Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

O objetivo geral deste procedimento é gerar mutações pontuais genômicas em C. Elegans usando modelos de reparo direcionados por homologia de oligonucleotídeos de fita simples e ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como determinar as consequências patológicas da variação genética associada a doenças neurodegenerativas. A principal vantagem desta técnica é que mutações pontuais genômicas podem ser geradas rapidamente, permitindo o estudo funcional da variância genética dentro do contexto do controle regulatório endógeno, evitando as ressalvas de superexpressão de proteínas.

Para realizar a seleção do alvo do sgRNA, abra a página da Web mostrada aqui. Insira aproximadamente 60 pares de bases de sequência flanqueando a edição desejada de interesse. Depois de selecionar o genoma de C.Elegans e o motivo adjacente do protoespaçador de acordo com o protocolo de texto, clique em enviar.

Na página de resultados, escolha a sequência de destino mais próxima da edição de interesse. Após a recepção, centrifugue o tubo contendo sgRNA liofilizado à temperatura ambiente e pelo menos 12.000 g por um minuto. Adicione 60 microlitros de TE livre de nuclease ao tubo e use uma pipeta p200 para ressuspender suavemente pipetando para cima e para baixo 15 a 20 vezes.

A concentração final é de 50 micromolares. Projete um modelo ssODN HDR contendo a mutação de interesse, um local único de endonuclease de restrição de quadro, uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência NGG PAM e 50 pares de bases cinco braços de homologia primos e três primos flanqueando a primeira e a última mutação. Após o recebimento, centrifugue o tubo liofilizado contendo ssODN como acabamos de demonstrar e, em seguida, use DD H20 livre de nuclease para ressuspender suavemente o ssODN até uma concentração final de 100 micromolares.

Para preparar uma mistura de injecção, centrifugue os reagentes aqui indicados à velocidade máxima e a quatro graus Celsius durante dois minutos. Na ordem listada, adicione os reagentes a um tubo de PCR livre de nuclease. Em seguida, use uma pipeta p20 para misturar suave e completamente o conteúdo.

Incube o tubo em temperatura ambiente por dez minutos. Depois de injetar os animais P0 de acordo com o protocolo de texto, deixe-os recuperar à temperatura ambiente durante uma a duas horas numa placa de 35 milímetros NGM com sementes OP50. Posteriormente, usando uma picareta de fio de platina, transfira animais P0 injetados individualmente para placas NGM individuais de 35 milímetros com sementes OP50.

Dois dias após a injeção, use um microscópio fluorescente para identificar placas P0 contendo progênie F1, expressando mCherry na faringe. Escolha três placas P0 que contenham o maior número de animais F1 positivos para mCherry. De cada uma das três placas P0 selecionadas, use um picareta de minhoca para selecionar animais F1 positivos para cereja de oito a 12 m, totalizando 24 a 36 mCherry positivos para F1s.

Permita que os F1s individuais se autofertilizem e ponham ovos em temperatura ambiente por um a dois dias. Após um a dois dias de postura dos ovos, use um picareta de minhoca para transferir os F1s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo sete microlitros de tampão de lise de verme. Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima e à temperatura ambiente durante um minuto para levar os animais ao fundo do tubo.

Em seguida, congele os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora. Em seguida, lise os vermes congelados em um termociclador usando o seguinte programa. Em seguida, configure uma mistura principal de PCR, conforme mostrado nesta tabela.

Adicione 21 microlitros de mistura principal de PCR em tubos de PCR limpos, em seguida, adicione quatro microlitros do tubo de lise do verme e misture bem por pipetagem. Em seguida, execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante. Purifique as reações de PCR usando um kit de limpeza e concentrado de DNA seguindo as instruções do fabricante.

Em seguida, dilua o DNA adicionando 10 microlitros de água à coluna de rotação. Depois de configurar a mistura mestre de enzimas de restrição, adicione 10 microlitros a cada reação de PCR limpa e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, separe os produtos de PCR digeridos em um gel de 1,5% de agarose usando 1x tampão TAE a 120 volts.

Examine amostras digeridas por enzimas quanto à presença de bandas que indiquem animais potencialmente editados. Depois de identificar os animais editados em potencial, use os três microlitros restantes de lise de vermes e repita a PCR. Em seguida, carregue imediatamente as reações concluídas em um gel de 1% de agarose antes de separar e extrair a banda usando um kit de extração de gel.

Usando o primer F1, realize o sequenciamento de Sanger para identificar animais editados corretamente. Finalmente, para obter animais homozigotos de animais heterozigotos editados verificados, separar oito a 12 animais F2 e realizar genotipagem e verificação de sequência de acordo com o protocolo de texto. Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiência da abordagem baseada em CRISPR/Cas9 RNP, o gene C.Elegans sod-1 foi direcionado para introduzir a variante G93a humana associada à doença no genoma do verme.

Esta imagem em gel mostra os resultados da genotipagem de 24 animais F1 positivos para mCherry. 10 continham modificação monoalílica ou bialílica, 10 eram do tipo selvagem, três eram indels potenciais e um era uma falha de PCR. Para demonstrar que o marcador mCherry fluorescente enriquece para a modificação do genoma, oito animais negativos para mCherry de cada uma das três placas P0 foram escolhidos.

Apenas um animal foi modificado corretamente, enquanto 23 eram do tipo selvagem. Esta figura mostra o cromatograma do produto de PCR extraído em gel de comprimento total, demonstrando que as mudanças precisas de nucleotídeos projetadas no modelo ssODN HDR foram fielmente incorporadas ao genoma deste animal homozigoto F1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser utilizada para gerar e identificar mutações pontuais genômicas em C. Elegans em quatro a cinco dias, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar reagentes e técnicas livres de núcleo, incluindo água livre de RNase, pontas de pipeta de filtro e luvas. Seguindo esse procedimento, ensaios celulares, moleculares e comportamentais podem ser realizados para investigar fenótipos que possam se associar à mutação de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar com precisão mutações pontuais genômicas em C.Elegans usando RNase quimérica de guia único e riboproteínas ribonucleares CRISPR/Cas9.