É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

6.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/57528

⸱

29 de outubro de 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.

Resumo

Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d+Lamp1+ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.

Introdução

Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincular um peptídeo curto (resíduos de 8-10) no retículo endoplasmático para ativar o CD8 convencional+ T células, enquanto moléculas de MHC classe II vincular um relativamente mais peptídeo (~ 20 resíduos) em compartimentos endocítica para ativar convencional CD4 células de+ T1,4. Em contraste, as células T de lipídios específicos são ativadas por proteínas CD1 com antígenos lipídicos carregados principalmente em compartimentos endocítica5,6. Apresentação de antigénios de lipídios requer o fornecimento de lipídios metabolitos produzidos no metabolismo lipídico7,8,9,de10 e o carregamento de metabólitos de lipídios funcionais para CD1 proteínas em compartimentos endocítica5,6. Neste contexto, diversos fatores celulares modulando a apresentação de antigénios de lipídios, especialmente na exposição ambiental de poluentes lipofílicos e distúrbios imunológicos, são essenciais para ser definido. Neste estudo, usamos transcriptomic análise, imagem de perfil e análise de imagens celular e populacional de DCs derivados de monócitos humanos para determinar a proteína endocítica tráfico contribuindo para apresentação de antigénios de lipídios na exposição de poluentes. Certamente, esta plataforma combinada pode ser aplicada para estudar proteínas subcellular tráfico e colocalization em diferentes processos biológicos.

Tecnicamente, a Localização subcellular da proteína geralmente foi demonstrada usando microscopia confocal e analisados estatisticamente em um número limitado de células detectado1,2,3,11. Além disso, citometria de fluxo tem sido amplamente aplicada a populações de células de portão com sinais co manchadas de múltiplas proteínas em um nível celular12; no entanto, este não possui uma visualização detalhada de colocalization Subcellular da proteína. Para realizar análises abrangentes e estatísticas de colocalization de proteína percentagem a nível celular e população, podemos incorporar imagens de perfis e análise de abordagens para determinar as características de colocalization de proteína com biológico relevância. Especificamente, nós usamos a citometria de fluxo de imagem para detectar o colocalization de CD1d e proteína de membrana lisossomal-associado 1 (Lamp1) proteínas neste estudo. Análise quantitativa de moléculas colocalized anteriormente era difícil a ser realizada em escala populacional. Neste estudo, adaptamos o programa ImageJ-Fiji para examinar a porcentagem de colocalization de proteína com um grande número de células coradas co nível populacional e individual celular. Especificamente, Nós medimos áreas co localizadas, intensidade e tamanho populacional para apoiar a conclusão de que a proteína CD1d em grande parte foi mantida em compartimentos endocítica atrasados do DCs humanas em exposição a um poluente lipofílicos benzo [a] pireno (BaP),13 . Este celular combinada e população de análise de imagem fornecidos resultados altamente reprodutíveis, abrangentes e estatisticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalization relevante para a apresentação de antigénios de lipídios inibida.

A transcriptoma do BaP-expostos DCs humanos fortemente apoiado a hipótese de que o metabolismo lipídico endocítica e CD1d endocítica tráfico foram prejudicadas em exposição BaP. Para testar esta hipótese, nós aplicamos a citometria de fluxo de imagem para o perfil de imagens da população de DC que co estavam manchadas com várias proteínas, incluindo CD1d, marcadores endocítica e marcadores de DC. Finalmente, as células co manchadas foram analisadas estatisticamente para demonstrar o percentual de intensidade e áreas de colocalization CD1d e Lamp1.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Protocolos humanos neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati, e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. Amostras de sangue de doadores saudáveis foram obtidas do centro Hoxworth de sangue no centro médico da Universidade de Cincinnati.

