Artigo de método

Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA

DOI:

10.3791/57530

⸱

11 de maio de 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

Neste artigo

Resumo

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Vários oligonucleotídeos antisenso (AONs) foram mostrados para induzir exon inclusão (modulação da tala) e resgatar a expressão SMN para atrofia muscular espinhal (SMA). Aqui, descrevemos um protocolo para lipotransfection AON induzir inclusão exon do gene SMN2 e os métodos de avaliação para determinar a eficácia em pacientes fibroblastos SMA.

Resumo

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Atrofia muscular espinhal (SMA), uma doença neurológica letal causada pela perda de SMN1, apresenta um caso único no campo do oligonucleotide antisentido (AON)-mediada por terapia. Enquanto SMN1 mutações são responsáveis pela doença, AONs tala intrônicas silenciador (ISS) em sítios em SMN2, incluindo nusinersen aprovado pela FDA, foram mostrados para restaurar a expressão SMN e amenizar os sintomas. Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON direcionamento SMN2 que pode ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação em vitro de exon inclusão usando lipotransfection de AONs seguido por reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e mancha ocidental. Esse método pode ser empregado para vários tipos de produtos químicos da AON. Usando esse método, demonstramos que AONs composto de alternadas (LNAs) os ácidos nucleicos bloqueados e nucleotídeos do DNA (LNA/DNA mixmers) levam a eficiente SMN2 exon inclusão e restauração da proteína SMN em uma concentração muito baixa e portanto, LNA / Oligonucleotides antisentido baseado em mixmer de DNA podem ser uma estratégia terapêutica atraente para tratar a emenda defeitos causados por doenças genéticas. O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs romance.

Introdução

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Atrofia muscular espinhal (SMA) é uma desordem neuromuscular fatal herdada em um padrão autossômico recessivo. É caracterizado pela degradação dos neurônios motores e tronco progressivo e21,paralisia do músculo membro. A maioria das ocorrências de SMA são devido a uma mutação homozigótica no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1)3. O gene de sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) é uma duplicata inversa de SMN1e tem uma sequência praticamente idêntica, diferindo por apenas cinco bases4,5. Uma transição de C-a-T em SMN2 localizado no exon 7 faz o gene quase não funcionam porque a mutação leva o essencial exon 7 sendo excluídos em quase 90% de SMN2 transcrições (Figura 1um). MRNAs SMN2 faltando exon 7 não pode compensar a função SMN1 porque seu produto proteico é instável e é rapidamente degradado.

Terapia antisentida recentemente emergiu como uma estratégia promissora para o tratamento de SMA6. A recente aprovação de nusinersen por o E.U. Food and Drug Administration (FDA) disponibilizou o primeiro medicamento para o tratamento de SMA7. Nusinersen é uma 18-mer antisentido oligonucleotide (AON) com uma modificação de 2 '-O-metoxietílico (MOE) e um backbone phosphorothioate. A droga alveja o silenciador emenda intrônicas N1 (ISS-N1) localizado no intron 7 do gene SMN2 . Ligação de nusinersen de ISS-N1 promove a recuperação funcional expressão de proteína SMN completos do gene SMN2 endógenos induzindo exon 7 inclusão (Figura 1um)8,9,10 . Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON que podem ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Foi demonstrado que AONs com outros químicos induzem também eficientemente exon inclusão em SMN2 exon 7 tanto in vitro e in vivo11,12,13.

Ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) são modificados quimicamente análogos de RNA contendo uma ponte metileno conectando ocarbono 4 ' - com o 2 ' -oxigênio dentro da estrutura (Figura 1b) de furanose14,15. Em comparação com DNAs ou RNAs, LNAs têm uma maior afinidade para ligação a sequências de RNA complementares e têm o benefício adicionado de ser altamente resistente à nucleases endógenas. A química do LNA foi aplicada para uso como sondas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e qPCR16,17. Além disso, é utilizado para regular a expressão gênica tanto in vitro e in vivo. GapmeR AONs são uma combinação de moléculas de ADN single-stranded, ladeado por vários LNAs nas extremidades 5 ' e 3 '. Eles Derrubem a expressão gênica por ligação complementares de mRNAs alvo, levando-os a ser degradada por RNase H registrados18. LNA/DNA mixmers são AONs que são compostas de nucleotídeos do DNA integrados entre LNAs. Apresentados na presente orientação eles podem vincular miRNA para inibir sua função (LNA-antimiR)19. Alguns LNA-antimiRs atingiram o desenvolvimento clínico. Para exemplos, miravirsen (AntimiR-122) é um LNA-antimiR que inibe a miR-122 para tratar a infecção da hepatite C e vários ensaios clínicos de fase II estão actualmente em curso19,20. Recentemente, foi demonstrado que o LNA/DNA mixmers também pode modular21o splicing de RNA. Pode ligar uma sequência específica de mRNA e induzir exon saltando na inclusão de mRNA e exon distrofina em SMN2 mRNA em vitro13,22.

