Method Article

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os neurônios motores da coluna vertebral (MNs) estender seus axônios para se comunicar com seus alvos innervating, assim, controlar movimentos e tarefas complexas em vertebrados. Assim, é fundamental para descobrir os mecanismos moleculares de como motor axônios navegue até aterraplenar e inervam os seus músculos periféricos alvos durante o desenvolvimento e degeneração. Apesar de linhas de rato transgénicas Hb9::GFP tem servido por muito tempo a visualização trajectórias axônio motor durante o desenvolvimento embrionário, descrições detalhadas de todo o espectro de arborização terminal axônio permanecem incompletas devido à complexidade do teste padrão e limitações de microscopia óptica atual. Aqui, descrevemos um protocolo melhorado que combina microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) e análise de imagem robusta, qualitativa e quantitativamente Visualizar desenvolvimento motor axônios. Este sistema pode ser facilmente adotado para cruzar mutantes genéticos ou modelos de doença MN com linhas Hb9::GFP , revelando novos mecanismos moleculares que levam a defeitos de navegação axônio motor e arborização.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MNs da coluna vertebral são a parte do sistema nervoso central mas inervam músculos periféricos para controlar o movimento. Na medula espinhal em desenvolvimento, progenitores de MN (PMN) são estabelecidas de acordo com os sinais que emana a notocorda e somitas adjacentes. Todos diferenciados MNs pós mitóticas então gerados a partir de PMN, eventualmente, dando origem a uma série de subtipos de MN ao longo do eixo de rostrocaudal da medula espinhal,1,2. MNs espinhais são topograficamente e anatomicamente bem organizados. Seu arranjo morfológico correlaciona-se com a posição de seus respectivos na periferia3. Ao atingir suas metas de músculo, axônios recebem fatores celulares e exógena neurotrophic que induzem-los a estender e um ramo ainda mais em músculos. Inervação e ramificação defeitos podem contribuir para a falha para formar junções neuromusculares (JNM). Por exemplo, fatores de neurotrófico derivado de glia (GDNF)-Pea3 induzido é indispensável para a arborização de axônio em cutâneo maximus (CM) e latissimus dorsi (LD) músculos4,5. Além disso, embriões de rato de nocaute DINE mostram defeituosa arborização dos nervos frênico no diafragma, causando mortalidade e insuficiência respiratória, imediatamente após o nascimento,6,7. Portanto, esta última etapa de maturação MN (ou seja, projeção axonal e ramificação) é fundamental para garantir a comunicação entre os neurônios e células-alvo.

Para ver os padrões de arborização, pesquisadores normalmente conduzir imagem latente confocal ou microscopia de luz de dois fotões de fluorescência das amostras seccionado ou toda a montagem8,9,10. Ambas estas técnicas de microscopia geram aceitável resolução e profundidade de penetração. Microscopia de fluorescência de dois fotões de luz envolve excitação de fluorophores por absorção simultânea de dois fótons de baixa energia11. Desde que dois fotões excitação usa radiação infravermelha, a frequência de diminuição da excitação contribui para a dispersão reduzida e melhor penetração de tecido até 1 mm de tecido, permitindo imagens com maior profundidade. Microscopia confocal remove pelos filtros do fora-de-foco sinais e apenas recolhe a luz dentro do plano focal12. Com esta abordagem, imagens das amostras dos diferentes planos focais podem ser combinadas para produzir uma imagem de tridimensional (3D) através de uma função de Z-pilha. Não obstante, intensidade de sinal é reduzida como a maioria da luz é bloqueada e altas aberturas numéricas obscurecem o profundidade de campo. Mais importante, ambas as técnicas contribuem para a grave Fotodano e fototoxicidade desde o espécime recebe iluminação mesmo quando apenas um avião é fotografado em um determinado momento.

Para contornar essas deficiências, LSFM tornou-se uma alternativa favorecida, com as vantagens de ser rápido, luz eficiente e menos fototóxico13,14. Além disso, o LSFM permite múltipla visualização imagem. Esta abordagem é particularmente adequada para visualização motor axônios e seus terminais de dispersão como eles se espalharam através do espaço 3D. LSFM supera as outras duas opções, porque as amostras são montadas em um palco que permite a rotação em torno de um eixo vertical e movimentos ao longo o x, y e z eixos. Esta montagem não só permite uma visão minimamente bloqueada da amostra, mas também a escolha de um caminho de iluminação desejável, uma lacuna de microscopia confocal e de dois fotões, ambos dos quais requerem montagem de amostras em uma corrediça plana. Portanto, LSFM é a ferramenta mais adequada para imagens 3D de arborização de axônio e para a quantificação dos terminais do nervo motor em embriões do rato.

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Protocol

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Todos os animais foram mantidos em uma patógeno específico livre (SPF) animal facilidade, aprovado e supervisionado por IACUC da Academia Sinica.

