Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Resumo

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Resumo

Epilepsia do lobo temporal (TLE) é a mais comum síndrome epiléptica complexa parcial e o menos responsivos às medicações. Estimulação cerebral profunda (DBS) é uma abordagem promissora quando falha de tratamento farmacológico ou neurocirurgia não é recomendada. Fatias de cérebro aguda acopladas para matrizes de microeletrodos (MEAs) representam uma ferramenta valiosa para estudar as interações de rede neuronal e sua modulação por estimulação elétrica. Em comparação com as técnicas convencionais de gravação extracelular, eles fornecem as vantagens de um maior número de pontos de observação e uma distância conhecida de eletrodo inter, que permitem estudar o caminho de propagação e velocidade da eletrofisiológicos sinais. No entanto, oxigenação dos tecidos pode ser grandemente prejudicada durante MEA gravação, que requerem uma taxa alta de perfusão, que vem à custa da diminuição da relação sinal-ruído e maiores oscilações na temperatura experimental. Estimulação elétrica mais salienta o tecido cerebral, dificultando a perseguir épocas de gravação/estimulação prolongada. Além disso, elétrica modulação da atividade de fatia cerebral precisa de estruturas/percursos específicos dentro da fatia de cérebro, exigindo que o mapeamento de eletrodo ser facilmente e rapidamente tocada ao vivo durante o experimento de destino. Aqui, ilustramos como executar a modulação de gravação e elétrica de 4-aminopiridina (4AP)-induzido atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor usando MEAs planares. Nós mostramos que o tecido cerebral obtido de ratos supera o tecido de cérebro de rato e, portanto, é mais adequado para experimentos MEA. Este protocolo garante a geração e manutenção de um padrão estável epileptiforme fielmente reproduz as características eletrofisiológicas observadas com gravação potenciais de campo convencional, persiste por várias horas e sobrevive à sustentada estimulação elétrica para épocas de prolongada. Viabilidade de tecido em todo o experimento é alcançada graças à utilização de uma câmara de pequeno volume de gravação personalizada, permitindo fluxo laminar e troca de solução rápida, mesmo em baixa (1 mL/min) taxas de perfusão. Mapeamento de MEA rápido para monitoramento em tempo real e a seleção de eletrodos de estimulação é realizado por uma interface gráfica personalizada do usuário (GUI).

Introdução

Epilepsia é uma desordem progressiva fatal, causando a atividade descontrolada do cérebro¹; Ele carrega entre o maior fardo da doença e o estigma social significativo^2,3. TLE é a síndrome mais frequente (40%) e a mais frequentemente (~ 30%) resistentes à medicação anti-epiléptica⁴. Enquanto a ablação cirúrgica do tecido epileptogênica pode melhorar as condições do paciente, não é viável em todos os pacientes e não pode garantir uma vida completamente livre de apreensão de⁵. Modulação de epilépticas límbicas redes por DBS elétrica é uma abordagem promissora quando o tratamento farmacológico ou neurocirurgia não são adequados.

Fatias de cérebro de roedor são uma ferramenta valiosa para estudar a função de redes neuronais como na saúde e na doença⁶ por meio de técnicas de eletrofisiologia em vitro , como eles preservar, pelo menos em parte, a arquitetura original e conectividade do cérebro região (ões) de interesse (ROI). Em particular, fatias de córtex (hipocampo-CE) horizontal combinado hipocampo-entorhinal compõem as redes neuronais essenciais envolvido no TLE e consequentemente são rotineiramente empregadas em vitro TLE pesquisa⁷.

Apreensão-como a atividade pode ser aguda induzida em fatias do cérebro, alterando a composição iônica do fluido cerebrospinal artificial (ACSF), tais como a diminuição de magnésio enquanto aumenta o potássio^8,9,10, ou por meio de manipulações farmacológicas, tais como bloqueio atividade inibitória gabaérgica (ver¹¹ para uma revisão abrangente). No entanto, estes modelos são baseados na alteração desequilibrada de excitação e inibição; assim, eles não permitem estudar a interação e contribuição concertada das redes excitatórias e inibitórias para ictogenesis. Perfusão contínua de fatias do cérebro com o 4AP convulsivante droga aumenta a neurotransmissão excitatório e inibitório, permitindo assim a estudar ictogenesis aguda, mantendo a atividade sináptica no geral intacta¹².

Como permite a gravação da atividade elétrica gerada pelas redes neuronais de um maior número de pontos de observação em relação ao potencial gravação de campo extracelular convencional, onde restrições espaciais limitam o número de eletrodos que podem ser acomodados na superfície de fatia do cérebro. Além disso, os chips MEA oferecem a vantagem da distância eletroda inter conhecida, que é muito útil para a propagação de rastreamento e avaliar a velocidade de viagem dos sinais gravados. Apesar de inicialmente concebido para a gravação de neurônios cultivados^13,14, MEAs agora são também usados para caracterizar as características eletrofisiológicas de fatias de cérebro aguda, obtidas de roedores¹⁵ e humanos¹⁶. Assim, no contexto da investigação de epilepsia, MEAs representam uma ferramenta valiosa para identificar as interações das redes neuronais no núcleo de ictogenesis^16,17,18.

No entanto, a gravação de MEA inerentemente carrega desafios técnicos na obtenção ou manutenção de um padrão de epileptiforme estável ao longo de protocolos experimentais de long (várias horas). Primeiro, oxigenação dos tecidos pode não ser adequada dentro da grande e redondo tipo submersa gravação câmara^19,20 típico de MEAs comercialmente disponíveis, enquanto o pobre relação sinal-ruído e instabilidade de temperatura podem afetar a qualidade da gravação quando uma taxa alta de perfusão (6-10 mL/min) é usada para melhorar o fornecimento de oxigênio para a fatia do cérebro (veja por exemplo as notas técnicas em equipamentos de aquecimento e perfusão²¹). Segunda, recorrentes descargas com componentes de alta frequência, como as descargas epileptiforme, dificilmente são observadas quando usando câmaras de gravação tipo submersa¹⁹; Este é particularmente o caso quando o padrão epileptiforme aguda é quimicamente induzido e envolve mecanismos de ephaptic, como é o caso para a 4AP modelo²² (ver¹¹ para uma visão abrangente). Para superar essas limitações, várias estratégias têm sido propostas por pesquisadores. Por exemplo, aumentando a taxa de perfusão^19,20 , reduzindo a espessura da fatia de cérebro (≤300 µM) e área de^17,18 é fatores cruciais para a realização adequada de oxigênio aos tecidos. Além disso, cérebro maior fatia viabilidade também pode ser realizada usando MEAs perfurados (pMEAs), que permitem perfusing o tecido cerebral de ambos os lados,¹⁸.

Considerando que as abordagens descritas melhoraram significativamente a viabilidade de gravação MEA de fatias do cérebro, eles não foram testados contra prolongada (várias horas) sessões de estimulação elétrica e gravação, o último que representa um significativo estresse para o tecido cerebral. Sessões de gravação prolongada podem ser necessária para estudar a evolução no tempo das características específicas do epileptiforme padrões que não seria possíveis desmascarar por medidas a curto prazo. No contexto da investigação DBS, protocolos experimentais prolongados podem ser necessária para avaliar e comparar os efeitos dos vários paradigmas de estimulação na mesma fatia do cérebro.

Quando apenas a atividade elétrica espontânea precisa ser gravado, mapeamento dos eletrodos no que diz respeito o ROI geralmente é feito a posteriori, ou seja, durante a análise de dados; em vez disso, o estudo das respostas evocadas ou dos paradigmas de neuromodulação elétrica requer que a estimulação seja entregue à ROI(s) específica, ditando a necessidade de mapeamento de rápida e fácil ao eletrodo durante o experimento.

Aqui, podemos ilustrar um protocolo experimental simples que permite a indução e manutenção de um padrão estável induzida por 4AP epileptiforme em fatias de cérebro de roedor adulto. A atividade observada reproduz fielmente as características eletrofisiológicas deste modelo como caracterizadas usando técnicas convencionais de eletrofisiologia extracelular. Ele persiste por várias horas e sobrevive à estimulação elétrica sustentada por épocas de prolongada repetidas. As câmaras utilizadas para manter e incubar as fatias do cérebro podem ser facilmente montadas usando suprimentos laboratoriais padrão (figura 1A), Considerando que uma câmara de gravação personalizada, permitindo a solução ideal de taxa de câmbio e fluxo laminar (figura 1B) pode ser obtidos de fontes comerciais ou usando a tecnologia de impressão 3D a um preço acessível. Mapeamento rápido do ROI(s) para monitoramento em tempo real e para a seleção de eletrodos de estimulação é tornado possível por uma GUI amigável personalizado chamado mapMEA, livremente disponíveis mediante solicitação.

