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Artigo de método

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

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DOI:

10.3791/57526

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20 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

Neste artigo

Resumo

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Resumo

Gabaérgica interneurônios (INs) são componentes críticos de redes neuronais que orientam o comportamento e cognição. INs, destinado a preencher o córtex tangencialmente migrar do seu local de origem no telencéfalo ventral (incluindo das Eminências medial e caudais ganglionar (MGE, CGE)) para a placa cortical dorsal em resposta a uma variedade de intrínsecos e extrínsecos sugestões. Diferentes metodologias foram desenvolvidas ao longo dos anos geneticamente manipular percursos específicos e investigar como eles regulam as alterações do citoesqueleto dinâmicas necessárias para adequado em migração. No utero electroporation tem sido extensivamente usado para estudar o efeito da repressão do gene ou superexpressão no específico em subtipos durante a avaliação do impacto sobre a morfologia e a posição final. No entanto, enquanto essa abordagem é facilmente usada para modificar radialmente migração células piramidais, é mais tecnicamente desafiador quando direcionamento ins no utero electroporation gera um baixo rendimento, tendo em conta as taxas de sobrevivência diminuída dos filhotes quando eletroporação é realizada antes de e14.5, como é habitual quando estudando MGE-derivado INs. Em uma abordagem alternativa, MGE explantes proporcionam fácil acesso para o MGE em facilitam a imagem de INs geneticamente modificados. No entanto, nesses explantes, INs migrar para uma matriz artificial, desprovida de pistas de orientação endógena e entradas talâmicos. Isto nos levou a otimizar um método onde INs pode migrar em um ambiente mais naturalista, ao contornar os desafios técnicos das abordagens no útero . Neste trabalho, descrevemos a combinação de ex utero electroporation do cérebro embrionário do mouse seguido de culturas de fatia organotypic facilmente rastrear, imagem e reconstruir geneticamente modificados INs migrando ao longo de seus caminhos naturais em resposta a cues endógenas. Esta abordagem permite tanto a quantificação dos aspectos dinâmicos na migração com imagem latente confocal lapso de tempo, bem como a análise pormenorizada dos vários parâmetros morfológicos usando reconstruções neuronais no tecido fixo immunolabeled.

Introdução

Cortical gabaérgica interneurônios (INs) são diversos em relação a suas propriedades bioquímicas, propriedades fisiológicas e conectividade, e eles medeiam funções diferentes em redes maduro1,2,3 ,4,5. A especificação de diferentes subtipos de INs cortical é fortemente regulamentada através de cascatas genéticas que têm sido extensivamente estudados1,2. A maioria (70%) cortical gabaérgica INs originam progenitores em medial Eminência ganglionar (MGE), uma estrutura embrionária localizada ventralmente e deve migrar através de distâncias relativamente longas para alcançar a placa cortical1, 2 , 6. enquanto células piramidais corticais radialmente migram da zona ventricular (VZ) para a placa cortical ao longo do andaime glia radial, a migração tangencial do INs, que não estão conectados para tal um andaime, requer uma variedade de intrínsecos e extrínsecas pistas para atrair os neurônios migrando em direção a placa cortical, enquanto orientando-os longe de estruturas não-cortical2,7,8. Depois de sair do ciclo celular, INs são repelidos desde a MGE por quimioterapia-repulsivo pistas expressas dentro o VZ da MGE, que desencadeia a migração tangencial em direção a placa cortical9,10. Migrando INs evitar o striatum com o auxílio de diferentes pistas repulsivo11 e, depois de atingir a placa cortical, eles alternar de um tangencial para um modo de migração radial e atingir a posição final laminar, em parte em resposta às sugestões do piramidal células12 e outras populações celulares13. A migração do INs, quanto a outras populações neuronais, envolve várias mudanças morfológicas dinâmicas para permitir o movimento real do neurônio. Este so-called locomoção neuronal é caracterizada por ciclos repetitivos de três etapas sucessivas: o alongamento de um processo principal, um movimento ativo anterógrada do núcleo (nucleocinese) e a retração do processo à direita14. EM migração é regulada por numerosas pistas intrínsecas e extrínsecas que impulsionam a ramificação e remodelação ativo do processo principal para guiar o INs na direção correta, determinando tanto a orientação e a velocidade de migração14,15 ,16.