1. fixação

  1. Coletar embriões de dia embrionário 12,5 (E12.5) em seguida, decapitar e acabo com eles.
  2. Fixar os embriões individualmente em placas de 24 poços com 1ml/bem de acabadas paraformaldeído 4% em 1x salino de tampão fosfato (PBS) durante a noite. Incube a 4 ° C, um agitador.
  3. Lave os embriões fixos pelo menos 3 x, cada um por 5-10 min, com 1 mL de 1X PBS e incubar durante uma noite a 4 ° C, um agitador para remover o paraformaldeído residual.

2. toda a montagem imunocoloração

  1. Permeabilize cada embrião em 1 mL de 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) durante a noite a 4 ° C, um agitador.
  2. Bloco de cada amostra com 1 mL de 10% FBS preparado em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, um agitador.
  3. Incubar o embrião com 1 mL de anticorpo primário anti-GFP (1:1, 000 diluição em 10% FBS) a 4 ° C, durante 72 h com agitação constante para intensificar o sinal do GFP de nervos motores.
  4. Após a incubação do anticorpo primário, lavar com 1 mL de 0.5% PBST ao longo de 1-2 dias a 4 ° C, um agitador, mudando a 0,5% PBST pelo menos três vezes.
  5. Aplicar 1 mL de anticorpo secundário (1:1, 000 diluição em 10% FBS) e incubar durante uma noite, no escuro a 4 ° C, com agitação constante.
  6. Lavar 3x com 1 mL de 0.5% PBST a 4 ° C, um agitador ao longo de 2-3 dias. Manter amostras de 1X PBS a 4 ° C até o dia anterior a imagem.
    Nota: Os embriões podem ser dissecados em segmentos menores antes de compensação, dependendo de qual parte dos embriões vai ser fotografada. Membros dianteiros são preservados nesta abordagem experimental (figura 1A).
  7. Incube o embrião de um reagente de compensação comercial com um índice de refração de 1.49 nD em um tubo de 1,5 mL, protegido da luz em temperatura ambiente durante a noite, para processar o embrião transparente para a imagem latente.
    Nota: O volume de reagente a clareira é aproximadamente cinco vezes que o volume de amostra.

3. LSFM (2-3 h)

  1. Configuração de amostra
    1. Configurar a 5 X / 0.1 iluminação ótica e 5 X / 0,16 óptica da deteção. Montar o porta-amostras e amostra capilar (1,5 mm de diâmetro interno, verde) e colocá-los no microscópio.
      Nota: Consulte Manual de operação do microscópio para procedimentos de instalação detalhadas.
    2. Monte o embrião da seguinte forma:
      1. Preparar a ponta da pipeta P200 cortando a parte superior para que ele caiba o diâmetro do capilar e remover a parte pontiaguda (~ 3 mm) para a fixação da amostra.
      2. Derreta a extremidade cega da ponta da pipeta usando uma pequena chama.
      3. Extinguir a chama e rapidamente anexar o embrião verticalmente na ponta derretida.
      4. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com a amostra capilar.
    3. Permitir que o buffer de câmara para equilibrar com o embrião para 1 min limpar os detritos ou bolhas.
    4. Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar sob a guia de Localizar e ajustar o x, y, eixos z para posicionar o capilar de amostra.
    5. Selecione Localizar amostra e zoom de 0,6 X para focar o embrião. Gire o embrião para garantir que o longo eixo do membro imagem alinha com o trajeto da luz das duas fontes de luz (figura 1B).
  2. Aquisição de imagem
    1. Sob a guia de aquisição , defina os parâmetros de trajeto da luz como objectivos da deteção, laser bloqueio filtro, divisor de feixe, câmeras e lasers.
      Nota: O canal GFP é usado neste experimento (comprimento de onda de excitação: 488 nm; filtro de emissão: BP 505 para 545 nm, divisor de feixe: SPS LP 560).
    2. Marque a caixa de verificação de pivô para redução de sombra.
    3. Definir as configurações de aquisição: bit profundidade, 16 bits; zoom, 0,36-0,7 X; iluminação do único-lado (esquerda/direita) ou lado do dual iluminação.
    4. Clique em contínua e definir a intensidade do laser, tempo de exposição, poder do laser e posição de folha de luz para obter imagens mais nítidas.
      Nota: A potência do laser é mantida tão baixa quanto possível minimizar o Fotodano.
    5. Pressione parar para aquisição de imagem final.
  3. Aquisição multidimensional
    1. Defina a z-pilha, deslocando a posição de Z para a primeira e a última imagem. Clique em Optimal para definir o número de fatias.
    2. Clique em Iniciar o experimento para adquirir a z-pilha selecionada.
    3. Quando estiver pronto, salve a imagem no formato .czi.
  4. Processamento de imagem (opcional)
    1. Prosseguir com a fusão de lado duplo sob o canal de Processamento de Lightsheet se iluminação dual-lado é aplicada. Processamento de MultiView é necessário se múltiplos pontos de vista são adquiridos para combinar imagens de vários ângulos.
    2. Crie uma imagem 2D usando os dados de pixels maiores intensidade ao longo do eixo de projeção sob o canal da Projeção de intensidade máxima .
    3. Em canal de cópia , clique em subconjunto para selecionar subconjuntos das imagens do conjunto original.