Figura 1: equipamento personalizado usado para esse protocolo. (A) exploração câmaras para recuperação, pré-aquecimento e pré-incubação em 4AP são montadas com um copo e um prato de Petri. O prato de Petri deve ser menor em diâmetro que o disjuntor e é mantido no lugar por meio de um êmbolo da seringa. Parte inferior da caixa de Petri é substituída por uma malha de nylon (a partir de meias de suaves), colada com cianoacrilato na borda da caixa de Petri. Oxigênio é fornecido através de uma agulha espinhal torta (22 G), inserida entre as paredes da caixa de Petri e o copo. Bolhas devem ser emergentes do lado do copo e nunca chegar a tela de nylon para evitar deslocamento de fatia do cérebro. Parte superior de um prato de Petri pode ser usado como uma tampa para evitar evaporação ACSF e manter a saturação de oxigênio. (B) câmara de gravação personalizada. em: reservatório de entrada para acomodar a cânula de aquecimento e o eletrodo de referência. para fora: reservatório de tomada para acomodar a agulha de aspiração. Câmara de rec: gravação. (C) vidro pipetas, enrolada por fogo-polimento, usado para tratar o tecido e ajustar sua posição dentro da câmara de gravação. Âncora de grampo de fatia (D) personalizado. (E) a montagem Final da câmara de gravação montado sobre o chip MEA. Uma fatia do cérebro baseia-se na parte inferior mantida no lugar pela âncora. A seta vermelha indica o tubo de PTFE, cobrindo a cânula de aquecimento, o círculo vermelho indica o eletrodo de referência, uma pelota de KCl saturado submergida por ACSF no reservatório de entrada. A seta azul indica a agulha de aspiração no reservatório da tomada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Ministério da saúde (autorização n. 860/2015-PR) italiano em conformidade com a Directiva UE 2010/63/CE sobre o bem-estar animal.

1. preparação da Assembleia câmara MEA/Custom

Nota: Começa 2 dias antes do experimento. Use um MEA sem um anel (ver Tabela de materiais).

1. Limpar o MEA (duração: 35-40 min).
   1. Um pó limpador enzimático, dissolva em água destilada morna. Escovar o quente limpeza solução sobre a superfície MEA, em seguida, mergulhar a MEA a quente limpeza solução pelo menos 3h.
   2. Enxágue o MEA cuidadosamente com água destilada e seque-o com um tecido de cotão não-zero.
2. Montar o MEA com câmara de gravação (duração: 10 min + durante a noite).
   1. Espalhe uniformemente o selante elastomérico na superfície inferior da câmara de gravação. Certifique-se que não há nenhuma bolha.
   2. Montagem da câmara de gravação para a MEA com a ajuda de uma pinça e aplique uma pressão suave. Se houver quaisquer bolhas, deslocar ligeiramente a câmara em um círculo, aplicando uma pressão suave com os dedos até todas as bolhas desapareceram. Espalhe uma camada de selante todo o caminho ao redor da borda exterior da câmara de gravação.
      Nota: crítico! Não cubra os contatos MEA com o selante.
   3. Coloque o conjunto MEA/câmara dentro de um prato de Petri de 15 cm. Lugar uma placa de Petri de 5ml ou uma proveta de 10ml cheia de água destilada perto o MEA. Cobrir tudo para manter um ambiente úmido. Deixe a cura à temperatura ambiente durante a noite.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Revestir o MEA para torná-lo hidrófila (duração: 5-10 min + durante a noite).
   1. Coloque o MEA em uma placa de Petri de 15 cm. Encham a área de gravação de MEA 50 µ l de poli-D-lisina. Feche a caixa de Petri, selá-lo com filme de selagem e armazenar durante a noite a 4 ° C.
   2. Enxágue o MEA completamente usando água destilada e armazenar o MEA a 4 ° C em água destilada.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. MEAs revestidos podem ser armazenados e reutilizados para vários experimentos. Rotineiramente, limpeza e revestir novamente o MEA ajudam a remover os restos de tecido e melhorar a relação sinal-ruído.

2. preparação das soluções estoque

Nota: Iniciar 1 dia antes do experimento (duração: ~ 2 h). Soluções estoque ajudam a acelerar a experiência no dia experimental. Eles podem ser preparados com antecedência e armazenados. Consulte a tabela 1 para a composição e o factor de concentração. Consulte a tabela 2 para composição de soluções finais.

1. Dissolva os produtos químicos em água destilada à temperatura ambiente. As soluções estoque com um frasco de filtro do filtro (diâmetro do filtro: 0,22 µm).
2. Loja a 4 ° C (ver tabela 1 para recomendado o período máximo de armazenamento).
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. preparação do ágar

Nota: Iniciar 1 dia antes do experimento (duração: ~ 1 h).

1. Despeje 250 mL de água destilada em um béquer de 500 mL e começar a agitar a 350 rpm. Adicionar 5 g de ágar-ágar e esperar até que é completamente dissolvido.
2. Aquecer a solução a 250-300 ° C. Deixe a água evaporar até que a solução é ~ 200 mL para produzir uma solução de agar 2,5% w/v.
   Nota: A temperatura deve ser alta o suficiente para deixar a água evaporar sem borbulhar.
3. Despeje a solução de ágar sobre uma caixa quadrada plástico de 200 mL de ~1.5 paredes cm de altura e deixe arrefecer à temperatura ambiente até que se torne sólida.
4. Cobrir a caixa e armazená-lo em 4 ° C. O bloco de agar é bom por várias semanas.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. preparação do avião congelado

Nota: Inicie 1 dia antes do experimento.

1. Encha uma tigela de aço inoxidável de fundo plano com água destilada até 0,5 - 1 cm abaixo da borda.
2. Armazenar a-20 ° C durante a noite.

5. preparação de Neuroprotective corte ACSF

Nota: Iniciar 1 dia antes do experimento ou no mesmo dia do experimento (ver tabela 1 e tabela 2) (duração: 30 min).

1. Deite 200 mL de água destilada num copo de 500 mL e começar a agitar utilizando um agitador magnético a 350 rpm.
2. Adicionar 50 mL de estoque B e 50 mL de estoque C (ver tabela 1).
3. Adicione o ácido pirúvico 3mm, sacarose 208 mM, 10 mM D-glicose e ácido L-ascórbico de 1 mM.
   Nota: O volume real de ácido pirúvico depende da densidade e pureza e pode variar de acordo com o lote. Sempre Calcule o volume necessário ao abrir um novo lote.
4. Cubra com filme de selagem e deixe mexa por 30 min.
5. Transferir a solução para um balão volumétrico de 500 mL e adicione água destilada para encher o frasco.
6. Selo do balão volumétrico com filme de selagem e inverta suavemente 3 - 5 vezes até que a solução é uniformemente clara.
7. Transferi a corte ACSF em um frasco de vidro com tampa.
8. Armazenar o corte ACSF a-80 ° C durante 20-30 min, ou a 4 ° C durante a noite para esfriar até 4 ° C.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui se resfriamento durante a noite é o preferido. Caso contrário, o tempo necessário para refrigerar o corte ACSF pode ser utilizado para perseguir a etapa 6.

6. preparação da exploração ACSF

Nota: Preparar a solução fresca no dia do experimento (duração: 5-10 min). Exploração ACSF será usado para enxaguar as fatias de cérebro resultantes do corte ACSF durante o procedimento de corte (consulte a etapa 8.16) e para o armazenamento de longo prazo do cérebro fatia e pré-aquecimento. Para enxaguar as fatias do cérebro, 100 mL de segurando ACSF é suficiente. Câmaras de holding e pré-aquecimento, usadas no presente protocolo são feitos sob medidas e contêm um volume de 300 mL e 100 mL, respectivamente (cf. figura 1A). Com essa configuração, 500 mL de segurando ACSF é suficiente. Chambers, obtidos de fontes comerciais pode conter um volume diferente, em que caso o montante global da holding ACSF estar preparado deve ser ajustado em conformidade.

1. Deite 200 mL de água destilada num balão volumétrico de 500 mL.
2. Adicione 50 mL de estoque A, 50 mL de estoque B, 6,5 mL de caldo M e 1 mM de ácido L-ascórbico. Suavemente agite com movimentos rotativos até ácido L-ascórbico é completamente dissolvido.
3. Adicionar água destilada para atingir o volume final, selo do balão volumétrico com filme de selagem e inverta suavemente 3 - 5 vezes até que a solução é uniformemente clara. Consulte tabela 2 para a realização de composição ACSF.

7. preparação dos bancos Experimental

Nota: Isto requer 15 min, mais 30 min para obter uma temperatura constante do banho quente.

