Name: Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a gerar mutações pontuais genômicas em C. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo por homologia. Este método permite estudos funcionais de variância genética em neurociência.

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Há não há conflitos de interesse relacionados a este relatório.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais seguiram a diretriz do National Institutes of Health e cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Michigan. Usar soluções livre de RNase e pipetar dicas em todo o protocolo. Limpe a área de trabalho, pipetas, tubos e centrífuga com solução de RNase descontaminação seguindo as orientações do fabricante (ver Tabela de materiais).
1. sgRNA seleção de alvo
<ol><li>Usando um navegador da web, abra a página da Web: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 pares de bases (bp) da sequência flanqueando a edição desejada de interesse de entrada (ou seja, 30 bp 5' e 3' da edição desejada).</li>
		<li>Selecione o genoma elegans de Caenorhabditis no menu pulldown.</li>
		<li>Selecione o motivo de Protospacer adjacentes (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) no menu suspenso.</li>
		<li>Clique em enviar. Na página de resultados, escolha a sequência de top ranking destino mais próxima para a edição de interesse. Se não há alvo apropriado sites dentro de flanqueamento 60 bp sequência de entrada, expandir a sequência de consulta até 100 bp (ou seja, 50 bp ambos os lados do desejado editar).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De uma fonte disponível, por exemplo, synthego, obter um 20-mer alvo sgRNA com as seguintes especificações: 3 nmol; sem modificações.</li>
	<li>Após a recepção, centrifugue sgRNA liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 60 µ l de TE nuclease-livre para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200. A concentração final é 50 µM.</li>
</ol>2. homologia-dirigido reparação Template Design
<ol><li>Desenha um HDR ssODN modelo que contém: 1) a mutação de interesse, 2) um site exclusivo em-frame endonuclease de restrição, 3) uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência de NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços flanqueando a primeira e última mutação. (Figura 1) 9 , 10.<ol>
<li>Se a mutação da sequência NGG PAM não é possível, introduza mutações silenciosas de 5-6 dentro da sequência de reconhecimento do alvo de sgRNA para evitar clivagem mediada por sgRNA do ssODN modelo HDR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De uma fonte disponível, por exemplo, idtdna, obter um "do oligonucleotide Ultramer DNA" com os seguintes parâmetros: escala: nmol 4; Formulação: Nenhum; Purificação: Padrão de dessalinização.</li>
	<li>Após a recepção, centrifugue ssODN liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Re-suavemente suspenda ssODN para uma concentração final de 100 µM em ddH nuclease livre2O pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200.</li>
</ol>3. projeto genotipagem Primers
<ol><li>Desenha um primer conjunto flanqueando a modificação do genoma para gerar um ~ 400-700 bp PCR amplicons11.</li>
	<li>Otimize condições de ciclagem do PCR para produzir um único e específico amplicon11.</li>
</ol>4. preparar injeção Mix
<ol><li>Centrifugue a tabela 1 reagentes na velocidade máxima por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Na ordem listada, adicione tabela 1 reagentes a um tubo PCR nuclease-livre.</li>
	<li>Misture bem, pipetando suavemente 10 vezes acima e para baixo com uma pipeta de P20.</li>
	<li>Incube a mistura de injeção por 10 min à temperatura ambiente.</li>
</ol>5. injeção protocolo
<ol><li>Micropipeta de injeção de carga com aproximadamente metade da injeção mix12. Salve o restante mistura de injeção, no caso a agulha de injeção entope ou quebra.</li>
	<li>Quebre a ponta da micropipeta para que ~ 20-30 psi produz uma gradual corrente solução12. Nota: Dicas de diâmetro maiores negativamente afetam a saúde animal e diminuem o rendimento de progênie F1 .</li>
	<li>Injectar 10-15 jovens adulto vermes em ambos os braços gonadais se possível12. Se não, injeção em um braço gonadal é suficiente.</li>
	<li>São permitidos animais injetados (P0) recuperar para 1-2 h à temperatura ambiente em um prato de mídia (NGM) nematoides crescimento OP50-semeado de 35mm. Subsequentemente, o único injetado P0 os animais às placas NGM individuais OP50-semeado 35mm usando um fio de platina worm pega12.</li>