1. Transcriptomic de criação de perfil de expostos a poluentes derivados de monócitos humanas DCs

  1. Extração de RNA total de DCs BaP-expostos
    1. Diferenciar humanos DCs usando citocinas GM-CSF e IL-4 e expor DCs para BaP para 4 dias13.
    2. Classificar o BaP-expostos DCs usando citometria de fluxo com base em marcadores de superfície expressadas (linhagem–HLA-DR.+), a maioria dos quais consiste em DCs convencionais (CD11c+CD1c+)13. Normalmente, classificar 10.000 DCs em meio de cultura contendo 10% FBS, centrifugar DCs a 600 x g e 4 ° C por 6 min e imediatamente remover o sobrenadante por aspiração usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
    3. Uma vez que o sobrenadante é removido por aspiração, lyse o centrifugado adicionando 0,4 mL de tampão de Lise/ligação do kit de isolamento de RNA para armazenamento em-80 ° C antes de extração do RNA.
    4. Use o kit de isolamento de RNA com o protocolo de extração de RNA total para extrair o RNA total14. Medir a integridade do RNA usando um Bioanalyzer15.
  2. Transcriptomic análise de DCs classificadas (figura 1A)
    1. Preparamos a biblioteca usando um kit de preparação de biblioteca de RNA RNA-seq. Em suma, fragmentar o RNA poli-A isolada (~ 200 bp), reverso transcrever os fragmentos para o 1º strand do cDNA e siga pela síntese do cDNA segunda vertente rotulada com dUTP.
    2. Ligate cDNA fita dupla para o adaptador com uma estrutura de Hairpin loop após a purificação do grânulo, fim-reparação e dA-tailing. Retirar os resíduos de uracil em strand 2º do cDNA e adaptador loop com enzima usuário (Reagente de excisão Uracil específicos) para manter a especificidade de vertente e abrir o loop de adaptador para o PCR.
      1. Execute 13 ciclos de PCR utilizando primers universais e índice específico para enriquecer a biblioteca indexada. Limpar a biblioteca e executar em um chip Bioanalyzer DNA alta sensibilidade para verificar a qualidade da biblioteca e distribuição de tamanho.
    3. Utilize um kit de quantificação de biblioteca e um sistema PCR em tempo real combinadas com informações de tamanho biblioteca para calcular biblioteca concentração através de um método da curva padrão.
    4. Proporcionalmente piscina individualmente indexadas bibliotecas compatíveis e ajustar a concentração total final para 15 pM. Executar a geração de aglomerado de biblioteca e sequenciar biblioteca em uma configuração de leitura única 1 x 50 bp para gerar 25 milhões leituras por amostra.
  3. Sequenciamento
    1. Carrega o sequenciamento e indexação reagentes para racks de reagente o SBS e PE, respectivamente. Coloque os reagentes num banho de água da série laboratório por 1h até todo o gelo derreteu e os reagentes em cada frasco/tubo são misturados adequadamente.
    2. Preparar a mistura ICB, adicionando a enzima descongelada de tintura e -20 ° C para a garrafa e misture. Prepare uma solução de NaOH de acordo com as instruções de sequenciamento. Coloque todos os reagentes a 4 ° C até que esteja pronto para usar.
    3. Durante a 1 h, período, esperando poder sobre o sequencer. Espere que a unidade DONOTEJECT para aparecer e conecte o computador a uma unidade de rede.
    4. Inicie o software de controle de sequenciador.
    5. Prepare-se 2 L de solução que contém 0,5% de Tween 20 e 0,03% manutenção de água de 300 no laboratório-grau ProClin.
    6. O rack de reagente SBS, adicione ~ 100 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos 8 garrafas e tampas de funil para as garrafas. O rack de reagente de PE, adicionar ~ 12 mL da solução de lavagem de manutenção a cada um dos dez tubos 15ml cónico e descartar as tampas.
    7. Carrega os dois racks com os solução enchido garrafas/tubos para o sequencer.
    8. O software de controle de sequenciador, escolha a lavagem de manutenção; Siga as instruções na tela para limpar o sistema sequenciador de fluido até que o processo seja concluído.
    9. Iniciar um novo executado na guia "Sequência" de software; Direcione a saída de dados para uma unidade de rede. Escolha os parâmetros para leitura única 1 x 50 bp com bibliotecas de índice único multiplexado.
    10. Opcionalmente, logar o Hub de sequência de BaseSpace, para que o status de sequenciamento pode ser monitorado remotamente através de um computador ou telefone inteligente.
    11. Carregar uma folha de amostra para demultiplexação e fornecer informações de reagente de acordo com a exigência do software.
    12. Carregar os reagentes SBS e PE para o sequencer. Encha o sistema com uma célula de fluxo usado (~ 15 min).
    13. Uma vez concluída a geração de cluster (~4.5 h), tirar a célula de fluxo, Borrife levemente a célula de fluxo com água e limpe seco usando papel de lente. Levemente pulverizar a célula de fluxo com etanol a 95% e limpá-lo seco. Verifique contra a luz para certificar-se que a superfície esteja limpa sem detritos ou resíduos de sal.
    14. Depois de concluída a etapa Prime, a célula de fluxo em cluster de carga e iniciar o sequenciamento. O software visualizador de análise de sequência será automaticamente iniciado.
    15. Monitore a qualidade de dados de sequenciamento através de SAV incluindo densidade do aglomerado, filtro de passagem de leituras, cluster pass filtro %, ≥Q30%, legado fase/prófase %, QC, etc , o que ajuda a compreender a qualidade de dados e solucionar problemas de indexação.
    16. Alterar a vedação da célula de fluxo e realizar uma lavagem de manutenção após a conclusão do sequenciamento. O sequencer está pronto para a próxima corrida.
  4. Análise de Bioinformatic
    1. Execute a bioinformática de análise de dados de RNA-seq13.