Neste artigo, descrevem uma metodologia para a indução do exon inclusão usando AONs e a avaliação de eficácia a nível do RNA e proteína. Para exemplificar este método, usamos o LNA/DNA mixmers direcionamento ISS-N1 no intron 7 de SMN2. AONs transfectadas em SMA pacientes células por lipotransfection induziram exon 7 inclusão no final SMN2 transcrição e upregulation de produção de proteína SMN. Uma das vantagens de usar o LNA/DNA mixmers para induzir a exon inclusão é que a concentração eficaz para o transfection é significativamente menor do que outros produtos químicos13. Esse método pode ser usado para muitos outros AONs exceto phosphorodiamidate Morpholinos oligómeros (PMOs), que, devido a sua carga neutra, precisam inserir células através de endocitose induzida pelo reagente de transfeccao co Endo-Porter.

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Protocolo

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1. cultura de pilha

  1. SMA de cultura de fibroblastos paciente no meio de crescimento (Dulbecco modificado águia médio 1:1-12 (presunto) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,5% penicilina/estreptomicina) numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
  2. Determinar a concentração de células usando um contador de célula automatizada e diluir as células a 1 x 105 células/mL no meio de crescimento, em seguida, sementes no prato apropriado. Use placas boas 12 (1 mL por bem) por RT-PCR ou qPCR.
  3. Incubar as placas por 24 h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.

2. transfecção de mixmer LNA/DNA

  1. Certifique-se de confluência de célula de cerca de 65-80% de eficiência optimal do transfection.
  2. Descongele a 10 μM LNA/DNA mixmers lentamente no gelo.
  3. Em um tubo de 1,5 mL, prepare uma solução de x mixmer a 20, adicionando o mixmers aos meios privados de soro para que o volume final atinge 50 μL.
  4. Misture a solução de mixmer com 50 μL de meios privados de soro contendo o reagente de Transfeccao de 3% (proporção de 1:1).
  5. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  6. Adicionar 900 μL privado de soro o meio com 5% FBS para cada tubo.
  7. Aspirar a velha mídia da placa e substituir com 1 mL de solução de mixmer LNA/DNA contendo o reagente de transfeccao.
  8. Incube as celulas por 24-48 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 .

3. extração do RNA

  1. Remover o meio e adicione 1 mL do reagente de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio às células. Lave a parte inferior dos bem várias vezes com guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio e recolhê-la nos tubos de 1,5 mL.
  2. Vórtice em alta velocidade por 30 s e loja a-80 ° C durante 1 h ou durante a noite.
  3. Descongele as amostras em temperatura ambiente e vórtice bem.
  4. Adicionar 200 clorofórmio µ l, agitar vigorosamente por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
  5. Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
  6. Recolha a fase aquosa clara superior para um tubo novo. Certifique-se de evitar coletar qualquer a interfase branca que se forma entre as fases superiores e inferiores.
  7. Adicionar 500 µ l isopropanol e 1 µ l 8 µ g / µ l glicogênio (grau de RNA). Vórtice de 10 s e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos ou a-20 ° C durante a noite.
  8. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e remover todo o sobrenadante. Forma a uma bolinha branca na parte inferior do tubo.
  9. Adicionar 1 mL de etanol a 75% frio e centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C.
  10. Retire todo o etanol e seque a pelota à temperatura ambiente até não sobrar nenhuma etanol no tubo.
  11. Dissolva a pelota em 30 µ l DNase/RNase livre água e incubar durante 10 minutos a 60 ° C.
  12. Medir a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (em 260 nm) e ajustar a concentração de RNA para 50 ng / µ l.