1. Banco de gravação
   1. Iniciar o banho morno, configurá-lo para 32 ° C e cobri-lo para manter a sua temperatura.
      Nota: O banho quente utilizado neste protocolo pode ser feitos sob medida usando uma caixa de plástico dura e um termostato de aquário pré-ajuste na temperatura desejada. Constante temperatura desejada pode ser alcançada em ~ 30 min a partir da temperatura ambiente. Desde as câmaras de incubação e pré-aquecimento sentar-se na parte inferior da caixa de plástico, o nível da água deve ser suficiente para cobrir o termostato a fim de manter as câmaras de flutuação.
   2. Montar a exploração e as câmaras de pré-aquecimento (cf. figura 1A) e despeje a exploração ACSF neles. Manter a câmara de exploração à temperatura ambiente e coloque a câmara de pré-aquecimento dentro do banho quente. Comece a borbulhar as soluções com 95% O₂5% CO₂ gás mistura e remover quaisquer bolhas presas com uma pipeta Pasteur invertida. Manter cobertos.
2. Fatiar o banco e vibratome
   1. Cola um bloco de ágar pequena no centro do disco de amostra usando a cola de cianoacrilato.
   2. Coloque um copo de 250 mL em um balde de gelo e despeje a corte ACSF nele.
   3. Leve duas provetas de 100 mL e despeje 50ml da holding ACSF em cada um. Deixe os copos à temperatura ambiente. Estes são os copos de lavagem.
   4. Comece a borbulhar as soluções com uma mistura 5% CO₂ gás 95% O₂.
   5. Montar a bandeja de tampão para o vibratome e cercá-lo com gelo picado. Despeje um pouco etanol sobre o gelo picado para auxiliar na manutenção de baixas temperaturas durante o processo de corte. Após derramamento de etanol, adicione mais gelo conforme necessário.
      Nota: Uma temperatura de 2 ° C é ideal.
   6. Coloque o borbulhador dentro da bandeja de tampão, em seguida, montar e montar o bloco de lâmina de vibratome.
      Nota: Certifique-se de que a lâmina é montada em ângulo de ~ 10°.
   7. Colocar gelo picado em um copo de 500 mL para 2/3 do volume e encha-a com água destilada.
   8. Tirar a tigela congelada do freezer, coloque-o de ponta-cabeça no banco fatiamento e cubra-o com uma toalha de papel e um disco de papel de filtro.
3. Banco de anestesia
   1. Coloque uma tigela pequena em um tabuleiro cheio de gelo e despeje a corte ACSF nele. Comece a borbulhar com uma mistura 5% CO₂ gás 95% O₂.

8. cérebro fatia preparação e manutenção

Nota: Este protocolo faz uso de adulto (4 - 6 semanas de idade) camundongos machos do CD1, mas outras tensões (por exemplo, c57/bl6^17,18) podem ser usado. Também depois comparamos a saída experimental obtida usando fatias de cérebro de rato com que rendeu por fatias do cérebro obtidas de ratos Sprague-Dawley machos da mesma idade. As etapas a seguir referem-se à preparação de fatias de cérebro parcialmente Deconectado em que orientado em CA3 rápido interictais-como a atividade é contida o hipocampo adequada e não pode propagar para os córtices hipocampal, como descrito em²³. Desconexão do hipocampo-córtex é um pré-requisito para prosseguir estudos de modulação elétrica em usando a preparação de fatia do cérebro hipocampo-CE. O vibratome usado refere-se ao modelo listado na Tabela de materiais. Outros modelos podem exigir um procedimento diferente.

1. Anestesiar o roedor utilizando isoflurano 5% em um carbogênio mistura entregada a uma câmara de indução de anestesia em 2 L/min de gás.
2. Sob anestesia profunda (beliscar sem reflexos em resposta aos pés e patas), extrair o cérebro dentro de 1 min, seguindo os procedimentos padrão como em²³. Coloque o cérebro dentro da tigela pequena contendo equilibrada gelada corte ACSF e deixe esfriar para 90-120 s.
   Nota: Não deixe o cérebro relaxar por muito tempo, caso contrário ele pode congelar.
3. Despeje o corte gelado ACSF em bandeja de tampão. Espalhe a corte ACSF para o papel de filtro colocado na taça congelada. Coloque o cérebro para o papel de filtro e isolar o bloco de tecido cerebral necessária, removendo o cerebelo e o polo frontal de corte reto.
4. Com a ajuda de uma espátula dobrada, cola o lado dorsal do cérebro para o disco de amostra com a corte frontal virada o bloco de ágar e o polo occipital, enfrentando a lâmina vibratome. Use uma camada fina de cola de cianoacrilato. Coloque o disco de amostra na bandeja de tampão imediatamente e fixá-lo.
5. Ajuste o intervalo de corte a fim de mover a lâmina vibratome do outro lado do tecido até o bloco de ágar. Ajuste a altura do disco de amostra para atingir o nível da lâmina com o bloco de tecido cerebral.
6. Descartar as secções de tecido até que o hipocampo é claramente visível (geralmente ~ 900 µm). Em seguida, defina uma espessura da fatia de 400 µm e começar a cortar para reter as secções de tecido. Para cada seção do cérebro dividido os dois hemisférios e apare o tecido desnecessário para obter duas fatias de cérebro. Como a bandeja de tampão é aumentada durante as seções subsequentes, encher a apresentação de bandeja de tampão com água destilada gelada (consulte a etapa 7.2.7).
7. Use uma pipeta Pasteur invertida gentilmente transferir as fatias do cérebro com o primeiro copo de lavagem, esvazie a pipeta Pasteur, e transferir as fatias do cérebro para o segundo copo de lavagem. Em seguida, transferir as fatias do cérebro para a câmara de exploração e deixá-los a recuperar pelo menos 60 min.
   Nota: Geralmente é possível obter de 6 a 8 fatias de cérebro globais. O protocolo pode ser uma pausa aqui.

9. preparação de ACSF contendo 4-AP (4AP-ACSF)

Nota: Isto requer 10 min para a preparação, além de 20 min de aquecimento. Cuidado! 4-AP é uma droga convulsivante e é tóxico. Manipular com luvas e evitar derramamento.

1. Deite 200 mL de água destilada num balão volumétrico de 500 mL.
2. Adicione 50 mL de estoque A, 50 mL de estoque B, 5 mL de caldo M e 1 mM de ácido L-ascórbico. Suavemente agite usando movimentos de rotação até que o ácido L-ascórbico é completamente dissolvido.
3. Adicione 500 µ l de 4AP estoque.
4. Adicionar água destilada para atingir o volume final, selo do balão volumétrico com filme de selagem e invertê-lo delicadamente 3 - 5 vezes até que a solução é uniformemente clara.
5. Montar a câmara de incubação 4AP (cf. figura 1A) e despeje-lo ~ 80 mL de 4AP-ACSF. Cobrir a câmara, transferi-lo para o banho quente e começar a borbulhar com uma mistura de gás 95% O₂5% CO₂ . Remova quaisquer bolhas presas com uma pipeta Pasteur invertida. Manter cobertos.
6. Espere até a temperatura de 4AP-ACSF 30-32 ° C (~ 20 min).
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui se fatias do cérebro ainda estão se recuperando.

10. pré-aquecimento e incubação de fatias em 4AP (duração: 90 min)

1. Verifique se o pré-aquecimento ACSF e a temperatura de 4AP-ACSF é 30-32 ° C.
2. Use um copo invertido pipeta Pasteur para transferência 1 fatia do cérebro para a câmara de pré-aquecimento e deixe o resto de tecido para 25-30 min. Então transferir a fatia do cérebro na câmara de incubação 4AP-ACSF e deixe descansar por 60 min.

11. preparação de set-up o MEA

Nota: Começa 15 minutos antes da gravação.