2. via análise de perfis de Transcriptomic (figura 1B)

  1. Use um edgeR Bioconductor comparar contagens de intensidade de expressão de gene resultante entre DCs BaP-expostos e não-expostos de três doadores. Em seguida, identificar genes diferencialmente expressos entre DCs BaP-expostos e não-expostos, baseados na mudança da dobra absoluto (> 2 dobras) e a descoberta de falsa valores (FDR) - ajustado p- a taxa (< 0,05).
  2. Para prever os clusters funcionais de diferencialmente expressos genes, usar o pacote de software ToppCluster para pesquisar os genes alterados contra vários bancos de dados, incluindo KEGG e REACTOME e gerar dados de clusters. ToppCluster usa o teste hipergeométrica para obter enriquecimento funcional através de de análise do gene lista enriquecimento16.
  3. Entrada mais os resultados destes clusters de função para Cytoscape17,18 versão 3.3.0, uma plataforma de software de código aberto amplamente utilizado para a visualização de redes complexas. Assim, os genes envolvidos em diferentes clusters ou caminhos, incluindo clusters endocítica e metabolismo de lipídios, são mostrados em uma rede com anotação de cor de dobra em média a alteração de gene expressão (figura 1B)13.

3. citometria de fluxo de CD1d e Lamp1 Colocalization de imagem

  1. Anticorpo de rotulagem de DCs BaP-expostos
    1. Expor 0,5 x 106 humanos DCs para 5,94 mM de BaP de 4 dias a 37 ° C em 2 mL de Dulbecco completa meio modificado da águia. Colheita DCs por centrifugação a 400 x g durante 10 min. bloco as DCs diferenciadas incubando células com bloqueador de soro humano e anticorpos do receptor Fc anti-humanos por 10 min no gelo, incluindo anticorpos CD16, CD32 e CD64 anti-humanos.
    2. Incubar a violeta brilhante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/cianina tingir 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR e PE/Cy5-anti-CD11c com DCs por 20 min no gelo. A tabela 1 mostra esta lista de anticorpos.
    3. Conserto DCs com paraformaldeído 4% em PBS e permeabilize-los com permeabilização de tampão de lavagem. Executar a coloracao intracelular com uma mistura de PE-rotulado purificada anti-humano CD1d (51,1) e Alexa Fluor 647-rotulado anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. Medição de citometria de fluxo (Figura 2) de imagem
    1. Analise as amostras coradas utilizando um citômetro de fluxo da imagem latente para o núcleo de citometria de fluxo do Hospital infantil de Cincinnati, usando um objectivo X 40 para produzir 300 pixels para uma cela com cerca de 10 mm de diâmetro. Tamanho de um pixel é aproximadamente 0, 5mm por 0,5 mm do objeto.
    2. Adquirir 10.000 imagens celulares de forma imparcial, de acordo com as instruções do fabricante.

4. análises de imagens de citometria de fluxo de imagem.