Os determinantes de regulação cortical em migração têm sido muito estudados nos últimos anos1,2,7,17,18,19,20, e perturbação em alguns desses atores molecular tem sido postulada para levar a distúrbios de desenvolvimento neurológico, como pediátrica refratário epilepsia ou autismo espectro transtornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por conseguinte, o desenvolvimento de diversas abordagens in vitro e in vivo tem sido exercido para avançar significativamente a nossa capacidade de estudar este processo dinâmico, como anteriormente analisados25. Em vitro métodos, incluindo o ensaio de câmara Boyden e o ensaio de escolha de listra, fornecem os meios mais rápidos e mais reprodutíveis de avaliar a exigência e o impacto célula autónomos de genes específicos ou proteínas durante a migração neuronal, sem a influência de outros fatores,25. Estes ensaios são particularmente úteis quando combinados com imagens live8,26,27. Com estas técnicas, INs são facilmente obtido e13.5 MGE e isolado por dissociação enzimática e mecânica, após o qual podem ser investigados diferentes vias de sinalização e sinais de orientação, como ilustrado anteriormente8,28 . No entanto, estes ensaios ocorrem em uma matriz extracellular artificial na ausência de arquitetura de tecido tridimensional, que pode alterar as propriedades de comportamento e célula neuronais, potencialmente afetando25, de migração e/ou sobrevivência celular. Para contornar essas limitações, ex vivo MGE explantes foram desenvolvidos como uma ferramenta alternativa para quantificar as mudanças morfológicas dinâmicas que ocorrem durante a migração, juntamente com parâmetros como velocidade e orientação14, 29. Geração de explantes MGE é relativamente simples e tem sido extensivamente descrito em outro lugar30. Implica o chapeamento de um pequeno extracto da MGE em uma monocamada de células corticais mistas ou em uma mistura de matrigel e colágeno na presença de sinais atraente ou repulsivo25, embora este último é opcionais31. MGE explantes permitem alta resolução de imagem de células escassamente rotuladas, simplificando o estudo de processos intracelulares, tais como a remodelação do citoesqueleto durante processo líder de ramificação, conforme mostrado anteriormente,32,33 ,34 e no presente estudo. MGE explantes foram usados com sucesso para avaliar alterações do citoesqueleto dinâmicas durante na migração em um ambiente 2D, por exemplo após manipulações farmacológicas ou Quimiotáticos específicas (ver, por exemplo, Tielens et al . 201633) . No entanto, com esta abordagem, INs migrar dentro de uma matriz artificial, e isso pode alterar no comportamento e a reprodutibilidade e o significado dos resultados experimentais.

Por outro lado, no utero electroporation permite a manipulação genética de INs no seu ambiente nativo e é um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a avaliar o impacto do ganho e perda de função dos genes ao contornar as limitações de knockout dispendioso e demorado e bater-se em estratégias de25,35. Electroporation no utero pode ser inclinado para em progenitores utilizando factores específicos de tipo de célula e posicionamento dos eléctrodos para estruturas ventromedial, incluindo o MGE36. Além disso, no utero electroporation permite a expressão oportuna de construções experimentais dentro de 1-2 dias, em comparação com os 7-10 dias necessários para construir a expressão usando viral vectores25. No entanto, no utero eletroporação de em progenitores tende a ser baixo rendimento. Com efeito, apesar de progenitores de célula piramidal localizados na zona dorsal ventricular podem ser eficientemente transfectadas usando no utero electroporation, alvo localizadas ventralmente mais estruturas, tais como o MGE, é mais tecnicamente desafiador, especialmente em pequenas e13.5 embriões e a alta taxa de letalidade embrionária mais reduz o rendimento experimental25.

