Um modelo de alça Intestinal ligados em galinhas livres anestesiados patógeno específico para estudar a virulência de Clostridium Perfringens

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para criar cirurgicamente 'intestinais laços ligados' no intestino de frango. Este procedimento permite a comparação de virulência em situ em um único host vários as estirpes Clostridium perfringens . Esse método marcadamente diminui o número de galinhas geralmente necessários para experimentos semelhantes na vivo .

Abstract

Enterite necrótica foi estudada em galinhas usando várias em vivo modelos de infecção. A maioria destes usa uma combinação de fatores predisponentes, tais como a dieta e coccidiose com gavagem ou administração através do feed usando o Clostridium perfringens. Nestes modelos, a comparação de várias cepas de c. perfringens para estudos de virulência requer um grande número de hosts para obter resultados significativos. Mortalidade no decorrer do estudo pode ser alta dependendo do modelo experimental, portanto, levantando preocupações éticas relativas ao bem-estar dos animal na pesquisa. O desenvolvimento de novos modelos de infecção, exigindo menos animais para estudar a patogênese, ainda, fornecer resultados estatisticamente significativos e válidos, é importante na redução do uso de animais em pesquisa. Modelos de alça intestinal ligados têm sido usados para estudar clostridial infecções em várias espécies, como ratos, coelhos e bezerros. Na sequência de procedimentos cirúrgicos para criar segmentos de laço ligados, cepas de c. perfringens são injetadas diretamente dos loops para estabelecer um contato próximo entre as bactérias e a mucosa intestinal. São retiradas amostras de intestino delgado e conteúdo luminal a finalização dos procedimentos, depois de algumas horas. Várias estirpes bacterianas podem ser inoculadas em cada animal, portanto, reduzindo o número de sujeitos necessários nos experimentos. Também, os procedimentos são realizados sob anestesia geral para reduzir a dor do animal. Em galinhas, esse modelo seria mais adequado que a administração oral para comparar a patogenicidade de cepa de c. perfringens , porque menos animais são necessários, sem fatores predisponentes são necessárias para induzir a doença e dor é controlada por analgésicos . O modelo de alça intestinal ligados é mal descrito em galinhas e padronização é essencial para optimizar a sua utilização. Este manuscrito fornece todos os passos necessários para criar inúmeros laços ligados intestinais em frangos e traz informações sobre os pontos críticos para obter resultados válidos.

Introduction

O uso de modelos animais para estudo de doenças infecciosas que afetam os seres humanos e animais é uma ferramenta central na avaliação de fatores de virulência, regulando a patogênese de uma condição específica, bem como para elaborar estratégias para prevenir ou curar doenças¹. Apesar das inúmeras vantagens do uso de modelos animais para o estudo de várias doenças, estão surgindo preocupações éticas em relação a esta prática. Os pesquisadores precisam minimizar o uso de animais durante a obtenção de resultados significativos e válidos. O conceito dos 3 princípios Rs (Replace, Reduce e Refine) foi elaborado para garantir que o bem-estar questões foram tratadas em tais ensaios. Em estudos de enterite necrótica do frango, na vivo modelos de galinha são usados para investigar a etiologia, prevenção e tratamentos desta condição^2,3,4,5. Cepas patogênicas de c. perfringens carregando fatores de virulência específicos, tais como a toxina NetB⁶, são administradas para causar enterite necrótica em galinhas⁷. O princípio de substituição é, portanto, difícil de conseguir neste caso como estes fatores de virulência podem não ser tão críticos em outras espécies animais. A maioria dos modelos para enterite necrótica em galinhas usam uma combinação de fatores de risco, tais como coccidiose e alteraram a dieta para induzir a enterite necrótica, seguido por gavagem do caldo de cultura que contém um grande número de c. perfringens². Estes modelos irão induzir a doença em um grande número de galinhas, e a mortalidade pode ser importante em tais ensaios⁸, assim, levantando preocupações sobre os princípios de redução e refinamento em pesquisas com animais.

