Artigo de método

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

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DOI:

10.3791/57518

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30 de abril de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Resumo

As repetições de palíndromos regularmente intercaladas em cluster (CRISPR) - CRISPR - proteína 9 (Cas9) sistema de defesa imune adaptativo procarióticas foi co-optado como uma poderosa ferramenta para a engenharia de precisão genoma eucariótico associada. Aqui, apresentamos um método rápido e simples, usando a guia único quimérico RNAs (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para a geração eficiente e precisa de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Descrevemos um pipeline para seleção de alvo sgRNA, reparação de homologia-dirigido (HDR) modelo de design, complexantes CRISPR-Cas9-RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem que permita a identificação robusta e rápida dos animais corretamente editados. Nossa abordagem não só permite a geração fácil e a identificação do ponto desejado genômica animais mutantes, mas também facilita a detecção de outros alelos do complexo indel em aproximadamente 4-5 dias com eficiência elevada e uma carga de trabalho reduzida de triagem.

Introdução

Recentes avanços tecnológicos têm radicalmente transformada e acelerou a capacidade de genomas de engenheiro precisamente. Em particular, o sistema CRISPR-Cas9, que depende da endonuclease guiada por RNA Cas9 para induzir uma pausa de fita dupla (DSB) perto da sequência alvo do interesse, tem sido extensivamente usado para engenheiro com precisão o genoma da maioria dos organismos modelo usados no investigação biomédica1,2,3,4. Significativamente, o uso de CRISPR-Cas9 destravou genoma edição mesmo em espécies de difícil como c. elegans5. Independentemente da espécie, gerar mutações pontuais com o genoma de CRISPR-Cas9 baseado editando o sistema se baseia em três componentes principais: 1) Cas9 endonuclease, 2) um guia único RNA (sgRNA) que direciona a endonuclease Cas9 para uma sequência do alvo e 3) um usuário projetado modelo de reparação de homologia-dirigido (HDR) contendo o desejado edit(s) de juros2.

Existem vários métodos que podem ser usados para introduzir o direcionamento sgRNA e Cas9 nuclease em células incluindo plasmídeo, RNA e de métodos de entrega baseada em viral6. Recentemente, entrega direta de ribonucleoproteínas sgRNA pre-complexado-Cas9 (RNPs) surgiu como uma ferramenta poderosa e eficiente no genoma baseados em CRISPR-Cas9 edição7. A entrega direta de pre-complexado CRISPR-Cas9 RNPs tem várias vantagens distintas, a saber: 1) RNPs ignorar a necessidade de transcrição celular e tradução, 2) RNPs são limpas rapidamente, que pode aumentar a especificidade, reduzindo o tempo disponível para o alvo clivagem e 3) RNPs contêm elementos de DNA/RNA não estrangeiros que contorna a introdução de sequências não-nativas no genoma hospedeiro através da integração aleatória. Juntos, esses atributos prováveis fornecem uma rajada curta duração de edição de CRISPR no alvo, minimizando os efeitos fora do alvo.

Descreveremos um protocolo simples e eficiente para a introdução de alterações genômicas site-specific em c. elegans. Este protocolo inclui a segmentação sgRNA design de modelo HDR único encalhado do oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 complexantes de RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem para a identificação inequívoca dos animais devidamente editados. Usando essa estratégia, não só as alterações desejadas e site-specific podem ser recuperadas, mas outras mutações indel inespecíficos também podem ser recuperadas. Assim, nossa estratégia permite a geração de uma série alélica usando uma estratégia simples, onde ambos mono-alélica, bi-alélica e indel mutantes podem ser gerados na geração1 F.

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Protocolo

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais seguiram a diretriz do National Institutes of Health e cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Michigan. Usar soluções livre de RNase e pipetar dicas em todo o protocolo. Limpe a área de trabalho, pipetas, tubos e centrífuga com solução de RNase descontaminação seguindo as orientações do fabricante (ver Tabela de materiais).

