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Artigo de método

A Perinatal asfixiado cordeiro modelo: Um modelo para a reanimação neonatal

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DOI:

10.3791/57553

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15 de agosto de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California Davis, 2Department of Pediatrics, University at Buffalo

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Instrumentação invasiva do cordeiro fetal fornece medições precisas de fisiológicas da circulação transição em um modelo que imita pròxima o bebê recém nascido.

Resumo

Asfixia do nascimento responde por quase 1 milhão de mortes no mundo anualmente e é uma das principais causas de mortalidade e morbidade neonatal precoce. Muitos aspectos das atuais orientações reanimação neonatal permanecem controversos, dadas as dificuldades na realização de ensaios clínicos randomizados devido a frequentes e muitas vezes imprevisível precisa de ressuscitação extensa. A maioria dos estudos sobre reanimação neonatal derivam de modelos de manequim que não reflectem verdadeiramente alterações fisiológicas ou modelos Leitão que tiver desmarcado seu fluido do pulmão e que tenham concluído a transição do feto para a circulação neonatal. O presente protocolo fornece uma descrição detalhada passo a passo sobre como criar um modelo de cordeiro fetal asfixiado perinatal. O modelo proposto tem uma circulação de transição e os pulmões cheios de líquido, que imita a recém-nascidos humanos após o parto e é, portanto, um excelente modelo animal para estudar a fisiologia do recém-nascido. Uma limitação importante para experimentos de cordeiro é o maior custo associado.

Introdução

Asfixia perinatal ocorre em aproximadamente 4 por 1.000 nascidos de termo nos Estados Unidos e é responsável por aproximadamente 25% dos 4 milhões de mortes neonatais no mundo1,2. Durante todo o desenvolvimento natural do feto, várias adaptações devem ocorrer durante o parto e no nascimento para permitir uma transição suave para o ambiente extra-uterina do intraquando os pulmões assumem o papel da placenta como órgão de trocas gasosas. Qualquer falha do recém-nascido a transição adequada ao nascimento mais compromete os esforços de ressuscitação. Instâncias quando afastamento pulmonar fetal é incompleto ou atrasado3,4e as circunstâncias que resultam em um impacto de5 persistente alta resistência vascular pulmonar (PVR) a eficácia da ventilação, que continua a ser o mais importante intervenção na reanimação do recém-nascido asfixiado6. Além disso, a imediata fixação do cordão umbilical e remoção da placenta baixa resistência pode levar a mudanças abruptas no débito cardíaco que podem causar disfunção miocárdica7,8.

Devido à necessidade frequente para ressuscitação agressiva (necessidade de compressões torácicas e/ou administração de epinefrina)1,9, há uma falta de evidência forte de grandes ensaios clínicos randomizados para suportar a corrente diretrizes do programa (NRP) de reanimação neonatal. Muitos estudos de pesquisa translacional em reanimação neonatal são realizados utilizando modelos animais pós-natal (particularmente leitões) que deixam de retratar adequadamente a transição circulação fetal e pulmões cheios de líquido inerentes ao recém-nascido na entrega quarto. Tendo em conta os desafios relacionados a transição da circulação fetal para a circulação neonatal, o modelo de cordeiro fetal perinatal asfixiado cardíaca é ideal para estudar a fisiologia de ressuscitação neonatal.

Os estudos por Joseph Barcroft sobre fetal cordeiros, já desde a década de 1930, lançou as bases para a fisiologia fetal e neonatal10. Na segunda metade doséculo 20 , modelos de cordeiro de experiências inovadoras e meticulosas de Geoffrey Dawes na fetal, e mais tarde aqueles por Abraham Rudolph tremendamente contribuíram para o conhecimento da fisiologia cardiovascular e pulmonar no feto 11 , 12. nos últimos anos, estudos sobre modelos de cordeiro fetal/neonatal proporcionaram uma melhor compreensão do impacto da ventilação na hemodinâmica13,14, os efeitos de oxigenação no PVR15,16, bem como as alterações circulatórias que ocorrem durante o cordão de aperto7,17. Finalmente, no ano passado, o cordeiro recém-nascido tem servido como um novo modelo para estudar os efeitos hemodinâmicos durante a reanimação18,19,20. Uma narrativa passo a passo do que está envolvida na condução de um experimento de cordeiro, bem como uma descrição detalhada da instrumentações cirúrgicas e será apresentada a metodologia experimental.