Modelos de laços ligados intestinal são uma alternativa desejável para o estudo de doenças induzidas por patógenos intestinais em relação à redução de princípio e refinamento. Nestes modelos, chamados 'loops' de segmentos intestinais são criados colocando ligaduras ao longo do trato intestinal formando compartimentos independentes e herméticos onde patógenos podem ser injetados sozinho⁹ ou com outras moléculas, tais como candidatos vacinais ^{10 , 11}. os patógenos de interesse são colocados em contato com as células intestinais, e após algumas horas de tempo de infecção, amostras intestinais podem ser recuperadas para posterior análise. Isto permite o uso de múltiplos grupos tratamento e controle no mesmo animal. Análise estatística pode ser realizada com modelos de medidas repetidas, o que aumenta o poder de discriminação entre grupos e reduz o número de galinhas necessárias em relação aos testes de gavagem oral. Além disso, procedimentos cirúrgicos e subsequente infecção vezes são realizadas sob anestesia geral contínua e analgesia, portanto, minimizando a dor animal. Câmara de circuito fechado é um modelo ideal para reduzir o números de hosts e criando um sistema mais humano em pesquisas com animais.

Modelos de laços ligados intestinal são bem descritos em várias espécies, tais como vacas, coelhos e ratos^2,9, mas mal descritos em galinhas⁷. Para uma utilização óptima deste modelo cirúrgico, execução e técnica adequada são essenciais para a criação de loops intestinais ligados para evitar danos à integridade intestinal. O objetivo deste manuscrito é descrever um método passo a passo na criação de vários loops intestinais em um modelo de frango. Esta técnica é limitada pela habilidade e experiência do cirurgião, como procedimentos precisos são essenciais para o sucesso do projeto.

Protocol

Todos os procedimentos com uso de animais vivo foram autorizados pelo Comitê de ética da faculdade de medicina veterinária, Université de Montréal (CÉUA, 'Comitê d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. considerações antes da cirurgia

1. Selecione 10 semanas de idade patógenos específicos (SPF) Livorno galinhas livres para a cirurgia.
   Nota: O seu peso deve estar entre 1,0 e 1,2 kg.
2. Retire a alimentação 12 h antes dos procedimentos para esvaziar o trato intestinal.
3. Antes da cirurgia, coloque os frangos sob anestesia geral, seguindo um protocolo verificado por um anestesiologista. Pré-medicar cada frango 15 min antes da cirurgia com uma injeção intramuscular de (IM) de midazolam 1 mg/kg e butorfanol 4 mg/kg. Repito, todas as 4h, a injeção de butorfanol 4 mg/kg IM ou quando as mudanças de padrão de respiração e frequência aumenta durante a anestesia. Para a anestesia geral, durante todos os procedimentos, administre isoflurano em concentrações entre 1,5 e 2,5%, com um tubo endotraqueal.
   Nota: O uso de pré-medicação para sedação e analgesia é recomendado como eles serão significativamente melhorar a profundidade da anestesia, reduzir a quantidade de anestésicos necessárias durante todos os procedimentos, bem como permitir aos investigadores controlar os níveis de dor.
4. Monitore a anestesia pela gravação da temperatura corporal, frequência cardíaca e eletrocardiograma (ECG), respiratório taxa e ritmo, saturação de oxigênio, expirada de dióxido de carbono (CO₂) e reflexos neurológicos.
   Nota: Uma pessoa deve ser atribuída para monitorar esses parâmetros ao longo de todos os procedimentos.
5. Segui princípios de esterilidade durante os procedimentos cirúrgicos. Certifique-se que o cirurgião e o cirurgião assistente vestido com batas esterilizadas, luvas, máscara e óculos de protecção, de acordo com protocolos institucionais de pré-operatório. Certifique-se de que o cirurgião esfrega as mãos com uma escova esterilizada impregnado de gluconato de clorexidina até o cotovelo com ênfase em cada superfície de dedos e unhas.
6. Esterilize os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador.

2. preparação do local cirúrgico

1. Em primeiro lugar, remova manualmente as penas do abdômen com uma tração suave.
2. Esfregue o local cirúrgico com um clorexidina gluconato detergente impregnados escova esterilizada. Esfregue suavemente a pele do centro para fora por um tempo de contato total de 5 min sem voltar para o centro.
3. Execute 3 passagens alternativas no local da cirurgia com uma solução de gluconato de clorexidina e álcool isopropílico, usando gazes estéreis.
   Nota: A passagem deve começar do centro do local cirúrgico para as bordas para evitar a contaminação das áreas não-desinfectados para o sítio cirúrgico.
4. Coloque a cortina cirúrgica estéril sobre o frango.