Para contornar algumas das limitações técnicas associadas com in vitro MGE explant experimentos e na vivo no útero electroporation, ex vivo organotypic fatia culturas foram desenvolvidos8,37,, 38,39. Cérebro organotypic fatia culturas oferta condições a vantagem de imitar em vivo , apesar de ser menos caro e demorado do que animal gerando modelos25. Com efeito, estas preparações permitem um fácil acesso para o MGE, juntamente com a visualização específica de INs e podem ser combinadas com eletroporação focal para investigar as vias moleculares específicas no INs migrando em um mais fisiológica de ambiente8 , 39 , 40 , 41. otimizamos, portanto, uma abordagem por organotypic culturas38, que nós combinamos com ex utero electroporation e imagem latente confocal lapso de tempo, ainda mais, avaliar o processo dinâmico e morfológico ocorrem durante a migração tangencial do MGE-INs. O presente protocolo foi adaptado e otimizado de outros que usaram para estudar a migração de células piramidais42,43 ex utero ou no utero cérebro electroporation e organotypic fatia culturas e cortical INs36,39,44. Especificamente, embriões do rato são decapitados e a MGE é electroporated ex vivo após a injeção intraventricular dos Plasmideos experimentais, permitindo mais eficientes e precisos segmentação dos progenitores MGE do que o que pode ser conseguido com electroporation no útero . O cérebro então é extraído e seccionados em fatias coronais do cérebro inteiro que podem ser cultivadas por alguns dias, permitindo assim contínuo monitoramento e imagem da INs transfectadas. Essa abordagem normalmente rotula INs tangencialmente migrando 5-20 por fatia do cérebro, minimizando o número de iterações experimentais necessária para alcançar significância estatística, enquanto rotular uma população neuronal suficientemente escassa para garantir a fácil separação de neurônios individuais para a reconstrução e a avaliação morfológica bem. Além disso, comparado a MGE explantes, culturas de organotypic garantir que migrando INs estão expostos a um ambiente mais natural, incluindo quimiocinas secretadas localmente e entradas de afferents talâmica. Esta abordagem é, portanto, adequada para quantificar a direcionalidade e migratório caminho adotado pelo INs transfectadas, oferecendo detalhes anatômicos suficientes para permitir a caracterização dos processos dinâmicos mais finas tais como principal processo de ramificação, nucleocinese e retração de processo à direita.

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Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) no centro de pesquisa de Sainte-Justine CHU e foram conduzidos de acordo com o Conselho canadense no guia do cuidado do Animal para o cuidado e o uso de animais experimentais (Ed. 2).

O protocolo descrito aqui foi otimizado para eletroporação de embriões no dia embrionário (e) 13,5, em um momento quando MGE-derivado INs ativamente são gerados, antes do pico da CGE-derivado INs produção45,46. Além disso, para influenciar a eletroporação para gabaérgica INs, usamos um promotor seletivamente expressado em INs (por exemplo, o promotor de Dlx5/6 com sua mínima enhancer)47.

1. preparação de soluções para eletroporação e culturas Organotypic fatia

  1. Prepare a 125 mL de meio de cultura estéril.
    1. Medir 125 mL do meio de cultura regular neurônio-específico (ver Tabela de materiais para formulação) em um frasco esterilizado em um armário de biossegurança UV-esterilizados previamente pulverizadas com etanol a 70%. Adicione 2,25 mL de 50 x suplemento isento de soro neurônio específico, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentração final de 0,5 mM) e 6,25 mL de soro de cavalo inactivadas pelo calor anteriormente aliquotado sob condições estéreis. Misture bem, alíquota de 15 mL estéril tubos cônicos e armazenar a 4 ° C.
      Nota: O meio de cultura preparado pode ser armazenado por até 3 semanas a 4 ° C.
    2. Dividir uma 100 X solução stock de N-2 formulação48 do Botteinstein em 150 alíquotas µ l em condições estéreis e congelar a-20 ° C até o uso.
  2. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano estéril (ACSF) artificial.
    1. Medir a 800 mL de água destilada num copo de 1 L. Adicionar 25,67 g de sacarose, 5,08 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,18 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 1,80 g de glicose, 0,19 g de cloreto de potássio (KCl), 0,15 g de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), 1 mL de estoque 1 M CaCl2 .2H2O e 2 mL de 1m estoque MgSO4.7h2O. mexa para dissolver à temperatura ambiente. Adicionar água destilada para alcançar um volume total de 1 L.
    2. Usando um filtro de 0,22 µm, filtrar a solução em um frasco estéril em um armário de biossegurança esterilizado e armazenar a 4 ° C por até 1 mês.
  3. Prepare uma solução fresca de 4% de agarose em ACSF antes de cada experimento.
    1. Medir 25 mL de ACSF previamente preparado em um tubo cônico estéril de 50 mL e adicionar 1 g de agarose de ponto baixo ponto de fusão.
    2. Calor para 45 s em um forno de microondas. Para evitar derramamento, interromper a cada 3-4 s de aquecimento, quando começa a ferver, abrir o tubo para que deixe a pressão sair, fechá-la novamente e agitar manualmente para misturar o agarose. Repita até que a solução de agarose é homogênea. Manter a solução de agarose a 42 ° C durante o restante do experimento para evitar a solidificação.
      Nota: Temperaturas mais altas irão danificar tecidos cerebrais.