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Protocolo

Todos os protocolos foram aprovados pela institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) pelo Búfalo State University of New York. Uma ilustração da metodologia retratando invasiva e não invasiva de monitorização é mostrada na Figura 1.

1. os animais

  1. Uso de tempo-datado, febre Q soronegativa, grávidas as ovelhas (raça misturada-raça, Suffolk-Dorset-Katahdin) com cordeiros fetais em gestação 127-143 dias.
    Nota: A gestação de termo de ovelhas é 145 dias e 127 gestação cordeiros se comportam como prematuros extremos.

2. pré-cirúrgica preparação

  1. Reter comida o Ewe 12 h antes da cirurgia.
  2. Sedar a ovelha com diazepam de (IV) por via venosa (0,25-1,5 mg/kg) e cetamina (4 mg/kg).
  3. Guia da ovelha em prostração lateral para um carro de elevador.
  4. Mova a ovelha para prostração dorsal em uma mesa cirúrgica V-top.

3. anestesia

Nota: Antes da cesariana, a ovelha é sedada com diazepam e cetamina e intubada seguido por inalação contínua de isoflurano (1 – 4%). Adequação da anestesia é monitorada pela avaliação dos reflexos de Tom e olho músculo juntamente com o monitoramento contínuo do nível de oxigênio do sangue com um oxímetro de pulso e o ritmo cardíaco. Durante a instrumentação, cordeiros estarão sob a influência da anestesia materna e também receberá anestesia local para sites de instrumentação.

  1. Entube a ovelha com um tubo endotraqueal de 10,0 mm algemado (ETT). Avance o ETT o vocal através de cabos de 1 a 2 cm além da braçadeira. Insuflar a braçadeira ETT e amarrar o ETT em torno da mandíbula a ovelha para fixá-lo no lugar.
    1. Quando a resposta palpebral está ausente, ajustar o isoflurano (2-3% é geralmente suficiente).
    2. Fornece respirações artificiais por ventilação mecânica convencional (CMV) com uma fração inspirada de oxigênio (FIO2) de 0,21. Conjunto do ventilador para fornecer o volume tidal de 10 a 15 mL/kg.
    3. Monitore a saturação da oxihemoglobina continuamente por um oxímetro colocado na língua de ovelha.
    4. Medir o end-tidal de dióxido de carbono (EtCO2) com um capnógrafo.
    5. Ajuste o FIO2 e CMV para manter a saturação da oxihemoglobina entre 90-97% e expirado CO2 entre 35-45 mm Hg, respectivamente.
  2. Fixe os membros a ovelha para a mesa cirúrgica com cordas cirúrgicas.
    1. Ajuste a mesa de cirurgia para reverter a posição de Trendelenburg para aliviar a pressão sobre o feto.
  3. Coloca um tubo orogástrico para descomprimir e esvazie o conteúdo gástrico.
  4. Suplemento de soro (solução salina normal ou solução de lactato de Ringers) 10 mL/kg/h.
  5. Coloca uma sonda de temperatura retal para obter a temperatura do núcleo contínuo.

4. cirurgia

Nota: A cesariana e fetais procedimentos são considerados cirurgias agudas em que os animais são sacrificados através da administração de sódio pentobarbital 100 mg/kg IV. As ovelhas são sacrificadas após a entrega dos cordeiros e os cordeiros são sacrificados após a conclusão dos experimentos. Eutanásia é confirmada por assistolia. Um método secundário de toracotomia bilateral ou perda de sangue também é empregado. Neste caso, a técnica asséptica não é praticada durante a cirurgia. O pessoal ainda precisa usar vestuário de protecção durante contato animal.