1. Transferi o volume restante de 4AP-ACSF para um Erlenmeyer de 500 mL.
2. Colocar o Erlenmeyer em uma prateleira acima do amplificador MEA e use a tubulação para permitir que a solução alimentar continuamente uma seringa de 60 mL. Ajuste a altura do erlenmeyer e a seringa para permitir uma taxa de gravidade-alimentado de 1 mL/min.
   Nota: A altura correcta varia de acordo com o diâmetro interno do tubo (ID). Para tubos de 5/32 polegadas ID, 30 cm são suficientes.
3. Começa a borbulhar o 4AP-ACSF no Erlenmeyer e na seringa com uma mistura 5% CO₂ gás 95% O₂.
4. Deixe o 4AP-ACSF fluxo através da tubulação de perfusão em um béquer até lá não é nenhum ar dentro; em seguida, interrompe o fluxo de solução.
5. Conectar-se o elemento de aquecimento na base MEA para o termostato. Coloque o chip MEA seco dentro do amplificador MEA e fixar a cabeça do amplificador. Use uma pipeta Pasteur plástica para transferir 4AP-ACSF para a entrada e reservatório exterior da câmara de gravação.
6. Fixar a cânula de aquecimento para um suporte magnético e coloque a sua ponta dentro do porto de entrada de câmara de gravação; anexar o suporte magnético para uma fita magnética na cabeça amplificador MEA; Conecte o tubo de perfusão para a cânula; Conecte a cânula para o termostato.
   Nota: A cânula de aquecimento deve ser coberta pela tubagem chanfrada politetrafluoretileno (PTFE) para chegar a câmara de gravação Porto de entrada e para minimizar o ruído devido o material metálico da cânula. Quando o reservatório de entrada é adequadamente preenchido com 4AP-ACSF, gotas caindo do sistema de perfusão não devem estar visíveis.
7. Coloque a agulha de aspiração dentro do reservatório e verifique se há pressão negativa submergindo a agulha de aspiração para a ACSF; Verifique se há um barulho de sucção baixa frequência constante.
   Nota: A agulha de aspiração deve ser colocada por forma a permitir o 4AP-ACSF a fluir apenas acima da superfície de fatia do cérebro. Pode ser usada uma linha de vácuo ou uma bomba de vácuo de baixo ruído.
8. Defina o regulador de fluxo permite uma taxa de fluxo de 1 mL/min e começar perfusing.
   Nota: Perfusão de gravidade-alimentado elimina o ruído que pode ser causado por bombas peristálticas; Se as bombas peristálticas são preferidas, modelos de baixo ruído são obrigatórios.
9. Uma vez 4AP-ACSF está fluindo através da cânula, ligue o termostato. Defina a cânula de aquecimento para 37 ° C e a base MEA a 32 ° C, para atingir uma temperatura de 32-34 ° C no interior da câmara de gravação.
   Nota: cuidado! Nunca calor a cânula sem solução nele ou ele pode danificar irremediavelmente. Regule a temperatura da cânula superior à temperatura de gravação (ou seja, 32-34 ° C) a conta para o deslocamento de temperatura intrínseca entre o valor ajustado e o valor real na ponta da cânula de aquecimento e dentro da câmara de gravação. A taxa de fluxo, temperatura ambiente e volume da gravação de câmara toda a influência da temperatura da solução de gravação. As configurações relatadas na etapa 11,9 são otimizadas para o protocolo descrito e equipamentos. Sempre verifique a temperatura de gravação usando um termopar e ajuste as configurações conforme necessário. Não aqueça a base MEA acima de 34 ° C para evitar o sobreaquecimento da fatia do cérebro.
10. Coloque o eletrodo de referência externo no reservatório de entrada da câmara de gravação.
    Nota: Embora MEA fichas estão equipadas com um eletrodo de referência interno, isto é coberto pela câmara de gravação personalizada. Assim, deve ser usado um eletrodo de referência externa. Uma pelota de KCl saturada é o mais prático, uma vez que é pronto para uso sem necessidade de cloração.

12. MEA viver mapeamento

1. Uma vez o nível de 4AP-ACSF e a temperatura de gravação são estabilizadas como desejada, volta a perfusão e as torneiras de sucção na posição desligada temporariamente detê-los.
   1. Rapidamente transferi uma fatia do cérebro para a gravação de MEA câmara usando um copo invertido pipeta Pasteur. Ajuste a sua posição sobre a área de gravação de MEA como necessários usando uma fogo-lustrado pipeta Pasteur enrolada (Figura 1) ou uma escova macia de pequena compacta. Coloque a âncora de grampo (Figura 1) sobre a fatia de cérebro. Reinicie a perfusão e a sucção girando suas torneiras volta para a posição on.
      Nota: crítico! A fatia deve ser transferida, e a perfusão reiniciado dentro de 60 s ou o tecido pode morrer. A âncora do grampo de fatia deve ser mantida em 4AP-ACSF para evitar que a fatia do cérebro se mova ao colocar a âncora na fatia cerebral devido a diferenças na tensão superficial. A âncora para garantir a fatia do cérebro para a MEA pode ser feitos sob medida usando thread de nylon e fio de aço inoxidável (Figura 1) ou obtidos de fontes comerciais. Figura 1E mostra a montagem experimental final com o chip MEA ligada à cabeça do amplificador: uma fatia do cérebro descansar sobre o chip MEA dentro da câmara de gravação for mantida pressionado por âncora personalizada. O eléctrodo de referência (círculo vermelho) e o PTFE tubo cobrindo a cânula de aquecimento (seta vermelha) estão posicionados no reservatório de entrada, Considerando que a agulha de aspiração (seta azul) está posicionada no reservatório da tomada.
2. Tire uma foto da fatia cérebro usando uma câmera montada no palco microscópio invertido.
3. Execute o script mapMEA sobre o software de computador para iniciar o GUI para mapear os eléctrodos.
   Nota: O software feito sob medido permite ao usuário selecionar os eléctrodos que correspondem às estruturas específicas da fatia cerebral. Esta etapa é fundamental para ativar o caminho correto e suprimir a atividade estável por meio de estimulação elétrica.

Fig. 2: GUI para viver mapeamento de eletrodo MEA. (A) representação esquemática da fatia combinada hipocampo-CE posicionada sobre o MEA. As estruturas padrão usadas para este protocolo são cornu ammonis 3 (CA3), córtex enthorinal (CE), córtex perirhinal (PC) e subiculum (SUB). O eletrodo de referência é esquematizado como um marcador de triângulo. Elétrodos cercados em linhas pontilhadas representam as coordenadas XY para imagem de alisamento. (B) tela captura do GUI durante o mapeamento de MEA ao vivo. O fluxograma da esquerda da captura indica o procedimento passo a passo a seguir. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Clique no botão Browse para carregar a imagem da fatia cerebral. Certifique-se que o eletrodo de referência aparece na linha superior do metade-lado esquerdo da MEA (Figura 2A, triângulo mark). Clique no botão Ativar o ponteiro e, em seguida, selecionar os eletrodos superior e inferior da linha mais à esquerda da matriz para marcar as coordenadas XY para alisamento de imagem e mapeamento de eletrodo.
5. O tipo de fatia menu drop-down selecione Horizontal. Marque a caixa de seleção padrão de estruturas .
   Nota: É possível personalizar as estruturas, selecionando o botão de Inserir novas estruturas . As estruturas de padrão para a fatia do cérebro horizontal estão representadas na Figura 2A.
6. Usando os botões numerados abaixo da imagem de fatia do cérebro, selecione os eletrodos correspondentes para o ROI e clique o botão correspondente no painel estruturas para atribuí-los (Figura 2B); Repita esta etapa para cada ROI.
7. Pressione o botão salvar : o software gera uma pasta resultado chamada #EXP_LabelledElectrodes que contém uma tabela relatando os eletrodos selecionados e ROIs.

13. gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme

1. Permitir que a fatia de cérebro estabilizar dentro da câmara de gravação por 5-10 min antes da gravação.
2. Ligue o estímulo unidade pelo menos 10 min antes do protocolo de estimulação para permitir auto-calibração e estabilização. Inicie o software de controle de estímulo e verificar que estimulador e amplificador MEA estão conectados corretamente conforme indicado por um LED verde no painel principal do software de controle de estímulo. Por favor, consulte os manuais do software para obter detalhes adicionais, cf. Tabela de materiaise instrumentos específicos.
3. Configure a estimulação na configuração bipolar. Selecione os pares de eletrodo em contato com a camada de célula piramidal do subiculum CA1/proximal (cf.^24,25) entre os mapeado com o script mapMEA (cf. ponto 12). Use um fio para se conectar a um dos eléctrodos selecionados ao plugue do negativo do estimulador e o outro eletrodo à tomada positiva do mesmo canal estimulador. Use um outro fio para conectar o chão do stimulator no chão do amplificador.
4. Inicie o software de gravação. Para adquirir dados, pressione o botão PLAY no painel principal do software de gravação. Recorde de pelo menos 4 estável as descargas.
   Nota: Uma frequência de amostragem de 2 kHz permite adquirir potenciais de campo com resolução justa, minimizando o uso de espaço em disco rígido. Um arquivo de gravação de 5 min leva ~ 80 MB. Frequências de amostragem mais elevadas podem ser necessárias, por exemplo, para registro de estímulo artefatos ou multi-unidade atividade. Para observar potenciais de campo apenas, use um filtro passa-baixas ao vivo a 300 Hz para cortar multi-unidade atividade.
5. Determine a intensidade do estímulo.
   1. Do software de controle de estímulo, use o painel principal para projetar uma quadrada bifásica positivo-negativo atual duração do pulso de 100 µs/fase.
      Nota: cuidado! Estimulação da corrente direta requer um pulso de carga equilibrada para evitar danificar o equipamento.
   2. Teste rápido entrada/saída (e/s) para identificar a melhor intensidade de estímulo. Entregar o pulso de estimulação projetado na etapa 13.5.1 em 0,2 Hz ou inferior, adicionando um intervalo de pulso Inter de 5 s ou mais sob a forma adequada do software de controle de estímulo. Na guia de amplitude de pulso Insira uma amplitude de pulso inicial de 100 µA/fase e aumentar em passos de 50-100 µA em cada julgamento até estimulação confiável pode evocar eventos interictais, como nos córtices hipocampal (verificar os sinais visualizados com o software de gravação).
6. Modulação elétrica do sistema límbico ictogenesis
7. Programa da unidade de estímulo para entregar o protocolo de estimulação de interesse. Use a amplitude do estímulo identificada durante o teste de I/O.
   Nota: A taxa de falha de respostas evocadas deve ser ≤20%.
8. Após estimulação para, verifique se a recuperação de rede para pre-estímulo condição pelo menos 4 descargas estável (como na etapa 13,4) de gravação.

