Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

Summary

Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.

Abstract

Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d⁺Lamp1⁺ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.

Introduction

Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células^1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincu....

Protocol

Protocolos humanos neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati, e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. Amostras de sangue de doadores saudáveis foram obtidas do centro Hoxworth de sangue no centro médico da Universidade de Cincinnati.

1. Transcriptomic de criação de perfil de expostos a poluentes derivados de monócitos humanas DCs

1. Extração de RNA total de DCs BaP-expostos
   1. Diferenciar humanos DCs usando citocinas GM-CSF e IL-4 e expor DCs para BaP para 4 dias¹³.
   2. Classifi....

Results

Os poluentes lipofílicos BaP altera aglomerados endocítica gene humano DCs. humanos derivados de monócitos DCs de cada doador (n = 3) foram incubadas com BaP e classificados para DCs convencionais, que foram mais utilizados para a análise do RNA extração e transcriptomic conforme descrito . Após a normalização da expressão gênica, genes alterados entre grupos BaP-expostos e não-expostos foram agrupados de acordo com a correlação funcional de genes diferencialmente expressos. Nós de entrad.......

Discussion

Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confocal forneceu an.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transcriptômica	Illumina	HiSeq 2500 v4	Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Citometria de fluxo de imagem
mirVana miRNA Kit de isolamento	Thermo Fisher		Extração total de RNA
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Análise de controle de qualidade de RNA total
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher		PCR, reação enzimática
NEBNext Poly(A) mRNA Módulo de Isolamento Magnético	Purificação de RNA PolyA	New England Biolab
Sistema Apollo automatizado SMARTer	Purificação de RNA PolyA	Takara
NEBTamp Ultra RNA Kit de Preparação para Biblioteca para Illumina	New England Biolab		Preparação da Biblioteca
Agencourt AMPure XP contas magnéticas	Purificação de DNA Beckman Coulter
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, análise de distribuição de tamanho
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, análise de distribuição de tamanho
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Quantificação	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Quantificação
da bibliotecacBot	Illumina		Library geração de cluster
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – Geração	Illumina		Library
HiSeq 1000	Sequenciamento Illumina
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 ciclos)	Sequenciamento Illumina
Ficoeritrina/Cianina 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Violeta brilhante 421	Bio Legenda	L161
PE-anti-mouse IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)