3. extração do intestino na cavidade Abdominal

1. Incise a cortina cirúrgica com uma tesoura para expor somente a pele do local cirúrgico.
2. Faça uma incisão na pele através da realização de uma ' L ' forma baixa-incisão com uma lâmina de bisturi #3.
   1. Iniciar a primeira incisão de 1 cm caudal ao esterno e terminá-la a 1 cm cranial para a cloaca.
   2. Realize a segunda incisão perpendicular a primeira incisão. Começar da extremidade caudal da primeira incisão e continuar a 5 cm para o lado esquerdo do abdômen, seguindo a linha da pelve.
      Nota: Esta abertura criará uma aba que permite uma extração mais fácil dos intestinos.
3. Com a cirurgia a tesoura, corte o peritônio e os músculos abdominais, com o mesmo padrão de forma ' L ' para abrir a cavidade abdominal.
   Nota: Isto irá expor os sacos de ar. Os intestinos estão localizados por baixo destas estruturas. Sacos de ar devem ser humedecidos com gazes saturadas com estéril salina 0,85% para evitar a dessecação e possível ruptura durante o procedimento.
4. Inserir um Snook spay gancho na cavidade abdominal, seguindo a parede abdominal esquerda e trabalhar da maneira em torno os sacos aéreos abdominais.
5. Delicadamente, exteriorize os intestinos e espalhar estas no campo cirúrgico.
   Nota: Manter os intestinos umedecidos por pulverização frequentemente estéril salina 0,9% ao longo do processo. Além disso, gazes humedecidas com soro fisiológico estéril podem ser colocados nos intestinos para evitar a dessecação.
6. Pegue os intestinos, usando uma gaze esterilizada seca e puxe delicadamente para fora do intestino por tração manual para expor o jejuno.
   Nota: Os vasos mesentéricos são frágeis e tensão excessiva pode romper-se-los pode levar a lesões isquêmicas intestinais e comprometer significativamente o resultado do procedimento.

4. fabricação de Loops Intestinal

1. Criação de circuito n. º 1.
   1. Coloque uma ligadura simples com um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível no jejuno proximal, evitando a ligadura dos vasos mesentéricos.
   2. Coloque uma ligadura distal, 2 cm a ligadura proximal.
      Nota: Ligaduras simples feitas com material de sutura do multifilament são colocadas ao longo do trato intestinal para criar segmentos herméticos. Uma esquema (Figura 1) descreve a localização de todas as ligaduras. Os loops consistem de uma ligadura proximal e distal, separada por 2 cm.
2. Criação de interloop n. º 1.
   1. Coloque uma ligadura simples 0,5 cm aborally a ligadura distal de laço no. 1.
      Nota: Entre loops sucessivos, existem interloops de 1 cm, ou seja, segmentos fazendo uma separação física entre os loops. Para provavelmente diminuir o risco de contaminação cruzada de um loop para outro, uma simples ligadura é colocada no meio do interloop (0,5 cm de ligadura distal e proximal de 2 loops adjacentes). Isto reduz o risco de um possível contaminante vazou de um loop para alcançar a ligadura de um loop adjacente. Esses segmentos não são obrigatórios, mas irão diminuir o risco de contaminação cruzada.
3. Criação de loops subsequentes e interloops.
   1. Repita as etapas 4.1 e 4.2 para obter o número de loops desejados.
      Nota: Neste experimento, 9 loops e 8 interloops foram criados. Comprimento total ascendeu a 26 cm. O número de loops pode ser ajustado dependendo do estudo.

5. injeção de cepas de Clostridium perfringens em the Loops

1. Injete com uma seringa estéril e agulha 26G o patógeno em loop no. 1. Insira cuidadosamente a agulha do lado antimesenteric do intestino em um ângulo de 45°.
   Nota: Neste experimento, 0,2 mL de infusão de coração de cérebro (BHI) contendo 1 x 10⁶ UFC (unidades formadora de Colônia), de c. perfringens em fase de crescimento log de mid foi injetado em cada loop. 5 diferentes estirpes foram injetadas em 5 loops diferentes e os 4 restantes laços foram injetados com um controlo negativo não contendo nenhuma bactéria (BHI estéril), alternando patógenos e loops BHI estéril.
2. Repita a etapa 5.1 para injetar todos os laços.
3. Delicadamente, substitua o trato intestinal na zona dorsal da cavidade abdominal, embaixo os sacos de ar.