Resultados

MEAs planares com 6 x 10 layout e afastamento entre eletrodos de 500 µm são o dispositivo de gravação ideal para o protocolo experimental descrito aqui, desde que sua área de gravação se estende por toda a fatia de cérebro na sua totalidade (Figura 3A, veja também¹⁷). Embora MEAs perfurados (pMEAs), seria preferíveis para melhorar a oxigenação dos tecidos, sua área de gravação é muito pequena (~ 2 mm de diâmetro). Isto não permite a visualização simultânea dos sinais elétricos gerados pelo hipocampo e os córtices hipocampal (dados não mostrados; ver¹⁸).

O padrão observado epileptiforme induzida por 4AP (Figura 3A) reproduz fielmente o que normalmente é observado neste modelo em vitro usando gravação potencial campo convencional e é composto por três tipos de atividade^{7, 26}: (eu) estável, como eventos (Figura 3B, pontas de seta) são duradouros robusto (> 20 s, intervalo: 20-60 s) eventos, assemelhando-se a características electrographic da atividade de apreensão com tônica e Clônicas componentes (Figura 3); Eles são gerados dentro os córtices hipocampal cada 3-5 min e re-introduzir a formação hippocampal através da circunvalação pectínea (Figura 3D, seta); (ii) descargas interictais como lentas (Figura 3B, rastreamento de CE, barra preta; expandida na Figura 3E) são curtas (< 1 s) eventos população gerados entre eventos estável ubiquitously dentro da preparação de fatia do cérebro hipocampo-CE e ocorrem em um lento ritmo (intervalo de 10-30 s); (iii) rápidoas descargas interictais como (Figura 3B, CA3 rastrear, barra preta; expandiu-se na Figura 3E) são recorrentes breves (< 1 s) eventos população gerados pelo subcampo hippocampal CA3; Quando são preservadas as garantias Schaffer, rápido orientado a CA3 eventos interictais propagam ao longo do loop hippocampal e exercem um efeito anti-ictogenic²⁴ (dados não mostrados); para evitar a atividade estável degradados, com a finalidade do protocolo descrito, CA3 saída é interrompida (cf. Figura 3B, E). Deve notar-se que a atividade interictais rápido orientado a CA3 gravada usando MEAs ocorre a um ritmo mais lento (~ 0,4 Hz) do que o que é observado usando o potencial de campo convencionais de gravação com pipetas de vidro (~ 1 Hz, faixa: 0,5 - 2,0 Hz, dados não mostrados).

O êxito da neuromodulação elétrica em fatias de cérebro de roedor depende da ativação de vias neuronais específicos²⁷ junto com a conectividade intrínseca entre as regiões incluídas na preparação²⁴. Nós testamos as fatias obtidas em ratos Sprague-Dawley macho adulto e ratos CD1 e nós encontramos esse rato ao invés de fatias de cérebro de rato para oferecer o melhor trade-off entre tamanho, espessura e conectividade intrínseca. Em primeiro lugar, graças a sua menor dimensão, couberam a área pequena gravação de MEAs comercialmente disponíveis melhor (Figura 4A, à esquerda: rato, certo: rato); em segundo lugar, eles são mais resistentes à condição desfavorável que é intrínseca à gravação de MEA (cf. introdução): embora estável, como descargas gerado por estes dois tecidos (Figura 4B) de duração semelhante (Figura 4 esquerda), sua taxa de ocorrência é significativamente menor em fatias de cérebro de rato (n = 10 fatias de cada espécie; 2-caudal não emparelhada teste t, p < 0,001; Direita da Figura 4 ). Este último permite acelerar os protocolos experimentais, tornando possível testar um número maior de fatias do cérebro durante um único dia experimental: para este conjunto de resultados representativos, podemos fazer um teste um número semelhante de fatias de cérebro de duas espécies (rato: n = 58; rato: n = 52), mas o número de ratos (n = 18) era 2 dobras menor do que o número de ratos (n = 42).

Além disso, as fatias de cérebro de rato parecem apresentar com conexões mais densas e, portanto, são mais propensos a responder melhor aos sustentado neuromodulação elétrica (Figura 4). Por isso, este modelo in vitro de ictogenesis, a viabilidade para estimulação elétrica, destinada a controlar a atividade estável é significativamente maior para o mouse do que para o tecido de cérebro de rato. Este aspecto reflecte-se também pela significativamente maior taxa de sucesso das experiências de estimulação realizada usando mouse contra fatias de cérebro de rato mesmo quando perseguindo vários protocolos de estimulação sustentada (Figura 4E). Na verdade, tecido de cérebro de rato parece suportar melhor estimulação elétrica sustentada, como sugerido pela maior taxa de sobrevivência dentro do tempo testado experimental-quadro de 4 h (Figura 4F). Assim, o menor tamanho junto com a melhor preservação da conectividade intrínseca faz fatias de cérebro de rato o melhor candidato para executar o MEA gravação visando estudar as interações de rede hippocampal-hipocampal e avaliar elétrica protocolos de neuromodulação que são relevantes para TLE.

Estimulação periódica entregue no CA1/subiculum é conhecido para controlar o sistema límbico ictogenesis na 4AP-tratados hipocampo-CE fatia preparação^24,25,27, com 1 Hz, como o mais eficaz de frequência²⁷. Assim, também é útil como um controle positivo para avaliar a eficácia e a eficiência de outras políticas de neuromodulação (ver, por exemplo,²⁵). Como mencionado acima, pulsos elétricos entregados diretamente através do MEA (ou seja, sem a necessidade de um eletrodo de estimulação externa) podem evocar respostas de população no tecido cerebral de roedores (ver também²⁸). Preservação suficiente de conectividade de rede neuronal dentro a fatia do cérebro, posicionamento exato da fatia para a MEA e a escolha apropriada de pares de eletrodo estimulante cerebral permitir prosseguir neuromodulação elétrica experiências que efetivamente o controle ictogenesis. Como mostrado na Figura 5A, é possível reproduzir o canônico 1Hz periódica ritmo protocolo usando MEAs planares como uma gravação e como um dispositivo estimulante, com o benefício adicionado que o efeito da estimulação elétrica pode ser visualizado em todo o secção de tecido cerebral com um maior número de pontos de observação espaçadas igualmente em comparação com a gravação de potenciais de campo convencionais. Figura 5B mostra a quantificação dos resultados obtidos para n = 9 fatias de cérebro, indicando uma redução significativa do total aproveitando o tempo (tempo total de atividade estável duração/observação²⁵) durante a estimulação (uma maneira-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, teste post hoc de Fisher LSD, protegidos). Os resultados são consistentes com a literatura por eletrodos estimulante externo^24,25.

Para calcular o total aproveitando o tempo, o tempo de observação depende o intervalo entre eventos estável, e também determina a duração mínima do protocolo de estimulação necessária para confiantemente, avaliar os efeitos de neuromodulação. Achamos que a gravação de pelo menos 4 descargas estável (e, portanto, pelo menos 3 intervalos entre eventos estável) é uma boa troca entre amostras coletadas e hora da coleta necessária. Na condição controle (ou seja, nenhuma estimulação), o tempo de observação é o intervalo entre o aparecimento do primeiro evento estável medido e o encerramento da última. Durante a neuromodulação, o tempo de observação é igual a duração do protocolo de estímulo, já que o objetivo da medição é quantificar os fenômenos que ocorrem ao longo do tempo que a perturbação é introduzida no sistema. Computação e comparando o total de aproveitar o tempo ao invés da duração e o intervalo de eventos estável são o parâmetro mais apropriado para evitar tipo erro II. De fato, juntamente com a supressão completa da atividade estável, também é possível que apenas um evento estável é gerado durante a estimulação elétrica em oposição as vários eventos observados na condição de controle. Neste caso, Considerando que não é possível medir o intervalo entre eventos, medindo a duração estável como um estimador da eficácia da estimulação não representa o resultado real de neuromodulação (ou seja, redução de atividade estável).

Globalmente, os resultados aqui apresentados indicam que as fatias de cérebro de rato acopladas ao MEAs são ferramentas valiosas para a investigação de epilepsia e para realizar estudos de neuromodulação confiável que são relevantes para o avanço do campo de DBS para o tratamento da epilepsia. Além disso, o protocolo descrito aqui melhora a viabilidade de fatia do cérebro e permite perseguir sessões experimentais por várias horas (Figura 6), que podem ser necessário, por exemplo, para comparar os efeitos da estimulação elétrica de diferente paradigmas.

