4; Formulação: Nenhum; Purificação: Padrão de dessalinização.
3. Após a recepção, centrifugue ssODN liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Re-suavemente suspenda ssODN para uma concentração final de 100 µM em ddH nuclease livre₂O pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200.

3. projeto genotipagem Primers

1. Desenha um primer conjunto flanqueando a modificação do genoma para gerar um ~ 400-700 bp PCR amplicons¹¹.
2. Otimize condições de ciclagem do PCR para produzir um único e específico amplicon¹¹.

4. preparar injeção Mix

1. Centrifugue a tabela 1 reagentes na velocidade máxima por 2 min a 4 ° C.
2. Na ordem listada, adicione tabela 1 reagentes a um tubo PCR nuclease-livre.
3. Misture bem, pipetando suavemente 10 vezes acima e para baixo com uma pipeta de P20.
4. Incube a mistura de injeção por 10 min à temperatura ambiente.

5. injeção protocolo

1. Micropipeta de injeção de carga com aproximadamente metade da injeção mix¹². Salve o restante mistura de injeção, no caso a agulha de injeção entope ou quebra.
2. Quebre a ponta da micropipeta para que ~ 20-30 psi produz uma gradual corrente solução¹².
   Nota: Dicas de diâmetro maiores negativamente afetam a saúde animal e diminuem o rendimento de progênie F₁ .
3. Injectar 10-15 jovens adulto vermes em ambos os braços gonadais se possível¹². Se não, injeção em um braço gonadal é suficiente.
4. São permitidos animais injetados (P₀) recuperar para 1-2 h à temperatura ambiente em um prato de mídia (NGM) nematoides crescimento OP50-semeado de 35mm. Subsequentemente, o único injetado P₀ os animais às placas NGM individuais OP50-semeado 35mm usando um fio de platina worm pega¹².

6. tela P₀ placas e único mCherry(+) F₁s

1. Pós-injeção de dois dias, identificar placas de P₀ contendo progênie de₁ F expressando mCherry na faringe usando um microscópio fluorescente (Figura 1, dia 2 - 3). Escolha placas de três P₀ que contêm a maioria dos animais de₁ mCherry(+) F.
2. De cada um dos três selecionados pratos P₀ , único escolher 8-12 mCherry(+) F₁ animais para um total de 24-36 mCherry(+) F₁s usando um worm (Figura 1, dia 2 - 3).
   Nota: mCherry(-) animais também podem ser escolhidos destas placas de₀ P, mas a probabilidade de identificar corretamente editado animais é muito baixa (Figura 2A).
3. Permita individual F₁s a auto-fertilização e põem ovos por 1-2 dias à temperatura ambiente.

7. único Worm PCR e genotipagem

1. Após 1-2 dias de postura, transferi o F₁s individuais tampões de tubo de tira PCR contendo 7 µ l de tampão de Lise Worm usando uma picareta worm (tabela 2, Figura 1, dia 4-5).
2. Tubos de centrífuga de PCR na velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente para trazer os animais até o fundo do tubo e congelar os tubos a-80 ° C durante 1 h.
   Nota: Worms podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.
3. Lyse vermes congelados em um thermocycler usando o seguinte programa: 60 ° C por 60 min, 95 ° C por 15 min, segurar de 4 ° C.
4. Set-up do PCR mastermix conforme mostrado na tabela 3.
5. Adicionar 21 µ l de PCR mastermix limpa tubos de PCR e em seguida, adicione 4 µ l do lysis do verme da etapa 3. Misture bem, usando uma pipeta e executar programa PCR, seguindo as orientações de fabricantes (veja a Tabela de materiais).
6. Purificar as reações de PCR usando um kit de DNA limpo e concentre-se, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Eluir o DNA pela adição de 10 µ l água para a coluna de rotação.
7. Set-up mastermix de enzima de restrição conforme mostrado na tabela 4.
8. Adicionar 10 µ l de mastermix a enzima de restrição para cada reação de PCR limpa e incubar durante 1-2 h a 37 ° C¹³.
9. Separado digerido produtos do PCR em um gel de agarose 1,5% correr em 120 V usando 1 x reserva de Tris-Acetato-EDTA (TAE)¹⁴.

8. identificação e verificação de sequência dos animais editados

1. Examine amostras de enzima digerida para a presença de bandas que indicam potencial edição animais¹⁴ (Figura 1, dia 4-5).
   Nota: Carrega um controle de N2 para identificar potenciais mutações indel que podem ser observadas como mudanças no tamanho de banda e/ou digestão enzima de restrição inesperados e complexos padrões de borda.
2. Depois de identificar potenciais animais editados, use o restante 3 μL de Lise worm e repetir a reação de PCR. Não limpe ou enzima de restrição digerir a reação de PCR, depois que o programa está completo. Carregar a reação de PCR em um gel de agarose a 1%, separar e extrair a banda usando um gel de extração kit¹⁵ (ver Quadro de materiais).
3. Gel de¹⁶ Sanger sequência extraído DNA usando o primer de F1 para identificar os animais corretamente editados (figura 1A)
   Nota: Heterozigoto leituras conterá sobrepostos picos devido à presença do tipo selvagem e engenharia alelo.
4. Para obter animais homozigotos de animais editados heterozigotos verificados, único 8-12₂ animais e executar as etapas de 7-8.