6. fechamento da cavidade Abdominal

1. A sutura dos músculos abdominais e peritônio.
   1. Suture o peritônio e os músculos abdominais ao longo da pelve (feito em passo 3.3) com um padrão de sutura contínua simples usando um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível.
   2. Suturar o peritônio e os músculos abdominais o esterno para a cloaca (feitas na etapa 3.3. com um padrão de sutura contínua simples usando um material Poliglactina multifilamento sintético absorvível.
2. A sutura da pele.
   1. Usando um material sintético do multifilament de Poliglactina e um padrão de sutura contínua simples, feche a incisão da pele ao longo da pelve feita no passo 3.2.
   2. Usando o mesmo material do multifilament ligadura e um padrão de sutura contínua simples, feche a incisão da pele do esterno para a cloaca em passo 3.2.

7. conclusão

1. Após os procedimentos cirúrgicos, manter o frango sob anestesia geral com uso adequado de analgésicos para minimizar a dor do animal durante o tempo de infecção. Continue a monitoração anestésica para garantir um nível adequado de anestesia.
2. Após o tempo desejado infecção, humanamente euthanize a galinha por deslocamento cervical sob anestesia geral.
   Nota: Para estes procedimentos, o tempo necessário para induzir lesões microscópicas com cepas patogênicas de c. perfringens foi 7 h.
3. Com uma lâmina de bisturi, #3, cortar um 0,5 cm para seção de longo ciclo de 1 cm e coloque-o em formol a 10% para análise durante a noite e ainda mais histopatológico de fixação.
4. Com a mesma lâmina de bisturi, cortou a seção loop restantes e coloque-o em um tubo estéril microcentrifuga para o isolamento das estirpes de c. perfringens em cada análise mais bacteriológicos de loop para a sua caracterização genética.
5. Repita os passos 7.2 e 7.3 para todos os loops, alterando a lâmina de bisturi entre cada loop.

Results

Um esquema de 9 alças intestinais e 8 interloops é mostrado na Figura 1. Neste modelo, um total de 9 loops e 8 interloops são criados com ligaduras simples. Um ciclo consiste de ligaduras proximais e distais, espaçadas por 2 cm, medido a partir da ligadura proximal. Dois loops adjacentes são separados por um interloop de 1 cm. Para diminuir o risco de contaminação cruzada entre loops por vazamento de uma ligadura, uma ligadura interloop é colocada a meio cami...

Discussion

Modelos de laços intestinal têm sido descritos em inúmeras espécies para estudar a interação patógeno-hospedeiro e patogénese das doenças causadas por vários patógenos intestinais, tais como o Clostridium perfringens, Clostridium difficile e Salmonella typhi^7,9,13,14,15. Também tem sido usado para analisar as mucosas resposta imune

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% gluconato de clorexidina impregnado com detergente estéril escova. Nenhum número de catálogo disponível. Endereço do sítio Web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Álcool isopropílico 70% USP 4 L	Álcool isopropílico comercial	P016IP70	Endereço da Web: http://www.comalc.com/products/
Clorexidina	Sigma-Aldrich	282227-1G	Solução de gluconato de clorexidina, deve ser diluída a 4%. Endereço da Web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Campo cirúrgico pequeno (27 polegadas x 24 polegadas) com 3 x 6 polegadas Fenestração	de especialidades veterinárias	32724	Endereço da web: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Lâminas de bisturi # 3	Swann-Morton	301	Endereço da Web: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Solução salina estéril NaCl 0,9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Endereço da Web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Material de sutura absorvível multifilamento de poliglactina. Endereço do sítio Web:
http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture Seringa de 1 ml com agulha 26G	Becton Dickinson and Company	329652	Endereço do sítio Web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Endereço da web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
tubo Eppendorf	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	. Endereço do site: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Solução de formalina tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Ratio tecido : formalina de 1:10 para fixação adequada. Endereço do sítio Web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens estirpes	Université de Montré al, Chaire en recherche avicole	N/A	Específico para cada laboratório, disponível mediante solicitação ao autor correspondente