  1. Análise de colocalization usando software de ideias (Figura 2)
    1. Realizar a compensação com single-manchado contra amostras não manchadas, definindo a intensidade de fluorescência das amostras não coradas abaixo do limiar, incluindo não-coradas DCs BaP-expostos com autofluorescência de BaP, como dados de citometria de fluxo rotina análise.
    2. Portão, corado células para obter os subconjuntos de HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ células (Figura 2A) e mostrar imagens de celular em subconjuntos fechados (Figura 2B).
    3. Salve imagens de celular em formato png com base em dois critérios técnicos de inclusão, a presença visual de sinais fortes co manchadas e Localização subcellular das proteínas CD1d e Lamp1, para as análises de colocalization usando o ImageJ-Fiji (Figura 2B).
  2. Use o software ImageJ-Fiji para executar análise colocalization (Figura 3).
    1. Prepare os arquivos de imagem de entrada mesclando as 100 imagens de célula salvo para DCs humanos não-expostos e BaP-expostos, respectivamente (Figura 3A).
    2. Analisar CD1d (vermelho) e Lamp1 colocalization (verde), usando um gráfico de dispersão.
      1. Execute programa ImageJ-Fiji. Abra o arquivo. png com 100 imagens de célula (Figura 3B e Figura 4A): "arquivo | Abra".
      2. Dividir a imagem com canais de vermelho e verdes mesclados em duas imagens com um vermelho ou um canal verde: "imagem | Cor | Dividir canais".
      3. Desenhar um gráfico de dispersão usando os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Salve o gráfico de dispersão usando a tecla "PrintScreen" .
    3. Calcular os coeficientes de colocalization do Mander para cada imagem de celular única (n = 100) (Figura 4B)
      1. Selecione uma imagem única célula no arquivo de imagem com separação de canais usando o "Oval" ferramenta de seleção.
      2. Use os comandos "Analyze | Colocalization | Limiar de colocalization". Selecione "Canal 1" da caixa de diálogo da região de interesse (ROI). Manter todas as opções de cálculo, incluindo "Mander usando limiares" para cada imagem de célula.
      3. Repita esse cálculo para todas as imagens de 100 células.
      4. Salvar e abrir os resultados usando uma folha de cálculo.
      5. Plotar a média e erros-padrão para "Coeficientes de Mattos thresholded" (n = 100, 0 significa nenhum colocalization e 1 significa colocalization perfeito). Use o teste t de Student para calcular o valor de p para a comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4B).
    4. Calcular a porcentagem da intensidade thresholded pixel co localizada entre CD1d e Lamp1 para várias imagens de célula (n = 100) (Figura 4).
      1. Usar o mesmo protocolo de análise em 4.2.3 e além disso, selecione a opção de resultado "% intensidade limiar colocalized".
      2. Realizar esta análise juntamente com coeficientes de colocalization do Mattos.
      3. Da mesma forma, traça a média e erros-padrão para a intensidade de % colocalized entre CD1d e Lamp1. Use o teste t de Student para calcular o valor de p para comparação entre grupos BaP-expostos e não-expostos (Figura 4).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Os poluentes lipofílicos BaP altera aglomerados endocítica gene humano DCs. humanos derivados de monócitos DCs de cada doador (n = 3) foram incubadas com BaP e classificados para DCs convencionais, que foram mais utilizados para a análise do RNA extração e transcriptomic conforme descrito . Após a normalização da expressão gênica, genes alterados entre grupos BaP-expostos e não-expostos foram agrupados de acordo com a correlação funcional de genes diferencialmente expressos. Nós de entrad...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confocal forneceu an...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Os autores agradecer Robert Giulitto (centro de sangue de Hoxworth) para amostras de sangue humano e Dr. Liang Niu para a normalização da expressão do gene lê. Agradecemos também a concessão de apoio do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (ES006096), centro de genética ambiental (CEG) projecto-piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (AI115358) (Samba), Universidade de Prêmio de Cincinnati University Research Council (S.H.) e Universidade de Cincinnati College de medicina núcleo realce do financiamento (X. Z.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TranscriptômicaIlluminaHiSeq 2500 v4Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream XMillipore100220Citometria de fluxo de imagem
mirVana miRNA Kit de isolamentoThermo FisherExtração total de RNA
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilentAnálise de controle de qualidade de RNA total
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermo FisherPCR, reação enzimática
NEBNext Poly(A) mRNA Módulo de Isolamento Magnético Purificação de RNA PolyANew England Biolab
Sistema Apollo automatizado SMARTerPurificação de RNA PolyATakara
NEBTamp Ultra RNA Kit de Preparação para Biblioteca para IlluminaNew England BiolabPreparação da Biblioteca
Agencourt AMPure XP contas magnéticasPurificação de DNA Beckman Coulter 
2100 BioanalyzerAgilentLibrary QC, análise de distribuição de tamanho
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilentLibrary QC, análise de distribuição de tamanho
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)QuantificaçãoThermo Fisher
NEBNext Library Quant KitNew England BiolabQuantificação
da bibliotecacBotIlluminaLibrary geração de cluster
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – GeraçãoIlluminaLibrary
HiSeq 1000Sequenciamento Illumina
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 ciclos)Sequenciamento Illumina
Ficoeritrina/Cianina 7 (PE/Cy7)Bio LegendL243
Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)Bio Legend3.9
Violeta brilhante 421Bio LegendaL161
PE-anti-mouse IgG2bBio Legend51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)Bio LegendCD107a(H4A3)
da da da Library de cluster HS

Referências

  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
  3. Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
  4. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
  5. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  6. Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
  7. Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325(2009).
  8. Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
  9. Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
  10. de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
  11. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
  12. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  13. Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085(2017).
  14. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  15. Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
  16. Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
  17. Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
  18. Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
  19. Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
  20. Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594(2016).
  21. Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
  24. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  25. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
  26. Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Colocalização de Proteínas EndocíticasExposição ao Benzo[a]pirenoCélulas Dendríticas HumanasAnálise do Coeficiente de ManderSequenciamento de RNAImageJ FijiSoftware IDEAS
Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.