</ol>6. tela P0 placas e único mCherry(+) F1s
<ol><li>Pós-injeção de dois dias, identificar placas de P0 contendo progênie de1 F expressando mCherry na faringe usando um microscópio fluorescente (Figura 1, dia 2 - 3). Escolha placas de três P0 que contêm a maioria dos animais de1 mCherry(+) F.</li>
	<li>De cada um dos três selecionados pratos P0 , único escolher 8-12 mCherry(+) F1 animais para um total de 24-36 mCherry(+) F1s usando um worm (Figura 1, dia 2 - 3). Nota: mCherry(-) animais também podem ser escolhidos destas placas de0 P, mas a probabilidade de identificar corretamente editado animais é muito baixa (Figura 2A).</li>
	<li>Permita individual F1s a auto-fertilização e põem ovos por 1-2 dias à temperatura ambiente.</li>
</ol>7. único Worm PCR e genotipagem
<ol><li>Após 1-2 dias de postura, transferi o F1s individuais tampões de tubo de tira PCR contendo 7 µ l de tampão de Lise Worm usando uma picareta worm (tabela 2, Figura 1, dia 4-5).</li>
	<li>Tubos de centrífuga de PCR na velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente para trazer os animais até o fundo do tubo e congelar os tubos a-80 ° C durante 1 h. Nota: Worms podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.</li>
	<li>Lyse vermes congelados em um thermocycler usando o seguinte programa: 60 ° C por 60 min, 95 ° C por 15 min, segurar de 4 ° C.</li>
	<li>Set-up do PCR mastermix conforme mostrado na tabela 3.</li>
	<li>Adicionar 21 µ l de PCR mastermix limpa tubos de PCR e em seguida, adicione 4 µ l do lysis do verme da etapa 3. Misture bem, usando uma pipeta e executar programa PCR, seguindo as orientações de fabricantes (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Purificar as reações de PCR usando um kit de DNA limpo e concentre-se, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Eluir o DNA pela adição de 10 µ l água para a coluna de rotação.</li>
	<li>Set-up mastermix de enzima de restrição conforme mostrado na tabela 4.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de mastermix a enzima de restrição para cada reação de PCR limpa e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.</li>
	<li>Separado digerido produtos do PCR em um gel de agarose 1,5% correr em 120 V usando 1 x reserva de Tris-Acetato-EDTA (TAE)14.</li>
</ol>8. identificação e verificação de sequência dos animais editados
<ol><li>Examine amostras de enzima digerida para a presença de bandas que indicam potencial edição animais14 (Figura 1, dia 4-5). Nota: Carrega um controle de N2 para identificar potenciais mutações indel que podem ser observadas como mudanças no tamanho de banda e/ou digestão enzima de restrição inesperados e complexos padrões de borda.</li>
	<li>Depois de identificar potenciais animais editados, use o restante 3 μL de Lise worm e repetir a reação de PCR. Não limpe ou enzima de restrição digerir a reação de PCR, depois que o programa está completo. Carregar a reação de PCR em um gel de agarose a 1%, separar e extrair a banda usando um gel de extração kit15 (ver Quadro de materiais).</li>
	<li>Gel de16 Sanger sequência extraído DNA usando o primer de F1 para identificar os animais corretamente editados (figura 1A) Nota: Heterozigoto leituras conterá sobrepostos picos devido à presença do tipo selvagem e engenharia alelo.</li>
	<li>Para obter animais homozigotos de animais editados heterozigotos verificados, único 8-122 animais e executar as etapas de 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5057/dna-gel-electrophoresis">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29171728">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li>
<li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22918486">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li>
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<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
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<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+%28and+Other+%26%2334%3BOmics%26%2334%3B%29+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &#34;Omics&#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li>
<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Agradecemos a membros do laboratório de leitura crítica deste manuscrito Beg. Cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Pesquisa no laboratório Beg é suportada por subvenções do NIH (R01 NS094678) e Associação de Distrofia Muscular (MDA382300) para A.A.B.