Mutações no humano superóxido dismutase 1 (SOD1) representam ~ 10-20% do familiar esclerose amiotrófica lateral, uma doença neurodegenerativa devastadora que invariavelmente leva à paralisia e morte17. SOD-1 humana é uma proteína evolutivamente conservada compartilhamento de 55% de identidade e 70% de similaridade com a proteína de SOD-1 de c. elegans (figura 1B). Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiência da abordagem baseada em CRISPR-Cas9 RNP, escolhemos o gene c. elegans sod-1 para introduzir a variante de G93A humana associada a doença no genoma worm (figura 1A).

Para o engenheiro a mutação G93A no genoma de c. elegans , um sgRNA foi escolhido cujo local de reconhecimento de PAM fica 3 bp montante do codão G93 (Figura 1). Nós projetamos um ssODN HDR reparação modelo contendo: alterações 1) nucleotídeo para converter o codão G93 A93 (GGA GCA), 2) uma mudança silenciosa para o NGG PAM sequenciar (CGG CAG) para evitar sgRNA Cas9-mediada por clivagem do modelo HDR, 3) uma mutação silenciosa (CT) que apresenta um único site de enzima de restrição HindIII para genotipagem e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços (Figura 1). Um conjunto de primeira demão do PCR (F1-R1) foi projetado para produzir um único produto PCR de bp 592 em controles de N2 (figura 1A). Uma mistura de injeção contendo o sgRNA, Cas9, ssODN e um plasmídeo marcador fluorescente (pCFJ90) foram misturados, incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente e carregados em uma pipeta de microinjeção.

Figura 1 mostra o fluxo de trabalho após a mistura de injeção é carregada em uma micropipeta de injeção. No dia 0, animais de0 P 10-15 foram injetados em um ou ambos os braços de gônada, usando a técnica de microinjeção padrão18,19. Animais injetados recuperaram para 1-2 h e então foram banhados individualmente em placas NGM OP50-semeado. Após 2-3 dias, injecções de0 P sucesso foram identificadas por aqueles que têm mCherry(+) F1 progênie. As placas de0 top três P (ou seja, aqueles que têm o maior número de mCherry(+) F1s) foram escolhidos para análise posterior. De cada uma destas três placas (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s foram apontados para placas NGM individuais OP50-semeado 35 milímetros para um total de 24 mCherry(+) F1s. Após 2-3 dias de postura (dia 4 - 5), o indivíduo F1s foram transferidos para tubos de PCR contendo tampão de Lise worm e congelado por 1 h a-80 ° C. Posteriormente, o F1s foram lysed para libertar o DNA genômico e submetido a PCR. Os produtos PCR foram depois purificados e digeridos com HindIII por 1h e em um gel de agarose 1,5% identificar potencial edição animais. Em animais corretamente editados, digestão HindIII corta o produto do PCR completo (592 bp) em duas faixas de 370 bp e 222 bp. Esta estratégia de genotipagem inequivocamente diferencia entre o selvagem-tipo (592 bp), heterozigoto (592, 370, 222 bp) e homozigotia (370, 222 bp) animais. Figura 2A ilustra os resultados de genotipagem para os 24 animais de mCherry(+).

Para demonstrar que o marcador fluorescente mCherry enriquece para modificação do genoma, também escolhemos 8 animais de mCherry(-) de cada uma das placas de0 a 3 P. Dos 24 mCherry(+) F1s selecionados (barra vermelha), 10 contidos alélico-mono ou bi-alélico modificação (42%), 10 foram tipo selvagem (42%), 3 eram potenciais puntuais (13%), e houve 1 falha PCR (Figura 2A). Em contrapartida, do 24 mCherry(-) F1s selecionados, apenas 1 animal foi modificado corretamente (4%); enquanto, 23 eram tipo selvagem (96%) (Figura 2A). Figura 2B mostra o cromatograma do longa-metragem gel produto extraído de PCR (F.1-8-6), demonstrando que as mudanças de nucleotídeos precisos projetado no modelo HDR ssODN fielmente foram incorporados ao genoma deste F homozigoto 1 animal. Notavelmente, animais de1 F 10-7, 10-8 e 12-3 exibiram inesperado os tamanhos do produto do PCR e restrição digerir faixas padrões, sugerindo que estes animais podem ser portadores mutações indel complexo (Figura 2A). Assim, nosso método não só é capaz de gerar modificações operadas tanto por genoma desejado com facilidade, eficiência e fidelidade, mas também permite a identificação e recuperação de alelos indel exclusivo que pode lançar uma visão importante e inesperada em função dos genes.