2. preparação de plasmídeos para injeção

  1. Puxe uma pipeta de microinjeção de vidro
    1. Definir o extrator de micropipeta com os parâmetros adequados, garantir o capilar de vidro no espaço fornecido e verifique se que está centrado com o filamento.
    2. Pressione o botão de puxar.
    3. Retire cuidadosamente as pipetas recém-feitos microinjeção do extrator de calor e coloque em uma caixa ou um prato de petri limpo até mais uso para não danificar a ponta.
  2. Set-up a biossegurança do armário com todos os instrumentos necessários para este experimento (ver figura 1A), pulverize generosamente todos os instrumentos no armário a biossegurança com etanol a 70% e esterilizar os instrumentos e o ambiente com luz UV de 15-20 min.
  3. Durante a etapa de esterilização, descongele plasmídeos no gelo (4 ° C).
  4. Medir 10 µ l do plasmídeo de uma solução stock (4 µ g / µ l) para um tubo de centrifugação limpa 1,5 mL. Adicione 0,01% de verde rápido FCF. Misture delicadamente, girar rapidamente e manter no gelo até o uso.
    Nota: Maxi-prep DNA deve ser preparado de acordo com o protocolo do fabricante através do kit livre de endotoxinas maxi-prep. DNA pode ser solubilizado em tampão TE ou livre de nuclease H2O e a elaboração do plasmídeo com tintura solução pode, mas não precisam ser realizadas em condições assépticas. Plasmídeos de Maxi-prep devem ser aliquotados para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento. Plasmídeos aliquotados devem ser misturados com o corante não mais que 2 h antes da utilização e não devem ser recongelados para utilização posterior.
  5. Após a esterilização, prepare o nano-injector como segue.
    1. Escolha um da pipeta de microinjeção de vidro previamente preparada armazenada em uma caixa limpa ou placa de Petri e uso uma pinça pequena cortar a ponta da pipeta de forma chanfrada para atingir um diâmetro externo de aproximadamente 15 µm.
      Nota: O diâmetro exterior dado aqui é uma medida aproximada, para dar ao usuário uma ideia do que usamos em nossas experiências e foi otimizado para facilitar a perfuração do crânio para a injeção do plasmídeo sem danificar o cérebro, permitindo que o fluido carregamento e liberação do DNA. O diâmetro exterior pode ser medido por olhar para a ponta de corte da pipeta vidro microinjeção apposed a uma barra de escala micrométrica sob um microscópio de campo claro.
    2. Use uma seringa para encher a micropipeta com óleo mineral de sua extremidade unpulled (para expelir o ar).
    3. Inserir a micropipeta de vidro preenchida em nano-injector, seguindo as instruções do fabricante.
    4. 2/3rds vazio da micropipeta de vidro (mantendo o óleo suficiente para impedir a entrada de ar).
  6. Cuidadosamente Introduza a micropipeta preparada no tubo que contém a solução de tintura/plasmídeo e encher a micropipeta de vidro com a solução de tintura/plasmídeo.