1. sgRNA seleção de alvo

  1. Usando um navegador da web, abra a página da Web: http://crispor.tefor.net8
    1. ~ 60 pares de bases (bp) da sequência flanqueando a edição desejada de interesse de entrada (ou seja, 30 bp 5' e 3' da edição desejada).
    2. Selecione o genoma elegans de Caenorhabditis no menu pulldown.
    3. Selecione o motivo de Protospacer adjacentes (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) no menu suspenso.
    4. Clique em enviar. Na página de resultados, escolha a sequência de top ranking destino mais próxima para a edição de interesse. Se não há alvo apropriado sites dentro de flanqueamento 60 bp sequência de entrada, expandir a sequência de consulta até 100 bp (ou seja, 50 bp ambos os lados do desejado editar).
  2. De uma fonte disponível, por exemplo, synthego, obter um 20-mer alvo sgRNA com as seguintes especificações: 3 nmol; sem modificações.
  3. Após a recepção, centrifugue sgRNA liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 60 µ l de TE nuclease-livre para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200. A concentração final é 50 µM.

2. homologia-dirigido reparação Template Design

  1. Desenha um HDR ssODN modelo que contém: 1) a mutação de interesse, 2) um site exclusivo em-frame endonuclease de restrição, 3) uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência de NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços flanqueando a primeira e última mutação. (Figura 1) 9 , 10.
    1. Se a mutação da sequência NGG PAM não é possível, introduza mutações silenciosas de 5-6 dentro da sequência de reconhecimento do alvo de sgRNA para evitar clivagem mediada por sgRNA do ssODN modelo HDR.
  2. De uma fonte disponível, por exemplo, idtdna, obter um "do oligonucleotide Ultramer DNA" com os seguintes parâmetros: escala: nmol 4; Formulação: Nenhum; Purificação: Padrão de dessalinização.
  3. Após a recepção, centrifugue ssODN liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Re-suavemente suspenda ssODN para uma concentração final de 100 µM em ddH nuclease livre2O pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200.

3. projeto genotipagem Primers

  1. Desenha um primer conjunto flanqueando a modificação do genoma para gerar um ~ 400-700 bp PCR amplicons11.
  2. Otimize condições de ciclagem do PCR para produzir um único e específico amplicon11.

4. preparar injeção Mix

  1. Centrifugue a tabela 1 reagentes na velocidade máxima por 2 min a 4 ° C.
  2. Na ordem listada, adicione tabela 1 reagentes a um tubo PCR nuclease-livre.
  3. Misture bem, pipetando suavemente 10 vezes acima e para baixo com uma pipeta de P20.
  4. Incube a mistura de injeção por 10 min à temperatura ambiente.

5. injeção protocolo

  1. Micropipeta de injeção de carga com aproximadamente metade da injeção mix12. Salve o restante mistura de injeção, no caso a agulha de injeção entope ou quebra.
  2. Quebre a ponta da micropipeta para que ~ 20-30 psi produz uma gradual corrente solução12.
    Nota: Dicas de diâmetro maiores negativamente afetam a saúde animal e diminuem o rendimento de progênie F1 .
  3. Injectar 10-15 jovens adulto vermes em ambos os braços gonadais se possível12. Se não, injeção em um braço gonadal é suficiente.
  4. São permitidos animais injetados (P0) recuperar para 1-2 h à temperatura ambiente em um prato de mídia (NGM) nematoides crescimento OP50-semeado de 35mm. Subsequentemente, o único injetado P0 os animais às placas NGM individuais OP50-semeado 35mm usando um fio de platina worm pega12.

6. tela P0 placas e único mCherry(+) F1s

  1. Pós-injeção de dois dias, identificar placas de P0 contendo progênie de1 F expressando mCherry na faringe usando um microscópio fluorescente (Figura 1, dia 2 - 3). Escolha placas de três P0 que contêm a maioria dos animais de1 mCherry(+) F.
  2. De cada um dos três selecionados pratos P0 , único escolher 8-12 mCherry(+) F1 animais para um total de 24-36 mCherry(+) F1s usando um worm (Figura 1, dia 2 - 3).
    Nota: mCherry(-) animais também podem ser escolhidos destas placas de0 P, mas a probabilidade de identificar corretamente editado animais é muito baixa (Figura 2A).
  3. Permita individual F1s a auto-fertilização e põem ovos por 1-2 dias à temperatura ambiente.