Figura 1 . CRISPR-Cas9 engenharia do de c. eleganssod-1 locus. () Ilustração esquemática, retratando a estrutura intron-exon do locus de sod-1 em c. elegans. A barra vermelha indica a localização de G93 no exon 3. O conjunto de par de primer é notável pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) sequência de alinhamento dos humanos e proteínas de SOD-1 de c. elegans (worm). O resíduo G93 alvo é destacado em vermelho. (C) Top, uma seção do DNA genômico que cercam o codão G93 é mostrada como uma referência, e o PAM (verde) e sites de destino (azul) sgRNA são destacadas. Inferior, a homologia de único encalhado do oligonucleotide (ssODN) dirigido modelo de reparação (HDR) é mostrado contendo: o codão editar alterar G93 para A93, uma mudança silenciosa para o motivo do PAM para evitar clivagem pelo complexo sgRNA-Cas9, um silencioso mudar para apresentar um site exclusivo para a enzima de restrição HindIII (caixa amarela), e flanquear 5' e 3' 50 homologia de bp de armas (barras pretas). Todas as alterações de nucleotídeo projetadas no ssODN são vermelho realçado. (D) ilustração esquemática do pipeline para gerar e identificando o ponto baseado em CRISPR-Cas9 RNP mutantes. No dia 0, injete animais de 10-15 P0 com mistura de injeção. No dia 2-3, identificar animais de0 P injetados com sucesso por aqueles que contêm fluorescente progênie de1 F e escolher três P0 placas com a descendência mais fluorescente. De cada uma das placas três P0 , único 8 fluorescente F1 a descendência. No dia 4-5, (uma) etapa 1, individual F1s são escolhidos e colocados em tubos de PCR contendo tampão de Lise; (b) etapa 2, após a congelação a-80 ° C, contendo F1 vermes da polimerase lysed para liberar o DNA genômico, que é usado como um modelo PCR. Os produtos PCR são então limpos e digeridos com a enzima de restrição exclusiva; (c) passo 3, enzima digerido produtos são resolvidos em um gel de agarose onde selvagem tipo (+ / +), heterozigotos (m / +), e animais homozigotos (m/m) podem ser identificados pela digest restrição padrões de borda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Dados de genotipagem para sod-1 (G93A) mutantes. (A) Imagem de gel de F 1 animais que foram individualmente lysed, PCRed e digerido com HindIII. Para cada placa de0 P (P0-8, P0-10, P0-12), mCherry(+) 8 e 8 mCherry(-) F1 animais foram analisados. Tanto mono-alélica (números azuis) e bi-alélica (números vermelhos) editado animais foram recuperados. Tamanho mudou os produtos de PCR ou imprevisto HindIII digeridas bandas também foram recuperadas que são indicativos da indel mutantes (números em amarelos). Controles de N2 são mostrados como uma referência para a especificidade de dimensionamento e enzima de produto PCR. (B) Top, espaçamento de códon e traduções de aminoácidos são mostradas acima para o tipo selvagem (WT) e abaixo para G93A modificado vertentes. A edição desejada é realçada por uma caixa vermelha, e as mudanças em silêncio que criar um site de restrição HindIII em-frame são realçadas por uma caixa amarela. Todas as alterações de nucleotídeo projetado são mostradas em negrito. Fundo, cromatograma representativo de homozigoto F1 animal 8-6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. CRISPR-Cas9 RNP injeção Mix. Todos os reagentes devem ser re-suspensos em ddH nuclease livre2O. RNase livre técnicas devem ser usadas ao manusear reagentes e ao fazer a mistura de injeção.

Tabela 2. Worm do Lysis Buffer receita. Proteinase K deve ser acrescentado fresco antes de cada utilização.

Tabela 3. PCR Mastermix. O PCR mastermix deve ser misturado bem pipetando até que a solução é homogênea. 21 µ l de mastermix a PCR deve ser adicionado ao limpos tubos PCR, e então 4 µ l de verme lisado deve ser adicionado aos tubos corretamente etiquetados.

Tabela 4. Enzima de restrição Mastermix. Mastermix a enzima de restrição deve ser misturado bem pipetando até que a solução é homogênea. 10 µ l de mastermix a enzima de restrição deve ser adicionado a 10 µ l de produto PCR limpo

Agradecemos a membros do laboratório de leitura crítica deste manuscrito Beg. Cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Pesquisa no laboratório Beg é suportada por subvenções do NIH (R01 NS094678) e Associação de Distrofia Muscular (MDA382300) para A.A.B.