3. coleta de embriões de rato de fêmeas grávidas

  1. Monitorar fêmeas reprodutoras diariamente para avaliar plugging vaginal, de preferência ao mesmo tempo diariamente (no início da tarde). Dia e0.5 corresponde ao primeiro dia quando um plugue vaginal é observado.
    Nota: Os experimentos descritos aqui podem ser conduzidos em ratos do selvagem-tipo. No entanto, para facilitar a identificação da MGE e rotular todos gabaérgica INs (ou sub-conjuntos específicos tais como MGE-derivado INs), animais transgénicos podem ser usados (por exemplo: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre com um alelo de Cre-repórter, de47,etc.49). Nesta situação, o plasmídeo experimental injetado deve expressar fluoróforo outro (por exemplo mCherry ou TdTomato) para permitir a visualização do INs transfectadas (amarelo) que podem ser comparados com não-transfectadas INs (verde).
  2. Sacrifica a fêmea no e13.5 dia embrionário, pela luxação do pescoço.
    Nota: Dados no momento do sacrifício de agentes anestésicos podem impactar na migração e sobrevivência de50,51 e devem ser evitados.
  3. Colete embriões por cesariana como segue.
    1. Pulverize generosamente o abdômen feminino com etanol a 70%. Puxe a pele abdominal com um par de Pinças esterilizadas e, com a outra mão, use tesoura cirúrgica esterilizada para cortar a pele do abdômen.
    2. Com um segundo par de Pinças esterilizadas e tesoura, puxe a fáscia abdominal e cortá-la, cuidadosamente, evitando o útero.
    3. Usando um terceiro par de Pinças esterilizadas e tesoura, puxe os cornos uterinos e cortá-los fora da cavidade pélvica. Coloque os cornos uterinos dissecados em um prato de petri estéril-60mm repleto de neural com base em meio de cultura suplementado com aminoácidos, vitaminas e sais inorgânicos (consulte Tabela de materiais para produto comercialmente disponível).
  4. Em uma armário de biossegurança estéril, use dois pares de pinças bem (um em cada mão) para dissecar os embriões fora da placenta e isolar as cabeças por decapitação.
  5. Bisel-corte a ponta de uma pipeta de transferência plástico estéril mL 3, aspirar as cabeças e transferência-los em uma nova 60mm Petri estéril em camadas com cera preta solidificada e preenchido com a mesma base neural completado meio de cultura como acima.
    Nota: Este passo minimiza a transferência de contaminantes (cabelo de rato, sangue). A cera preta é usada para estabilizar a cabeça durante a dissecção. Meios de cultura não precisa ser oxigenado durante estes procedimentos.

4. intraventricular plasmídeo injeções e eletroporação Ex Vivo do MGE

Nota: As seguintes etapas devem ser executadas sob condições estéreis na armário de biossegurança previamente preparada.

  1. Lugar de Petri 60mm em camadas com cera preta... e contendo as cabeças decapitadas em neural baseado complementada meio de cultura sob o binóculo no armário a biossegurança.
  2. Estabilizar a cabeça, a parte rostral virado para a direita, com uma pinça bem com a mão esquerda e use o nano-injector na mão direita para injetar 1-2 µ l da solução de tintura/plasmídeo no ventrículo lateral direito.
    Nota: As experiências de expressão co podem ser conduzida por co-electroporating um plasmídeo de resgate e um plasmídeo expressando de shRNA misturando ambos Plasmideos em concentrações equimolar.
  3. Electroporate o cérebro injetado.
    1. Coloque a cabeça entre os eléctrodos com o elétrodo negativo posicionado dorsalmente e paralelo à cabeça e o eletrodo positivo para o lado ventral da cabeça para direcionar a MGE.
    2. Uma vez que os eléctrodos estão bem posicionados, entrega 4 pulsos quadrados de 40 V de 50 ms a ms 500 intervalos inter pulso.
    3. Remova qualquer tecido residual de eletrodos usando uma pinça já colocada na biossegurança do armário.
      Nota: Estes parâmetros foram otimizados especificamente para o electroporator usado em nossos experimentos. Recomendamos que os usuários executam testes otimizando previamente se usando um tipo diferente de electroporator.
    4. Repita as etapas 4.1 a 4.3 para todos os cérebros restantes.
      Nota: Embora este protocolo descreve as manipulações necessárias para um cérebro, é possível injetar até 4 cérebros sequencialmente antes electroporating cada cérebro, aumentando assim o rendimento. Esta estratégia é especialmente vantajosa quando 2 ou mais diferentes plasmídeos são injetados em sequência (por exemplo, controle ou plasmídeo experimental) durante o mesmo experimento (permitindo a comparação entre littermates). Além disso, é possível injetar e electroporate simultaneamente ambos os lados do cérebro para aumentar o rendimento, pelo posicionamento dos eléctrodos completamente paralelo à superfície do cérebro.