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficaz para precisamente modificar o genoma de organismos modelo. Aqui, demonstramos que sgRNAs quimérico20 juntamente com ssODN HDR modelos habilitar a geração altamente eficiente de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Importante, demonstramos que a entrega da RNP produz alta eficiência de edição quando fluorescência é usada como um marcador de seleção co, destacando a facilidade e confiabilidade da técnica.
<p class="jove_cont...

Recentes avanços tecnológicos têm radicalmente transformada e acelerou a capacidade de genomas de engenheiro precisamente. Em particular, o sistema CRISPR-Cas9, que depende da endonuclease guiada por RNA Cas9 para induzir uma pausa de fita dupla (DSB) perto da sequência alvo do interesse, tem sido extensivamente usado para engenheiro com precisão o genoma da maioria dos organismos modelo usados no investigação biomédica1,2,3,4. Significativamente, o uso de CRISPR-Cas9 destravou genoma edição mesmo em espécies de difícil como c. elegans5. Independentemente da espécie, gerar mutações pontuais com o genoma de CRISPR-Cas9 baseado editando o sistema se baseia em três componentes principais: 1) Cas9 endonuclease, 2) um guia único RNA (sgRNA) que direciona a endonuclease Cas9 para uma sequência do alvo e 3) um usuário projetado modelo de reparação de homologia-dirigido (HDR) contendo o desejado edit(s) de juros2.
Existem vários métodos que podem ser usados para introduzir o direcionamento sgRNA e Cas9 nuclease em células incluindo plasmídeo, RNA e de métodos de entrega baseada em viral6. Recentemente, entrega direta de ribonucleoproteínas sgRNA pre-complexado-Cas9 (RNPs) surgiu como uma ferramenta poderosa e eficiente no genoma baseados em CRISPR-Cas9 edição7. A entrega direta de pre-complexado CRISPR-Cas9 RNPs tem várias vantagens distintas, a saber: 1) RNPs ignorar a necessidade de transcrição celular e tradução, 2) RNPs são limpas rapidamente, que pode aumentar a especificidade, reduzindo o tempo disponível para o alvo clivagem e 3) RNPs contêm elementos de DNA/RNA não estrangeiros que contorna a introdução de sequências não-nativas no genoma hospedeiro através da integração aleatória. Juntos, esses atributos prováveis fornecem uma rajada curta duração de edição de CRISPR no alvo, minimizando os efeitos fora do alvo.
Descreveremos um protocolo simples e eficiente para a introdução de alterações genômicas site-specific em c. elegans. Este protocolo inclui a segmentação sgRNA design de modelo HDR único encalhado do oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 complexantes de RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem para a identificação inequívoca dos animais devidamente editados. Usando essa estratégia, não só as alterações desejadas e site-specific podem ser recuperadas, mas outras mutações indel inespecíficos também podem ser recuperadas. Assim, nossa estratégia permite a geração de uma série alélica usando uma estratégia simples, onde ambos mono-alélica, bi-alélica e indel mutantes podem ser gerados na geração1 F.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; Kit EZ</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>sgRNA quimérico</td></tr><tr><td>TE livre de nuclease Synthego</td><td>Inc.</td><td>fornecido com o kit de sgRNA Kit EZ Água</td><td></td></tr><tr><td>livre de nuclease</td><td>Synthego Inc.</td><td>fornecido com o kit sgRNA Kit EZ 4</td><td></td></tr><tr><td>nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA</td><td></td><td>Technologies ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies 1078728</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marcador Plasmídeo</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Limpo & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de Recuperação de DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de vidro de borossilicato de vidro</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1,0 mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Cloridrato de Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Descontaminação RNaseZap</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

uma rápida e superficial pipeline para gerar genomic ponto mutantes em c. elegans usando crispr/cas9 ribonucleoproteínas

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

As repetições de palíndromos regularmente intercaladas em cluster (CRISPR) - CRISPR - proteína 9 (Cas9) sistema de defesa imune adaptativo procarióticas foi co-optado como uma poderosa ferramenta para a engenharia de precisão genoma eucariótico associada. Aqui, apresentamos um método rápido e simples, usando a guia único quimérico RNAs (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para a geração eficiente e precisa de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Descrevemos um pipeline para seleção de alvo sgRNA, reparação de homologia-dirigido (HDR) modelo de design, complexantes CRISPR-Cas9-RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem que permita a identificação robusta e rápida dos animais corretamente editados. Nossa abordagem não só permite a geração fácil e a identificação do ponto desejado genômica animais mutantes, mas também facilita a detecção de outros alelos do complexo indel em aproximadamente 4-5 dias com eficiência elevada e uma carga de trabalho reduzida de triagem.