4. um passo de RT-PCR para medir a taxa de inclusão exon de SMN2

  1. Mix 12,5 µ l de 2x do amortecedor da reação de RT-PCR, mistura de 1,0 µ l da enzima de RT-PCR de uma etapa, 0,5 µ l de cada primer (SMN2 em frente: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 inverso: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH para a frente: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH inverso: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ l de RNA total (50 ng / µ l), e água destilada, 8,5 µ l de RNase/DNase-livre.
  2. Depois que o cDNA é sintetizado a 50 ° C por 15 min, inicie a reação de PCR. Amplificar o SMN2 exon 6-8 com 30 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 25 s). Amplificar a GAPDH com 20 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 20 s).
  3. Adicionar 5 μL 6 x tintura para o produto do PCR, de carga e carregar 5 µ l da mistura em um gel de agarose 2% e correr por 40 min a 100 V.
  4. O gel de imagem e analisá-lo usando software ImageJ.
  5. Medir a intensidade das bandas completos e bandas Δ7. Calcular a taxa do exon 7 inclusão pelo valor de intensidade de (completos) / (full-length + Δ7 SMN2).

5. quantitativo PCR (qPCR) para medir a taxa de inclusão exon de SMN2

  1. Para a síntese do cDNA, misture 1 µ l Oligo dT, 1 µ l 10mm dNTPs e 11 µ l total do RNA (50 ng / µ l). Incube a 65 ° C por 5 min.
  2. Colocar as amostras no gelo e adicionar 4 µ l 5 x tampão, 1 µ l 0,1 M DTT, 1 inibidor de RNase µ l e o transcriptase reverso 1 µ l de cada amostra.
  3. Incubar a 50 ° C por 60 min e aquecer até 80 ° C por 10 min parar a reação. O cDNA pode ser armazenado a-20 ° C.
  4. Dilua os cDNAs com água livre de RNase (diluição 1:5). Mix 10 µ l 2 x mistura de enzima SYBR Green qPCR, primeira demão de 10 µM cada 0,8 µ l (longa-metragem SMN2 em frente: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', longa-metragem SMN2 reverso: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ′, Δ7 SMN2 em frente: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 inverso: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ′, GAPDH para a frente: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ′, GAPDH inverter: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µ l diluída de cDNA e água livre de RNase a µ l 5.4.
  5. Inicie a reação de qPCR. Use as condições: 95 ° C por 30 s e, em seguida, um ciclo de 40 repita a 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 20 s.
  6. Calcular a expressão relativa de longa-metragem SMN2 para GAPDH ou Δ7 SMN2e normalizar às células não tratadas com o algoritmo ΔΔCt.