5. cérebro dissecção e culturas Organotypic fatia

  1. Enquanto ainda manipular no ambiente estéril do armário a biossegurança, disseca o cérebro o crânio.
    1. Estabilize a cabeça sobre a camada de cera preta, inserindo uma agulha em cada olho, evitando cuidadosamente o cérebro.
    2. Use um par de pinças bem para manter o lado esquerdo do pescoço e um segundo par de pinças bem para rasgar a pele do crânio, de trás para frente.
    3. Mantendo a cabeça lateralmente com uma pinça em uma mão, use outro par de pinças na outra mão para corte cuidadosamente o crânio ao nível do tronco cerebral e gentilmente puxe o crânio. Com cada pinça, cortar o crânio no plano sagital (linha média) para a frente e então entalha lateralmente para liberar os fragmentos do crânio.
    4. Levante o tronco cerebral e corte cuidadosamente as meninges e nervos cranianos até que o cérebro está completamente fora do crânio.
      Nota: Todos os passos descritos em 5.1 devem ser realizados em condições assépticas rigorosas em uma armário de biossegurança.
  2. Incorpore o cérebro em 4% baixo ponto de fusão ponto de agarose para corte.
    1. Encha um prato de petri 35mm com a solução de agarose preparada acima (mantido líquido a 42 ° C).
    2. Transferi rapidamente um cérebro de electroporated para o prato cheio de agarose utilizando a pipeta de transferência previamente cortados. Mantenha o prato à temperatura ambiente.
    3. Misture o agarose com uma vara de metal para manter o cérebro no meio do poço (para evitar o afundamento) e posicionar o cérebro em um avião rostro-caudal paralelo ao prato. Pare de mexer quando a agarose começa a solidificar, para evitar danos cerebrais.
    4. Use uma lâmina de barbear para cortar o agarose que envolvem o cérebro a fim de formar um bloco retangular, deixando uma margem de 1-2 milímetros ao redor do cérebro. Certifique-se de que a parte rostral do cérebro é perpendicular ao limite anterior do bloco para facilitar a orientação para as etapas subsequentes de corte.
    5. Repita para cada cérebro.
      Nota: É possível cortar mais do que um cérebro de cada vez (máximo 3) por moldar blocos separados de agarose ao definir cada cérebro em alturas diferentes.
  3. Vibratome secções coronais e cultura de fatia.
    1. Descongelar uma alíquota de 100 X N-2 complementar (150 µ l) no gelo e adicionar 15 mL meio de cultura aliquotadas sob condições estéreis.
    2. Transferi 750 µ l de meio de cultura (com 1 suplemento de X N2) para cada poço de uma placa de cultura de 6-poços.
    3. Com uma pinça curvada, coloque um insert de cultura celular (30 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,4 µm, PTFE) em cada meio-cheio bem.
    4. Encha a banheira de vibratome com ACSF continuamente oxigenado. Refrigerar a 4 ° C com gelo em torno da banheira, ou usar um vibratome refrigerado.
    5. Defina a velocidade de vibratome para 0,150 mm/s e a frequência de 80 Hertz.
    6. Cole o bloco de agarose na plataforma vibratome, borda rostral virado para baixo e ventral borda voltada para o usuário.