7. único Worm PCR e genotipagem

  1. Após 1-2 dias de postura, transferi o F1s individuais tampões de tubo de tira PCR contendo 7 µ l de tampão de Lise Worm usando uma picareta worm (tabela 2, Figura 1, dia 4-5).
  2. Tubos de centrífuga de PCR na velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente para trazer os animais até o fundo do tubo e congelar os tubos a-80 ° C durante 1 h.
    Nota: Worms podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.
  3. Lyse vermes congelados em um thermocycler usando o seguinte programa: 60 ° C por 60 min, 95 ° C por 15 min, segurar de 4 ° C.
  4. Set-up do PCR mastermix conforme mostrado na tabela 3.
  5. Adicionar 21 µ l de PCR mastermix limpa tubos de PCR e em seguida, adicione 4 µ l do lysis do verme da etapa 3. Misture bem, usando uma pipeta e executar programa PCR, seguindo as orientações de fabricantes (veja a Tabela de materiais).
  6. Purificar as reações de PCR usando um kit de DNA limpo e concentre-se, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Eluir o DNA pela adição de 10 µ l água para a coluna de rotação.
  7. Set-up mastermix de enzima de restrição conforme mostrado na tabela 4.
  8. Adicionar 10 µ l de mastermix a enzima de restrição para cada reação de PCR limpa e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.
  9. Separado digerido produtos do PCR em um gel de agarose 1,5% correr em 120 V usando 1 x reserva de Tris-Acetato-EDTA (TAE)14.

8. identificação e verificação de sequência dos animais editados

  1. Examine amostras de enzima digerida para a presença de bandas que indicam potencial edição animais14 (Figura 1, dia 4-5).
    Nota: Carrega um controle de N2 para identificar potenciais mutações indel que podem ser observadas como mudanças no tamanho de banda e/ou digestão enzima de restrição inesperados e complexos padrões de borda.
  2. Depois de identificar potenciais animais editados, use o restante 3 μL de Lise worm e repetir a reação de PCR. Não limpe ou enzima de restrição digerir a reação de PCR, depois que o programa está completo. Carregar a reação de PCR em um gel de agarose a 1%, separar e extrair a banda usando um gel de extração kit15 (ver Quadro de materiais).
  3. Gel de16 Sanger sequência extraído DNA usando o primer de F1 para identificar os animais corretamente editados (figura 1A)
    Nota: Heterozigoto leituras conterá sobrepostos picos devido à presença do tipo selvagem e engenharia alelo.
  4. Para obter animais homozigotos de animais editados heterozigotos verificados, único 8-122 animais e executar as etapas de 7-8.

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Resultados

Mutações no humano superóxido dismutase 1 (SOD1) representam ~ 10-20% do familiar esclerose amiotrófica lateral, uma doença neurodegenerativa devastadora que invariavelmente leva à paralisia e morte17. SOD-1 humana é uma proteína evolutivamente conservada compartilhamento de 55% de identidade e 70% de similaridade com a proteína de SOD-1 de c. elegans (figura 1B). Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiênc...

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Discussão

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficaz para precisamente modificar o genoma de organismos modelo. Aqui, demonstramos que sgRNAs quimérico20 juntamente com ssODN HDR modelos habilitar a geração altamente eficiente de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Importante, demonstramos que a entrega da RNP produz alta eficiência de edição quando fluorescência é usada como um marcador de seleção co, destacando a facilidade e confiabilidade da técnica.

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Divulgações

Agradecemos a membros do laboratório de leitura crítica deste manuscrito Beg. Cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Pesquisa no laboratório Beg é suportada por subvenções do NIH (R01 NS094678) e Associação de Distrofia Muscular (MDA382300) para A.A.B.

Agradecimentos

Há não há conflitos de interesse relacionados a este relatório.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CRISPRevolution sgRNA  Kit EZSynthego Inc.sgRNA quimérico
TE livre de nuclease SynthegoInc.fornecido com o kit de sgRNA Kit EZ Água
livre de nucleaseSynthego Inc.fornecido com o kit sgRNA Kit EZ 4
nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNATechnologies ssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNATechnologies 1078728Cas9 protein
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Marcador Plasmídeo
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Limpo & ConcentradorZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel Kit de Recuperação de DNAZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
Micropipetas de vidro de borossilicato de vidroSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1,0 mm. ID: 0.78mm
Cloridrato de TrizmaSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Solução de Descontaminação RNaseZapFisher ScientificAM9780

Referências

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