6. mancha ocidental

  1. Remover a transfeccao de células e lave uma vez com tampão fosfato salino (PBS).
  2. Adicione 100 µ l amortecedor do lysis com um inibidor da protease.
  3. Separar as células da parte inferior de cada poço com uma espátula de célula estéril e coletar em tubos de 1,5 mL. Incube as amostras no gelo por 30 min.
  4. Passe celular lisado agulha 21-G 10 vezes para esmagar as células.
  5. Centrifugar a 20.800 x g, durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL. A amostra pode ser armazenada em um congelador de-80 ° C.
  6. Determinar a concentração de proteína usando um Kit de ensaio de proteína BCA e ajustar a concentração de 1,0 µ g / µ l.
  7. Mistura de 5 µ l amostras e 5 µ l 2 x buffer de amostra de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) (SDS 10%; 14% 0,5 M solução de Tris-HCl, pH 6.7; 0,5 M 1% com a solução de EDTA-2Na, pH 8.0; 20% glicerol; tintura de azul de bromofenol 0,004%, 5% β-Mercaptoetanol) e aquecer a 70 ° C por 10 min.
  8. Carregar as amostras em um 4-12% proteína Bis-Tris géis e executada por 1h em 150 V.
  9. Molhe um papel de filtro grosso em cada buffer: (buffer de ânodo concentrado: 0.3 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de ânodo: 0,03 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de cátodo: 25 mM Tris, 20% de metanol, o ácido 6-amino-n-hexanoico 40mm, 0,01% SDS).
  10. Mergulhe uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno em metanol por 20 s, em seguida, transferi-lo para o buffer do ânodo.
  11. Equilibrar o gel depois de SDS-PAGE com o buffer do cátodo por 5-10 min sob agitação.
  12. Coloque os papéis de filtro, membranas PVDF e o gel em uma máquina de mancha semi-seca, como segue: concentrado ânodo reserva papel/ânodo reserva papel/PVDF/proteína de membrana gel/cátodo reserva papel (Figura 2).
  13. Cobrir a pilha e iniciar a transferência de 20 V por 30 min.
  14. Após a transferência, enxágue a membrana PVDF com PBST (PBS com 0,05% Tween 20) uma vez.
  15. Bloquear a membrana à temperatura ambiente por 30 min em 5% leite desnatado em pó dissolvido em PBST ou a 4 ° C, durante a noite.
  16. Dilua um anticorpo anti-SMN de rato purificado e um anticorpo anti-Cofilin 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Incube a membrana nele por 1h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
  17. Lavar 3 vezes com PBST por 10 min.
  18. Dilua a anticorpos secundários (anti-rato caprinos conjugados a HRP e anti-rabbit IgG (H + L)) para 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Encube por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  19. Lave a membrana 3 vezes com PBST por 10 min.
  20. Detecta o sinal de banda usando a kit de deteção mancha ocidental de quimioluminescência.

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Resultados

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Usando o pacientes fibroblastos SMA, escolhemos a região de silenciador de ISS-N1 no intron 7 do gene SMN2 com oito mixmers LNA/DNA antisentidos diferentes que foram transfectadas com uma concentração de 5 nM (Figura 3). Cada um do mixmers contido uma espinha dorsal modificada phosphorothioated que lhes permitiu resistir a degradação da nuclease. Para avaliar a eficácia da mixmers, a taxa de SMN2 exon 7 inclusão foi quantificada por RT-PCR e...

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Discussão

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O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs. Este protocolo é amplamente aplicável a exon saltando e inclusão de outros genes e vários tipos de células. Além disso, a maioria dos produtos químicos AON (exceto PMOs) podem transfected usando esse método. AONs pode regular a emenda de pre-mRNA de genes endógenos e artificialmente introduzidos e pode ser co transfectadas com vetores de plasmídeo carregando genes alvo.

Uma e...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecer Nicole McRorie ajuda com os experimentos. Este trabalho foi apoiado pela faculdade de medicina e odontologia, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, institutos canadenses de pesquisa da saúde (CIHR), os amigos de Garrett Cumming pesquisa fundos, HM Toupin neurológico da Universidade de Alberta Fundos de investigação científica, o Canadá de Distrofia Muscular, a Fundação do Canadá para a inovação, Alberta Enterprise e educação avançada e as mulheres e das crianças Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fibroblastos SMACoriell NIGMS repositório de células genéticas humanasGM03813
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher11320033
Soro Fetal BovinoSigma-AldrichF1051
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelhode fenolThermo Fisher25300062
Meios privados de soroReagentede
Fisher Thermo Fisher15338100
tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimersSequência 5' a 3'SMN2
para frente: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 reverso: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH para a frente: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH reverso: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primers
SMN2 de comprimento total para a frente:GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
SMN2 de comprimento total reverso: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH para a frente: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH reverso:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ClorofórmioSigma-AldrichP3803
Glicogênio, grau de RNAThermo FisherR0551
ImageJ Software
Inibidor de coquetel de protease Roche11836153001
Catódico0.025 M Base Tris + 40  mM Ácido 6-aminocapróico + 20%
de tampão0,03 M Base de Tris + 20%
de tampão0,3 M de base de Tris + 20% de metanol
Beta mercaptoetanol Membrana MilliporeES-007-E
PVDF GE10600021
Tampão de carregamento/amostra para Western blottingNuPage InvitrogenNP007
One-Step RT-PCR kit Qiagen 210210
dNTPsClontech3040
transfecção 31985070 ThermoAmortecedor de ânodo de metanol de ânodo concentrado de metanol

Referências

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