    7. Corte o cérebro em secções coronais para obter 250 µm de espessura seções (a 4 ° C).
    8. Com espátulas esterilizadas, recolha seções de 2-3 que contém a MGE e lugar de inserir todas as seções do cérebro de um animal em uma única membrana de 30 mm, cuidadosamente evitando sobreposição entre seções. Coloque a inserção em um poço de uma placa de cultura de 6-bem (contendo 750 µ l de meio de cultura complementado, como descrito acima). Alternativamente, cada seção pode ser colocada em uma membrana separadas-13 mm de diâmetro em uma placa de cultura 12-bem preenchida com 500 µ l completado meio de cultura. A quantidade de meio de cultura recomendado para cada poço permite que as seções do cérebro para ser alimentada pelos meios de comunicação, sem estar submerso.
      Nota: Os passos descritos em 5.3.6 e 5.3.7 não se realizam em condições estéreis completas, a menos que o vibratome pode ser esterilizado e usado em uma armário de biossegurança. Portanto, é crucial realizar estes passos cuidadosamente para evitar qualquer contaminação. Equipamentos de proteção adequado (máscara de limpeza, luvas cirúrgicas e jaleco) devem ser usado em todos os momentos e partes do corpo, mesmo coberto, tais como cabelo, rosto e mãos, nunca deve passar sobre placas de cultura (com ou sem meio de cultura). Também é recomendável para pulverizar o etanol a 70% com frequência nas luvas e espátulas usadas para coletar as seções do cérebro.
    9. Coloque a placa de cultura numa incubadora estéril ventilada a 37 ° C, com 60% de umidade e 5% de CO2 por 48 ou 72 h.
      Nota: Nestes tempos de incubação foram otimizados para Time-Lapse imaging da MGE-derivado INs e imagem latente confocal de fatias fixas, respectivamente. Tempos de incubação ideal devem ser testados previamente para cada desenho experimental. Além disso, se a incubação escolhida é 72 h e sob, não há nenhuma necessidade de mudar o meio de cultura. Para tempos mais longos de incubação, o meio de cultura deve ser mudado a cada 2-3 dias.
    10. Após o tempo de incubação desejado, transferir as seções de interesse para uma lamela 8-septadas e adicionar 3 a 5 µ l de meio de cultura. Lugar da lamela em uma câmara ambiental (37 ° C, umidade de 60%, 5% CO2) conectada a um invertido girando o disco confocal, equipado com um software de aquisição assistida por computador para a configuração da sessão de imagens lapso de tempo.
      Nota: Como alternativa, seções podem ser corrigidas com paraformaldeído 4% (durante a noite a 4 ° C ou 2 h à temperatura ambiente) e, posteriormente, immunostained com anticorpos diferentes para visualização das características morfológicas do electroporated INs sob um confocal microscópio. Embora eGFP e mCherry podem ser visualizados por microscopia confocal sem qualquer procedimento contra-coloração, recomendamos a realização de imuno-histoquímica contra GFP e mCherry para melhorar o sinal, desde que o processo de fixação pode reduzir fluorescência, reduzindo a detecção de componentes mais finos dos neurônios embrionários, tais como galhos menores nos processos à direita ou à esquerda.