  1. Raspe a lã do abdômen ventral.
  2. Usar o cautério tornar-se uma incisão superficial abdominal de 15 – 18 cm sobre o linea alba para expor a fáscia.
    1. Crie uma pequena abertura para o abdômen, usando a pressão com um hemostat com ponta rombudo.
    2. Manter esta abertura enquanto desliza uma tesoura de ponta romba na parede abdominal.
    3. Use a tesoura para completar a incisão do linea alba.
  3. Localize e exteriorize a cabeça do feto dentro do útero no abdômen.
    1. Segure a cabeça do feto com uma mão e use o cautério tornar-se uma incisão de 10 cm da parede uterina (sobre a fronte do cordeiro). Certifique-se para evitar qualquer cotilédones.
    2. Use pinça Babcock para fixar as camadas do útero e da placenta juntos nos quatro cantos opostos.
    3. Expor a cabeça do cordeiro através do útero e fora do abdômen a ovelha.
    4. Deixe a pinça Babcock deitado fora do abdome durante a cirurgia fetal.

5. fetal das vias respiratórias

  1. Entubar o parcialmente exposto fetal cordeiro com um 3.5-4.5 mm algemado ETT. Avança o ETT através das cordas vocais 1cm além da braçadeira.
    1. Insuflar a braçadeira e fixe o ETT, amarrando uma fita umbilical em volta do tubo e, em seguida, em torno da cabeça.
    2. Deixe o óleo excesso pulmonar fetal no ETT para drenar passivamente inclinando a cabeça para o lado. Isso simula a saída de líquido do pulmão durante o parto.
    3. Ocluir o ETT para evitar a troca de gás durante ofegante no período.

6. pescoço navio instrumentação

  1. Raspar a lã e infiltrar-se 1 a 2 mL de cloridrato de bupivacaína subcutânea (0,25%) em todos os locais de incisão.
    1. Fazer duas incisões na pele de 3 cm em cada lado do pescoço (aproximadamente 6cm distal na cabeça) adjacente à traqueia. As incisões devem transversal do pescoço.
    2. Realize a incisão usando o cautério enquanto acampar a pele, para evitar lacerar o tecido profundo.
  2. Separe a fáscia usando pinça Kelly ou mosquito curvada.
  3. Isole a veia jugular interna direita e artéria carótida comum direita.
    1. Lugar duas de 20 cm, 0 suturas de seda sob ambas as naves.
    2. Permita um espaço (proximal para distal) de 1 cm entre as suturas de seda.
    3. Levante suavemente cada sutura que é em torno do navio, superficialmente, para restringir o fluxo de sangue e fazer um corte transversal de 1-2 mm para o recipiente com uma tesoura cirúrgica de Iris.
  4. Para a artéria carótida, inserir um cateter previamente corada (15-17 G) na artéria carótida direita caudalmente para o arco aórtico para monitorização da pressão de sangue e de amostra de sangue.
    1. Use a gravata proximal para ligate a artéria completamente.
    2. Repita as etapas 6.3.2 - 6.3.3.
    3. Introduza o cateter arterial carótido previamente corado e usar a sutura de seda distal para amarrar ao redor da artéria e o cateter com 3 nodos.
  5. Uso uma técnica semelhante, para inserir um cateter previamente corada (14 – 16 G) na veia jugular, repita os passos 6.3.2–6.3.3, avançar 7 – 10 cm caudalmente para descansar dentro da entrada torácica (no sentido do átrio direito). Isto é usado para administração de fluidos e medicamentos, bem como medições de pressão venosa.
    1. Verifique o cateter para desobstrução com soro fisiológico heparinizado e conclua o laço de sutura ao redor do navio e o cateter (com a sutura proximal só) usando 2 – 3 knots.
    2. Introduza o cateter segundo (14 – 16 G) aproximadamente 5 cm rostral para coletar sangue da circulação cerebral. Use o mesmo corte para a colocação de cateteres de ambos.
    3. Repita a etapa 6.5.1 no que tange à sutura distal e cateter e em seguida, amarre as suturas de seda em torno das linhas opostas do cateter para fixá-los no lugar para evitar a torção.
  6. Estenda a incisão feita anteriormente em uma T-forma (1 a 2 cm) no lado esquerdo.
    1. Eleve a carótida esquerda usando hemostatos curvados abertos.
    2. Coloque uma 2mm perivascular fluxo-sonda ao redor do navio para medir o fluxo de sangue.
    3. Cobrir a fluxo-sonda com uma manga de polímero flexível de 1 cm para estabilizar a sonda em posição.
    4. Coloque a linha de cabo de fluxo-sonda para a incisão em forma de T, permitindo que o cabo executar em paralelo com o navio.
    5. Feche a incisão da pele. Amarre o cabo e em torno de um laço do cabo, para evitar restringir o fluxo se puxado.