4. quantificação de arborização axônio (30 Min. para cada nervo Individual)

  1. Abra o arquivo de imagem do software de análise de imagem (por padrão, a imagem que contém os dados XYZ é aberta no modo Surpass e como um modo de exibição em 3D-rendered).
  2. Ajustar a cor da imagem, brilho e usando a janela de Exibição ajuste de contraste (Editar | Ajuste de exposição mostrar) para detectar filamentos baseados no contraste local de intensidade.
  3. Clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecionar o algoritmo de relationship (sem laço) no menu drop-down.
  4. Selecione a região de interesse (no caso, o axônio segmentar de interesse). Clique em Next quando terminar.
  5. Defina os pontos de partida e sementes, atribuindo as medições de diâmetro maior e mais fino, que podem ser medidas usando o modo de fatia .
  6. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para conseguir o manual adição ou remoção dos pontos de partida, primeiro alterar o modo de ponteiro (navegar | Selecione) e, em seguida Shift + botão direito do mouse nos pontos de interesse.
  7. Selecione manuais limiares para pontos de sementes garantir que todos a visível arborização está marcado. Alterar o modo de ponteiro (navegar | Selecione) e, em seguida Shift + botão esquerdo do mouse nos pontos de interesse para manualmente adicionar ou remover pontos de semente.
    Nota: É importante para manualmente remover ruídos de fundo e sinais de nervos vizinhos.
  8. Marque a caixa remover pontos de semente em torno de pontos de partida.
  9. Verifique remover desconectada de segmentos para permitir que a exclusão dos pontos que estão muito longe e que pode representar o ruído de fundo. Indica o Comprimento máximo da Gap na próxima etapa para definir o limite superior para exclusão.
  10. Ajuste o limite para subtração de fundo, que utiliza um filtro gaussiano para estimar a intensidade de fundo de cada voxel.
  11. Definir limite automático para diâmetro dendrito usando o algoritmo de área de seção transversal aproximada .
  12. Pule as etapas para o cálculo da coluna.
  13. Terminar o processo e escolher o estilo desejado e cor.
  14. Desmarque a caixa de volume em Propriedades para exibir apenas os axônios reconstruídos.
  15. Na guia estatísticas , selecione Detailed. Use o filamento não. Pontos de Terminal dendrito para quantificar os terminais do nervo motor como um indicador da arborização axônio motor.
    Nota: Anotação estatística pode ser adicionada se desejado.
  16. Exporte a imagem do axônio reconstruída como um arquivo. tif.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM fornece visualização 3D detalhada de arborização de trajetória e axônio MN no mouse embriões. Sob campo claro, tecidos aparecem completamente transparentes após ter sido mergulhado no reagente de compensação comercial. Nenhum encolhimento ou inchaço da amostra foi notado após uma semana de armazenamento no reagente antes de imagem de compensação. Canal de fluorescência, neurônios motores são rotulados com GFP transgenicamente expressa (filme 1). Em alguma instância, ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diversas etapas no protocolo podem ser sujeitas a alterações em determinadas circunstâncias. Por exemplo, a duração da fixação depende da idade dos embriões, variando entre 2 h e 1 ou mais dias usando paraformaldeído acabadas. Desde que a fixação é feita antes de toda montagem imunocoloração, para anticorpos que são sensíveis à proteínas de reticulação, metanol pode ser usado como um agente fixador alternativo. Para uma relação sinal / ruído elevada após coloração, é necessário otimizar a concentração de detergente (entr...

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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LSFM experimentos e análise de dados foram realizadas em parte usando os avançados microscópios óticos do divisão de instrumento serviço na Academia Sinica e com o auxílio do MS. Shu-Chen Shen. Agradecemos a Sra. Sue-Ping Lee do Imaging Core Facility do IMB considerável assistência técnica com análise de imagem hottie. Científico Inglês edição núcleo do IMB reviu o manuscrito. Este trabalho é financiado pela Academia Sinica prêmio de desenvolvimento de carreira (CDA-107-L05), mais (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPO laboratório Jackson005029Coletar embriões de dia embrionário 12,5 (E12,5)
4% Paraformaldeído (PFA)Para 200ml: Adicionar 20ml 10X PBS, 8g PFA em ddH2O. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH (10N). Filtre, esterilize e armazene a -20 ° C.
Tampão fosfato salino 10X (PBS 10X)Para 1L: Adicione 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 e complete com ddH2O. Autoclave e armazene na RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Soro FetalBovino ThermoFisher26140079
Ovino policlonal anti-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 burro anti-ovelhaInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 reagente de limpezaSunJin LabRC149001
1.5ml micro tuboSarstedt72.690.001
placa de 24 poçosThermoFisher142475
5 SA Pinçaideal-tek3480641
Tesoura de íris estria afiada / afiadaAesculapBC110R
Bisturis de microcirurgia, uso únicoAesculapBA365
Microscópio de dissecaçãoNikonSMZ800
Microscópio ShakerTKSRS-01
Lightsheet Z.1Microscopia
Imaris 8.4.0 software de análise de imagemBitplane, Zurique, Suíça
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (camundongos Hb9::GFP)O Laboratório Jackson005029
Carl Zeiss

References

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