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Resultados

Nesta seção, nós fornecemos resultados representativos obtidos seguindo o electroporation ex utero de um plasmídeo de controle, ou um plasmídeo experimental visando um gene de interesse, a MGE de embriões de rato e13.5 seguido por organotypic fatia de culturas incubadas a 37 ° C por 48 h (para a imagem latente de lapso de tempo) ou 72 h (para fixação e rotulação de imuno-histoquímica) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Exemplos representativ...

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Discussão

Neste artigo, nós fornecemos um método confiável para a realização de ex utero electroporation do mouse MGE no e13.5 e para a geração de organotypic culturas de fatias do cérebro embrionário. Embora em vitro métodos, tais como o ensaio de câmara de Boyden, são relativamente fáceis de executar e podem ser usados para avaliar as funções específicas de diferentes genes e proteínas, sem a interferência de outros fatores, eles impedem a investigação de IN dinâmica de migração em relação à direcionalidade e m...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar. As opiniões aqui expressadas não representam necessariamente as opiniões do Ministro da saúde ou o governo do Canadá.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fundação Savoy e a Fundação de epilepsia de cura de funcionamento e pelo equipamento concede da Fundação Canadense para a inovação de urgência (microscópio confocal) e G.H (microscópio confocal de disco girando). PS. recebe um prémio de carreira do de Fonds recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award), bem como dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR; Prêmio jovem investigador). G.H. é uma professora sênior do FRQ-S. L.E é o destinatário do prêmio Steriade-Savoy formação pós-doutoral da Fundação Savoy, o prêmio de treinamento pós-doutorado de CHU Sainte-Justine Foundation e o prêmio de formação pós-doutoral FRQ-S, em parceria com a Fundação de estrelas. Este projeto foi tornado possível pelo cérebro Canadá através do fundo de investigação do cérebro de Canadá, com o apoio financeiro da saúde do Canadá, atribuído a L.E.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio neurobasalThermoFisher Scientific21103049Meio de cultura específico para neurônios disponível comercialmente. Formulação completa disponível neste site: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
suplemento sem soro B-27ThermoFisher Scientific1750404450X Suplemento específico para neurônios sem soro
15 mL tubos de centrífuga estéreisSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Médio (+ L-Glutamina)ThermoFisher Scientific11415064Meio de cultura de base neural disponível comercialmente suplementado com aminoácidos, vitaminas e sais inorgânicos. Formulação completa disponível no site do distribuidor
L-GlutaminaInvitrogen25030-081
Soro de cavalo, inativado pelo calorMillipore-SigmaH1138-500ML
Suplemento neurocell N-2 100XWisent305-016Formulação N-2 de Botteinstein
VWR Garrafas de mídia PETG quadradas 125 mLVWR89132-062
Classe II Tipo A Gabinete de biossegurançaNuaireNU-540
SacaroseBioShopSUC700.1
Cloreto de SódioBioShopSOD001.1
Bicarbonato de SódioThermoFisher ScientificS233-500
D+ glicoseMillipore-SigmaG7528-250G
Cloreto de PotássioThermoFisher ScientificP217-500
Fosfato de sódio monobásico anidroBioShopSPM400.500
Cloreto de cálcio di-hidratado ThermoFisher ScientificC79-500
Sulfato de magnésio heptahidratadoBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
Tubos de centrífuga estéreis de 50 mLSarstedt62.547.004
Tubos de centrífuga de 1,5 mLSarstedt72.690.001
P-97 Extrator de micropipeta flamejante/marromSutter Instrumentos Co.Modelo P-97
0,4 mm I.D. x 75 mm Tubo capilarDrummond scientific1-000-800/12
EtanolVWRE193
Seringa de 5 mLBecton Dickinson & Óleo Mineral Co309646
(pesado)Pinça Suíça Rougier Pharma
WPI #5World Precision Instruments50451111 cm, reta, pontas de 0,06x0,07mm, antimagnéticas. Você precisará de 2 desses.
Pinças Suíças WPI #7World Precision Instruments50450411,5 cm, 0,18x0,2mm, pontas curvas
Pinças HTCWorld Precision Instruments50461711 cm, Reta, plana
Tesoura de operaçãoWorld Precision Instruments50122516 cm, Afiada/afiada, reta. Você precisará de 3 desses.
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Iris ForcepsWorld Precision Instruments50447810,2 cm, curva completa, serrilhada
Pinça de Tecido DeBakeyWorld Precision Instruments50199615 cm, ângulo de 45°, Mandíbula Delicada, 1,5mm de largura
Microespátula Fisherbran com extremidades arredondadasFisherScientific21-401-5Você precisará de 2 desses.
Injetor de Auto-Nanolitro Nanoject IIPrato TC Drummond scientific3-000-204
60, PadrãoSarstedt83.3901Prato de 60 mm Prato de
cultura de tecidosSarstedt83.1800Prato de 35 mm
Cera PretaFisherScientificS17432
Pipetas de transferência Ultident170-CTB700-2123 mL, pequeno bulbo
Leica Biosystems LeicaM80Em substituição ao nosso estereomicroscópio que foi descontinuado pelo fabricante (StereoMaster da FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & amp Micrótomo
Leica BiosystemsVT1000S
GEM, lâmina de barbear de borda únicaMicroscopia Eletrônica Sciences71952-10Remova a extremidade cega antes de inserir no espaço designado da lâmina do vibratome
µ-Slide 8 poçoIbidi80827Pacote de 15
Insertode cultura de células MillicellMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, PTFE hidrofílico, 0.4 µ m pore, pacote de 50. 
Microscópio Leica DMi6000Leica MicrosystemsN/A
Cabeça confocal de disco giratório Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Software de aquisição Volocity 6.0Improvision/Perkin ElmerN/A
Sistema de incubação de palco LiveCell topDispositivos de patologiaLC30030Fornece controle de temperatura, CO2 e umidade. 
Microscópio confocal SP8Leica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Presente de Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25GFrasco de 25G, certificado pela Comissão de Coloração Biológica
Microscópio Estéreo de de lâmina vibratória Leica VT1000S Co 305127

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