Mutações no humano superóxido dismutase 1 (SOD1) representam ~ 10-20% do familiar esclerose amiotrófica lateral, uma doença neurodegenerativa devastadora que invariavelmente leva à paralisia e morte17. SOD-1 humana é uma proteína evolutivamente conservada compartilhamento de 55% de identidade e 70% de similaridade com a proteína de SOD-1 de c. elegans (figura 1B). Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiênc...

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar mutações pontuais genômicas em C. Elegans usando modelos de reparo direcionados por homologia de oligonucleotídeos de fita simples e ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como determinar as consequências patológicas da variação genética associada a doenças neurodegenerativas. A principal vantagem desta técnica é que mutações pontuais genômicas podem ser geradas rapidamente, permitindo o estudo funcional da variância genética dentro do contexto do controle regulatório endógeno, evitando as ressalvas de superexpressão de proteínas.Para realizar a seleção do alvo do sgRNA, abra a página da Web mostrada aqui. Insira aproximadamente 60 pares de bases de sequência flanqueando a edição desejada de interesse. Depois de selecionar o genoma de C.Elegans e o motivo adjacente do protoespaçador de acordo com o protocolo de texto, clique em enviar.Na página de resultados, escolha a sequência de destino mais próxima da edição de interesse. Após a recepção, centrifugue o tubo contendo sgRNA liofilizado à temperatura ambiente e pelo menos 12.000 g por um minuto. Adicione 60 microlitros de TE livre de nuclease ao tubo e use uma pipeta p200 para ressuspender suavemente pipetando para cima e para baixo 15 a 20 vezes.A concentração final é de 50 micromolares. Projete um modelo ssODN HDR contendo a mutação de interesse, um local único de endonuclease de restrição de quadro, uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência NGG PAM e 50 pares de bases cinco braços de homologia primos e três primos flanqueando a primeira e a última mutação. Após o recebimento, centrifugue o tubo liofilizado contendo ssODN como acabamos de demonstrar e, em seguida, use DD H20 livre de nuclease para ressuspender suavemente o ssODN até uma concentração final de 100 micromolares.Para preparar uma mistura de injecção, centrifugue os reagentes aqui indicados à velocidade máxima e a quatro graus Celsius durante dois minutos. Na ordem listada, adicione os reagentes a um tubo de PCR livre de nuclease. Em seguida, use uma pipeta p20 para misturar suave e completamente o conteúdo.Incube o tubo em temperatura ambiente por dez minutos. Depois de injetar os animais P0 de acordo com o protocolo de texto, deixe-os recuperar à temperatura ambiente durante uma a duas horas numa placa de 35 milímetros NGM com sementes OP50. Posteriormente, usando uma picareta de fio de platina, transfira animais P0 injetados individualmente para placas NGM individuais de 35 milímetros com sementes OP50.Dois dias após a injeção, use um microscópio fluorescente para identificar placas P0 contendo progênie F1, expressando mCherry na faringe. Escolha três placas P0 que contenham o maior número de animais F1 positivos para mCherry. De cada uma das três placas P0 selecionadas, use um picareta de minhoca para selecionar animais F1 positivos para cereja de oito a 12 m, totalizando 24 a 36 mCherry positivos para F1s.Permita que os F1s individuais se autofertilizem e ponham ovos em temperatura ambiente por um a dois dias. Após um a dois dias de postura dos ovos, use um picareta de minhoca para transferir os F1s para tampas de tubo de tira de PCR individuais contendo sete microlitros de tampão de lise de verme. Centrifugue os tubos de PCR na velocidade máxima e à temperatura ambiente durante um minuto para levar os animais ao fundo do tubo.Em seguida, congele os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora. Em seguida, lise os vermes congelados em um termociclador usando o seguinte programa. Em seguida, configure uma mistura principal de PCR, conforme mostrado nesta tabela.Adicione 21 microlitros de mistura principal de PCR em tubos de PCR limpos, em seguida, adicione quatro microlitros do tubo de lise do verme e misture bem por pipetagem. Em seguida, execute o programa de PCR seguindo as diretrizes do fabricante. Purifique as reações de PCR usando um kit de limpeza e concentrado de DNA seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, dilua o DNA adicionando 10 microlitros de água à coluna de rotação. Depois de configurar a mistura mestre de enzimas de restrição, adicione 10 microlitros a cada reação de PCR limpa e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, separe os produtos de PCR digeridos em um gel de 1,5% de agarose usando 1x tampão TAE a 120 volts.Examine amostras digeridas por enzimas quanto à presença de bandas que indiquem animais potencialmente editados. Depois de identificar os animais editados em potencial, use os três microlitros restantes de lise de vermes e repita a PCR. Em seguida, carregue imediatamente as reações concluídas em um gel de 1% de agarose antes de separar e extrair a banda usando um kit de extração de gel.Usando o primer F1, realize o sequenciamento de Sanger para identificar animais editados corretamente. Finalmente, para obter animais homozigotos de animais heterozigotos editados verificados, separar oito a 12 animais F2 e realizar genotipagem e verificação de sequência de acordo com o protocolo de texto. Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiência da abordagem baseada em CRISPR/Cas9 RNP, o gene C.Elegans sod-1 foi direcionado para introduzir a variante G93a humana associada à doença no genoma do verme.Esta imagem em gel mostra os resultados da genotipagem de 24 animais F1 positivos para mCherry. 10 continham modificação monoalílica ou bialílica, 10 eram do tipo selvagem, três eram indels potenciais e um era uma falha de PCR. Para demonstrar que o marcador mCherry fluorescente enriquece para a modificação do genoma, oito animais negativos para mCherry de cada uma das três placas P0 foram escolhidos.Apenas um animal foi modificado corretamente, enquanto 23 eram do tipo selvagem. Esta figura mostra o cromatograma do produto de PCR extraído em gel de comprimento total, demonstrando que as mudanças precisas de nucleotídeos projetadas no modelo ssODN HDR foram fielmente incorporadas ao genoma deste animal homozigoto F1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser utilizada para gerar e identificar mutações pontuais genômicas em C. Elegans em quatro a cinco dias, se for realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar reagentes e técnicas livres de núcleo, incluindo água livre de RNase, pontas de pipeta de filtro e luvas. Seguindo esse procedimento, ensaios celulares, moleculares e comportamentais podem ser realizados para investigar fenótipos que possam se associar à mutação de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar com precisão mutações pontuais genômicas em C.Elegans usando RNase quimérica de guia único e riboproteínas ribonucleares CRISPR/Cas9.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo descreve uma técnica para rastrear rapidamente um único nematóide em busca de um marcador genético por triagem de PCR. No protocolo de exemplo, examinamos a edição do genoma baseada em CRISPR.

PCR de verme único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Este vídeo descreve a microinjeção, um método comum de criação de cepas transgênicas de C. elegans. No exemplo, veremos a microinjeção usada para introduzir um complexo de ribonucleoproteína (RNP) para edição de genes baseados em CRISPR.

Microinjeção de gônadas: um método de entrega de compostos diretamente na linha germinativa de C. elegans

CRISPR/Cas9 é um sistema robusto para produzir ruptura de genes e elementos genéticos. Aqui descrevemos um protocolo para a criação eficiente de deleções genômicas em linhagens celulares de mamíferos usando CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Este artigo demonstra a engenharia genômica mediada por CRISPR-Cas9 em Steinernema hermaphroditum, um nematoide entomopatogênico (EPN: parasita inseto) e um modelo genético emergente. A tecnologia descrita é útil para criar mutantes, permitindo a elucidação das funções gênicas na biologia dos nematoides relevantes para simbiose mutualista e parasitária.

Mutagênese baseada em CRISPR-Cas9 no Nematoide Entomopatogênico Steinernema hermaphroditum e a Manutenção de Linhas Mutantes

Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.

Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

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Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

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