Figura 3 : Padrão típico epileptiforme induzida por 4AP visualizada com medidas planar (A) Mouse cerebral fatia posicionada em um 6x10 MEA planar (afastamento entre eletrodos: 500 µm) e visão geral de side-by-side do padrão epileptiforme induzida por 4AP visualizado com gravação de MEA. Cada quadrado na grade acomoda a atividade registrada no local correspondente dentro da fatia do cérebro. Linhas azuis tracejadas referem-se as linhas de eletrodo para mais clareza. O número de eletrodo gravação é identificado em azul no canto superior esquerdo de cada quadrado. O cinzento cruzado quadrado representa o eletrodo de referência. (B) segmentos de rastreamento representativa dos padrões CE e CA3 visualizados em uma escala de tempo mais rápida. Setas indicam eventos estável. No rastreamento de CE é possível apreciar a ocorrência de lenta descargas interictais (pretas bar), Considerando que o subcampo CA3 gera o padrão típico fastinterictal sustentado (barra preta). (C) expandiu a gravação de uma descarga estável, mostrando o padrão típico de tônico-clônica. (D) visualização rápida escala da transição pré-ictal-para-estável correspondente para o CE (vermelho) e segmentos de rastreamento (preto) CA3 marcado pela barra vermelha em (B). A seta indica o início da descarga estável. Os traços sobrepostos destacam que o evento estável origina-se na CE e posteriormente se propaga para o subcampo CA3. (E) a visão expandida da interictais períodos marcados pelas barras pretas em (B) enfatiza a falta de correlação entre o slow e fastinterictal padrões gerados pela CE (vermelho) e CA3 (preto), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Fatias de cérebro de rato para oferecer uma maior produção experimental do que fatias de cérebro de rato. (A) cerebral fatia de um rato (à esquerda) e um mouse (direito) da idade correspondente. A fatia de cérebro de rato é muito maior que a área de gravação de MEA e sua atividade elétrica não pode ser visualizada na íntegra. (B) comparação visual direta da recorrente atividade estável gerada pelo rato e rato enthorinal córtex (CE). (C) Fatias de cérebro de rato e rato geram descargas estável de duração semelhante, mas o intervalo entre esses eventos é tecido de cérebro de rato em quase 2 vezes. * p < 0,05. (D) em comparação com ratos, camundongos oferta um 2 vezes maior rendimento de fatias de cérebro viáveis para experimentos de estimulação elétrica visa controlar ictogenesis. Estimulação elétrica do subiculum poderia evocar respostas da população nos córtices hipocampal em apenas 20 de fatias de cérebro de rato de fatias, em oposição a 33 de 52 (63%) do rato (34%) cérebro 58 (Chi²: 9,22; p = 0,002). p < 0,05. (E) entre fatias viáveis, a taxa de sucesso no controle da atividade estável é 2 vezes com o mouse contra fatias de cérebro de rato (rato: 20 de 33 fatias de cérebro, 60%: rato: 6 de 20 fatias de cérebro, 30%; Chi²: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. Mouse (F) fatias de cérebro podem suportar repetidas prolongadas épocas de prolongada estimulação elétrica (áreas sombreadas cinza). Após retirada do estímulo, tecido de cérebro de rato apresenta uma recuperação completa do padrão epileptiforme, Considerando que a viabilidade de tecido de cérebro de rato cai drasticamente em 3 h. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Experiência representativa de modulação elétrica de ictogenesis usando fatias de cérebro acoplado à medida do (A) gravações de atividade estável 4AP-induzida na CE e PC durante a condição de controle (sem estímulo), periódica de estimulação (PP) a 1 Hz (artefato de estímulo é truncado) e durante a recuperação após a retirada do estímulo. (B) a quantificação do efeito de PP a 1 Hz em total aproveitando o tempo. p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Representante gravação a longo prazo da atividade estável induzida por 4AP. (A) Trace segmentos gravado 8 h após o cérebro procedimento de corte e seguir 2h de 4AP aplicativo. (B) Expanded traçar segmentos correspondentes a descargas estável Box identificadas pelo letras a, be c no painel (A) mostrar a consistência de atividade estável gerada durante a tempo de observação prolongada-viúva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A ações	Produto químico	Peso molecular	Concentração (mM)
	NaCl	58.44	1150
Solventes: água destilada	KCl	74.55	20
Concentrado: 10 x	KH2PO4	136,1	12.5
Temperatura de armazenamento: 4 ° C	CaCl2* 2 H2O	147.02	20
Tempo máximo de armazenamento: 1 wk	D-glicose	180.2	250
Nota: filtrar usando um filtro de membrana de 50mm
Estoque B	Produto químico	Peso molecular	Concentração (mM)
	NaHCO3	84.01	260
Solventes: água destilada
Concentrado: 10 x
Temperatura de armazenamento: 4 ° C
Tempo máximo de armazenamento: 1 wk
Nota: filtrar usando um filtro de membrana de 50mm
Estoque de C	Produto químico	Peso molecular	Concentração (mM)
	KCl	74.55	20
Solventes: água destilada	KH2PO4	136,1	12.5
Concentrado: 10 x	MgCl2* 6 H2O	203.3	50
Temperatura de armazenamento: 4 ° C	MgSO4* 6 H2O	246.47	20
Tempo máximo de armazenamento: 2 semanas	CaCl2* 2 H2O	147.02	5
Nota: filtrar usando um filtro de membrana de 50mm
Estoque M	Produto químico	Peso molecular	Concentração (mM)
	MgSO4* 6 H2O	246.47	100
Solventes: água destilada
Concentre-se: 100 x
Temperatura de armazenamento: 4 ° C
Tempo máximo de armazenamento: 4 semanas
Estoque de 4AP	Produto químico	Peso molecular	Concentração (mM)
	4-aminopiridina	94.11	250
Solventes: água destilada
Concentrado: 1000 x
Temperatura de armazenamento: 4 ° C
Tempo máximo de armazenamento: 2 semanas
Nota: vórtice para 2-3 min ou stirr por 30-60 min
Nota: cuidado! 4-AP é tóxico e cinvulsant. Usar luvas e evitar a disseminação ou derramamento.

Tabela 1: Soluções de estoque.

SEGURANDO A ACSF			ACSF GRAVAÇÃO			CORTE ACSF
Produto químico	C [mM]		Produto químico	C [mM]		Produto químico	C [mM]
NaCl	115		NaCl	115		Sacarose	208
KCl	2		KCl	2		KCl	2
KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25
MgSO4	1.3		MgSO4	1		MgCl2	5
CaCl2	2		CaCl2	2		MgSO4	2
D-glicose	25		D-glicose	25		CaCl2	0,5
NaHCO3	26		NaHCO3	26		D-glicose	10
Ácido L-ascórbico	1		Ácido L-ascórbico	1		NaHCO3	26
						Ácido L-ascórbico	1
pH	7.4		pH	7.4		Ácido pirúvico	3
Pressão osmótica	300 mOsm/Kg		Pressão osmótica	300 mOsm/Kg
						pH	7.4
						Pressão osmótica	300 mOsm/Kg

Tabela 2: Composição de soluções.

Solução de problemas
QUESTÃO			CONTRAMEDIDAS
Descargas estável olhem 'em partes'			Diminuir a taxa de perfusão e/ou diminuir o volume, ACSF acima a fatia do cérebro, ajustando a posição da agulha de aspiração.
Nenhuma atividade estável			(1) Verifique se orientado em CA3 eventos interictais rápido não se propagam para o córtex. Use uma lâmina de bisturi pequeno (por exemplo, n.10) ou uma agulha para romper a colaterais de Schaffer se precisa ser, mas tenha cuidado para não cortar os fios de nylon da âncora grampo fatia. Um estéreo - ou microscópio vertical são mais adequados, Considerando que o microscópio invertido torna esta tarefa muito difícil.
			(2) Verifique a viabilidade de fatia: pode forte estimulação elétrica desencadear atividade estável? Esperar até cerca de 2h de 4AP aplicativo e, em seguida, alterar a fatia do cérebro se não ocorrer atividade estável.
A fatia do cérebro se move quando colocar a âncora do grampo			(1) gentilmente remover âncora a fatia e reposicionar a fatia do cérebro.
			(2) Verifique se a âncora fatia é uniformemente molhada de 4AP-ACSF.
			(3) remova o 4AP-ACSF da câmara de gravação para favorecer a adesão de fatia do cérebro para a MEA.
			(4) reposicione a âncora de grampo de fatia.
A fatia do cérebro flutua no chip MEA após ser transferido			(1) aspire suavemente ACSF em excesso com uma pipeta Pasteur.
			(2) chip de the MEA talvez precise ser re-revestido.
Estimulação elétrica não eliciar respostas de rede			Aumentar a intensidade do estímulo, pares de eletrodo de mudar.
Estimulação elétrica pode eliciar respostas de população nas áreas corticais proximais mas não distais			A questão é outeiros devido à conectividade pobre ou estímulo muito baixa intensidade. Estimulação elétrica pode ser ineficaz ou eficaz em algumas áreas corticais só. É recomendável alterar a fatia do cérebro.
O sinal está ruidoso			(1) Verifique o eletrodo de referência: barulhento, linha de base às vezes pode ser causada pelo preenchimento incompleto do reservatório de entrada, tal que os eletrodos de referência que não completamente profundamente a ACSF.
			(2) Verifique o aterramento geral do equipamento.
			(3) ajuste da posição da agulha de aspiração, a fim de ouvir um som de sucção constante e suave. A agulha de aspiração de chão.
			(4) Limpe os contatos externos de MEA com etanol utilizando um cotonete.
			(5) pode danificar o chip the MEA: mudar o chip de MEA e verificar os artefatos e a relação sinal-ruído.

Tabela 3: solução de problemas.

Discussão

MEAs são uma ferramenta valiosa para investigações de neurofisiologia e tem atingido a maturidade nos últimos anos graças a décadas de exploração e desenvolvimento. Em comparação com a gravação de potenciais de campo convencional, MEAs oferecem a grande vantagem de um maior número de pontos de observação e distância eletroda inter conhecida, que são cruciais para identificar com precisão as interações de rede neuronal.

A técnica de gravação MEA também pode ser acoplada a outras abordagens de eletrofisiologia, tais como gravação remendo-braçadeira¹⁵, para investigar a relação entre um único neurônio e atividade da rede neuronal. Além disso, a possibilidade de visualizar o campo potenciais e multi-unidade atividade simultaneamente pode fornecer insights preciosos sobre a correlação entre a atividade de pequenos conjuntos neuronais e redes neuronais coletivas. A combinação com corantes sensíveis à voltagem, imagem de cálcio e optogenetics²⁹ permite inferir fenômenos de Neurofisiologia utilizando abordagens poliédrico. Além de estudos farmacológicos, a possibilidade de realizar tanto a gravação e a estimulação com o mesmo sistema faz a técnica de gravação MEA muito poderoso e versátil: por exemplo, é possível estudar os fenômenos de plasticidade sináptica na núcleo de memória formação³⁰, usando os protocolos de neuromodulação apresentados aqui, que são relevantes para DBS para tratar a epilepsia e uma grande variedade de distúrbios cerebrais. A recente prova que a técnica de gravação MEA pode ser aplicada com sucesso ao cérebro humano epiléptica tecido¹⁶ demonstra sua utilidade inestimável na investigação de epilepsia, tanto para compreender os mecanismos básicos subjacentes a esta doença devastadora e para aperfeiçoar algoritmos DBS para amenizar isso.

No entanto, MEAs forçar a busca de experiências de eletrofisiologia em condições de 'limite' para fatias do cérebro, devido a exigência de uma câmara de gravação submerso e a necessidade de deixar o cérebro fatia restante sobre o substrato sólido onde os microeletrodos são integrados. Assim, o tecido cerebral não pode receber adequada de oxigênio, que por sua vez pode afetar a qualidade das gravações.

O protocolo descrito aqui permite gravar de forma confiável e estudar ictogenesis em roedores redes sistema límbicas acopladas ao MEAs usando o modelo de aguda 4AP in vitro e prosseguir épocas de prolongada estimulação elétrica, que fornecem informações relevantes para a avaliação das políticas DBS.

Estudos anteriores na neuromodulação elétrica de epilépticas límbicas redes baseados no uso de potenciais gravação convencional de campo usei fatias de cérebro de rato ou rato com semelhante resultados^2524,; Mas o uso de tecido de cérebro de rato provou ser mais desafiador, razoavelmente devido a conectividade mais fraca em comparação com o tecido cerebral obtido a partir de ratos⁷. No que se refere a técnica MEA, fatias de cérebro de rato são mais adequadas em virtude de sua menor dimensão. Além disso, dada a maior taxa de ocorrência de descargas estável, como em rato contra tecido de cérebro de rato, é possível testar significativamente mais fatias de cérebro durante todo um dia experimental, que por sua vez faz a coleta de dados mais rápida e eficiente, e pode Reduza o número de animais utilizados.

Importância no que diz respeito a métodos existentes:

Descargas estável gravadas usando a câmara personalizada descrita aqui parecem ser semelhantes, em duração e taxa de ocorrência àqueles observados usando a câmara de anel MEA convencional e o mesmo tipo MEA (microeletrodos planares, cf. ¹⁷). No entanto, ele precisa ser enfatizado que espessura da fatia cerebral deve ser significativamente reduzida quando utilizando a câmara de gravação redonda convencional juntamente com uma taxa baixa perfusão (1 mL/min), que pode dificultar a busca bem sucedida da neuromodulação experimentos devido a conectividade pobre.

Neste protocolo, uma câmara de gravação personalizada de baixo volume inspirada pela concepção da remendo-braçadeira gravação câmara fornece fluxo laminar estável e confiável que é crucial para a bem sucedida busca de gravações de MEA; Ele também permite aumentar a espessura da fatia de cérebro de 400 µm para atingir uma troca justa entre viabilidade de tecido e conectividade intrínseca. É fato reconhecido que o fluxo laminar da solução de gravação dentro da câmara é altamente desejável para eletrofisiologia de fatia do cérebro, desde que não é afetado pela temperatura, oxigênio, e gradientes de pH que são observadas no fluxo circular redonda gravação câmaras^19,20,31 (como os fornecidos com MEA comercialmente disponível). Tais gradientes introduzir viés experimental e também são prejudiciais para a fatia do cérebro. Câmaras de gravação de um volume relativamente pequeno (~1.5 mL) junto com uma perfusão elevada taxa (5-6 mL/min)^16,31 permitam intercâmbio adequado do meio de perfusão (≥3 vezes / min). A câmara personalizada pode ser facilmente obtidos de fontes comerciais, a um preço acessível ou produzidos internamente, utilizando tecnologia de impressão 3D. Outros estudos relataram gravações MEA de 400 µm de espessura de cérebro humano fatias¹⁶ utilizando a câmara de anel MEA convencional, mantendo o volume ACSF para 1 mL e impor uma taxa de perfusão elevada (5-6 mL/min) com a ajuda de uma bomba peristáltica de baixo ruído. No entanto, os autores utilizaram um modelo diferente de ictogenesis, ou seja, o baixo Mg^{2 +}, que é provável que o modelo 4AP menos influenciada ephaptic mecanismos envolvendo um aumento significativo na concentração extracelular de K^{+ 11 , 22}. encontramos que uma taxa elevada de perfusão não é desejável no modelo 4AP, possivelmente devido a lavagem rápida fora de acumulada extracelular K⁺, que talvez precise ser aumentado significativamente na gravação ACSF¹⁶. Na verdade, eventos estável apareceram mais em 'partes' quando a velocidade de perfusão ASCF foi aumentada para 2-3 mL/min e a fatia do cérebro foi submerso por uma espessa camada ACSF, Considerando que as descargas full-blown exibindo robustos componentes tônico-clônica poderiam ser restauradas após o retorno ao uma taxa mais baixa perfusão (1 mL/min) e um mais fino ACSF camada direita no nível da superfície de tecido (dados não mostrados). A câmara de gravação personalizada descrita neste protocolo permite trocar o meio de perfusão de 3 - 5 vezes / min em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Assim, o suprimento de oxigênio global para as fatias de cérebro é fortemente melhorado mesmo em taxas relativamente baixa perfusão, garantindo ainda um estábulo gravação de temperatura e alta relação sinal-ruído. Mais importante ainda, é possível manter a concentração extracelular de K⁺ para um valor fisiológico.

O modelo de 4AP de ictogenesis não requer qualquer modificação significativa da composição iônica ACSF, tais como redução Mg^{2 +} ou crescente K⁺e oferece a vantagem exclusiva de manter intacta a transmissões excitatórias e inibitórias ¹², um aspecto que é altamente relevante na investigação de epilepsia, tendo em conta o papel crucial de glutamatérgico e gabaérgica redes em sincronização epileptiforme (cf. ⁷). O 4AP-ACSF usado neste protocolo contém uma concentração fisiológica de K⁺ (3,25 mM) e Mg^{2 +} concentração ligeiramente menor do que a exploração ACSF (1 mM contra 1,3 mM). Esta concentração ainda cai dentro dos valores fisiológicos relatados de Mg^{2 +} concentração no roedor CSF e é usado em muitos laboratórios (ver, por exemplo,^17,,¹⁸). Para o propósito do protocolo descrito, achamos que este ligeiro decréscimo é preferido para auxiliar no efeito do 4AP.

Em trabalho anterior, 4AP aplicou-se para a fatia do cérebro quando ele já estava posicionado dentro da câmara de gravação^17,18. A menos que o experimentador precisa observar a latência de tempo entre a aplicação de 4AP e o aparecimento de padrões epileptiforme, descobrimos que essa abordagem é bastante demorada e não é adequada para prosseguir a gravação prolongada e sessões de estimulação descrito neste protocolo. Pré-incubação de fatias de cérebro em 4AP a 32 ° C permite poupar tempo muito experimental, desde as fatias do cérebro podem ser previamente tratadas em série enquanto prossegue o experimento usando outras secções de tecido.

A prolongada viabilidade de fatias do cérebro pode ser útil para analisar as características da rede a longo prazo. Além disso, sua resiliência melhorada para estimulação elétrica repetitiva é de grande vantagem se o experimentador quer comparar vários protocolos de estimulação, que devem ser realizados na mesma fatia do cérebro para robustez estatística. Em nossas mãos, quando o teste 3 protocolos de estimulação, cada uma precedida por uma fase de controlo e seguido por uma fase de recuperação, a experiência pode durar 3-5 h. Neste contexto, ao mapeamento de MEA é crucial para ativar o caminho correto e suprimir, ao invés de favorecer a ictogenesis através de estimulação elétrica. Nossa GUI amigável representa uma ferramenta rápida, simples e flexível para mapear os eléctrodos de estruturas cerebrais diferentes. Ao contrário do software comercial, é possível adicionar layouts personalizados de MEA mesmo com habilidades básicas de programação. Imagens podem ser adquiridas em campo claro; assim, qualquer câmera de propósito geral que tem boa resolução e se encaixa em um microscópio é apropriada. Um microscópio invertido é essencial para visualizar a posição de microeletrodos em relação a fatia do cérebro, uma vez que estas ia ser escondidas por baixo do tecido se usando um microscópio vertical. No entanto, um estereoscópio recomenda-se, além do tipo invertido, se o experimentador precisa executar cortes de faca para interromper as vias neuronais específicas.

Finalmente, uma vantagem adicional da abordagem proposta é a montagem barata e relativamente fácil da maioria das ferramentas necessárias, como a câmara de gravação personalizada e câmaras de exploração, o banho quente e a fatia de âncora, bem como o uso desnecessário de um caro bomba peristáltica de baixo ruído.

Limitações da técnica:

Gravação de MEA não permite visualizar ondas muito lentas, ou seja, DC desloca-se no sinal. Tais desvios da linha de base podem ajudar assintótica medição da duração de descarga estável e, mais importante, eles são fundamentais para estudar a depressão espalhando cortical (um fenômeno que se relaciona com a morte inesperada súbita em epilepsia³² e é compartilhado entre enxaqueca e epilepsia³³).

No que se refere a neuromodulação elétrica, o protocolo descrito aqui permite realizar várias sessões de estimulação sem afetar a viabilidade de fatia do cérebro. Poderíamos fazer com êxito até 3 sessões de estimulação de 20-45 min, semelhante ao que relatou no anterior trabalho²⁵. Apesar de fatias de cérebro provavelmente podem suportar um número maior de sessões de estimulação ou mais protocolos de estimulação, não testámos fatias de cérebro a este respeito. É recomendável limitar o número de protocolos de estimulação para 3 e evitando prolongadas sessões de estimulação (≥60 min), que podem significativamente estresse mantido sob estas condições de limite, até a falta de recuperação após a retirada do estímulo de tecido cerebral.

Passos críticos dentro do protocolo:

Vários fatores críticos podem impedir a busca bem sucedida da gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro acoplado a MEA. Além das espécies de roedores utilizadas e a qualidade das fatias do cérebro, a taxa de perfusão durante a gravação e a dinâmica do fluxo ACSF (i. e., laminar contra circular) dentro da câmara de gravação, encontramos que as condições de recuperação e manutenção a longo prazo das fatias do cérebro, bem como o modo de aplicativo do 4AP são os passos mais críticos.

Ao usar uma câmara de exploração submerso é crucial armazenar as fatias do cérebro à temperatura ambiente para preservar a atividade de rede de tecido cerebral e favorecer a indução de estável, como descargas pelo aplicativo 4AP. Em nossas mãos, recuperação e manutenção a 32 ° C deteriorou-se o tecido de cérebro dentro de 3-4 h de fatiar.

Fatias de incubação do cérebro em 4AP-ACSF à temperatura ambiente e gravação a 32 ° C é, no entanto, não é desejável. Encontramos muitas dificuldades em observar robustas recorrentes descargas estável nesta condição. Com efeito, baixas temperaturas na faixa de 20 a 24 ° C têm sido relatadas para umedecer ou até mesmo evitar ictogenesis induzida por 4AP ambos em vitro³⁴ e na vivo³⁵. Assim, as temperaturas de incubação e gravação de 4AP devem ser abrangidos o 30-34 ° C e devem ser correspondidas. Para evitar colocar o tecido cerebral sob muito stress devido a indução simultânea de hiperexcitabilidade por 4AP e a exposição súbita de fatias de cérebro da temperatura para a morna (32 ° C) 4AP-ACSF, é fundamental realizar um pré-aquecimento intermediário passo e deixe que as fatias de cérebro se habituar à exploração ACSF a 32 ° C, durante 20-30 min. pular esta etapa podem afetar a indução de ictogenesis por 4AP.

Outro aspecto que deve ser mencionado é a importância da concentração de D-glicose na ACSF após fatiar. Uma concentração de 25 mM preserva as fatias do cérebro melhores do que a concentração de 10 mM, utilizada em muitos laboratórios e também melhora a taxa de ocorrência de atividade estável, que é 2 vezes mais rápida (assim, tornando mais fácil para perseguir uma longa série de experimental protocolos em várias fatias de cérebro cada dia).

Por último, alguns detalhes importantes durante o procedimento de corte precisam ser mencionado. Em primeiro lugar, não permitir que o cérebro intacto e as fatias de cérebro para congelar no frio corte ACSF. Refrigeração do cérebro para < 2 min é suficiente, dado o pequeno tamanho do cérebro do rato. Cortes de tecido devem ser transferidos imediatamente da bandeja do amortecedor para o béquer lavagem à temperatura ambiente. ACSF enxaguar o corte é muito importante, que caso contrário a concentração de sacarose alta fará com que o cérebro fatias grudar a malha de nylon da câmara de exploração. Para efetivamente enxaguar o tecido, é importante minimizar o conteúdo ACSF corte dentro da pipeta de transferência a fim de não contaminar a exploração ACSF excessivamente. A lavagem de 2 estágios ajuda a minimizar a contaminação. Após a conclusão do procedimento de corte, cortes de tecido devem ser transferidos imediatamente partir os copos de lavagem para a câmara de exploração, onde a macia de nylon malha suspensa a meio caminho na exploração ACSF permite a oxigenação dos tecidos em ambos os lados. O mesmo princípio deve ser aplicado em todas as fases seguindo o procedimento de corte: fatias de cérebro nunca devem sentar-se no fundo do copo, não devem estar em contacto com os lados das câmaras de exploração, e eles nunca devem estar em contacto entre si, nem se sobrepõem.

Modificações e solução de problemas:

Composição de ACSF pode ser modificada de acordo com necessidades do experimentador. Por exemplo, drogas podem ser adicionadas para dissecar a contribuição de neurotransmissores específicos ou canais iônicos para a eficácia de neuromodulação elétrica. Além disso, pirúvico e ácido ascórbico (cf. quadro 2) podem ser omitidos, apesar de acharmos que eles exercem um papel neuroprotetor poderoso. Nós relatamos na tabela 3 os problemas mais comuns que podem ser encontrados no presente protocolo e como lidar com eles.

Conclusões:

Gravação de MEA, sem dúvida, é uma técnica de inestimável para abordar as interações das redes neuronais na saúde e na doença. Além de estudos farmacológicos, também é possível avaliar protocolos de neuromodulação elétrica que são relevantes para DBS aplicado a epilepsia e outras doenças neurológicas. Neste protocolo, mostramos que é possível reproduzir os experimentos de estimulação periódica típica com resultados semelhantes aos obtidos com potencial gravação convencional campo extracelular e externo de eletrodos de estimulação. A crescente disponibilidade de equipamentos comerciais de user-friendly e ferramentas de software avançadas fazem a técnica de gravação MEA também apropriado para experimentos de estimulação de loop fechado, para fornecer a estimulação ad hoc para o tecido cerebral e investiga a contribuição dos mecanismos de feedback às respostas da rede neuronal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Poli-D-lisina	Sigma-Adrich	P7886	Necessário para revestimento MEA
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Químico
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Químico
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	Químico
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	D-glicose química
	Sigma-Adrich	RDD016
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761	MgCl químico
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	Chemical
Sucarose	Sigma-Adrich	RDD023	Ácido
Pirúvico Químico, 98%	Sigma-Adrich	107360	Químico
4-aminopiridina	Sigma-Adrich	A78403	Droga convulsiva
STG-2004	Sistema multicanal	STG4004-1.6mA	Gerador de estímulo de 4 canais com tensão (± 8 V) e saída de corrente (± 1,6 mA)
MEA1060	Sistema Multicanal	N/A	Amplificador MEA
planar MEA	Sistema Multicanal	MEA 60MEA500/30iR-Ti sem anel	Deve estar sem anel para permitir o uso da câmara de gravação personalizada
Sistema		Multicanal McRack	Software de gravação
Sistema		McStimulus II	Software de controle STG4004
TC02	Sistema Multicanal	TC02	Termostato de 2 canais
PH01	Sistema Multicanal	PH01	Cânula de perfusão de aquecimento
MPH	Sistema Multicanal	MPH	Suporte magnético para PH01 e agulha de sucção
Elastostil E43	Wacker	E43	Selante elastomérico usado para montar a câmara de gravação personalizada no MEA MEA
Custom Chamber	Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	Custom recording chamber
Eletrodo Ag/AgCl, pellet, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	Eletrodo de referência para a câmara de gravação personalizada
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Limpador enzimático
MATLAB	Mathworks		para eletrodemapeamento
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Pellet de eletrodo Ag-AgCl 1,0 mm (E205). Eléctrodo de referência.