7. grande embarcação instrumentação

  1. Extrair o feto cordeiro para expor o peito e cobrir a pele exposta com envoltório de polietileno para evitar a perda de calor.
  2. Coloque o cordeiro em prostração lateral direita.
  3. Posição do membro anterior esquerdo ao redor do pescoço para expor o local cirúrgico.
  4. Infiltrar-se 3 mL de cloridrato de bupivacaína (0,25%) ao longo do espaço intercostal doth 4 e faça uma incisão de pele 6 cm usando o cautério.
    1. Cuidadosamente, perfuram o músculo intercostal com pinça curva romba, círculo sob a costela 3rd e sai entre o próximo espaço intercostal. Certifique-se para não machucar o pulmão ou coração.
    2. Abrir a pinça para um pre-pedaço de seda 0 e trazê-lo de cercar a costela.
    3. Repita os passos 7.4.1–7.4.2 para fixar a sutura sob 4th costela.
    4. Fixe os laços em torno de cada costela. Suavemente, puxe e inserir um cotonete no peito sob 4th espaço intercostal.
    5. Use o bastão aplicador para proteger o conteúdo do peito enquanto usar o cautério para abrir o espaço intercostal em 1 cm para uma abertura final de 6-8 cm. Certifique-se de que o pulmão não está preso os laços de costela.
    6. Coloque um propagador da costela no peito-abertura. Abrir o peito irá revelar os lóbulos superiores esquerdos do pulmão, a principal artéria pulmonar (PA) e a persistência do canal arterial.
  5. Use 2 x 2 polegadas gazes para envolver o pulmão e empurre suavemente qualquer tecido exposto longe da área cirúrgica.
    1. Use um afastador pequeno manual para melhorar o campo de visão (se necessário).
    2. Lugar uma fita umbilical (1/4 de polegada de largura, 6 polegadas de comprimento) previamente embebido em âmnio ao redor dos grandes vasos. Imersão a fita umbilical diminui o atrito (e prejuízo) sobre as paredes dos vasos.
  6. Usando fórceps, levantar o pericárdio e corte ao longo da artéria pulmonar principal, tomando cuidado para não cortar o nervo vagal. Use uma ansa para manter o átrio direito de interferir com um corte lateral do pericárdio ao longo do nervo vagal.
  7. Usando a pinça Gemini, devagar a pinça do notch ductal/PA ao redor e por trás o PA esquerdo para "cercar" e emergir do outro lado de PA esquerdo. Muitos tecidos delicados executar no âmbito deste sector e proceder somente se não houver nenhuma resistência.
    1. Quando a ponta da pinça é observada, abra apenas longe o suficiente para agarrar uma extremidade da fita umbilical pré-umedecidos. Prenda com apenas 1 posição clicada no lugar. É possível que tecido circundante pode ser pego na pinça também, e se firmemente fixada que o tecido pode ser pego com a fita umbilical resultando em lesões no vaso.
    2. Suavemente de volta a pinça para puxar a fita para a posição. Isto serve para abrir um espaço para a sonda de fluxo e ajuda a direcionar a inserção das sondas fluxo (Figura 2). O cuidado de proteger o entalhe parte de qualquer embarcação é imperativo, pois esta é a parte mais frágil do tecido.
  8. Coloque uma 4-6 mm perivascular fluxo-sonda suavemente levantando a fita umbilical e orientando a parte de metal (suporte em L) da sonda ao redor do navio ao longo da abertura estabelecida.
    1. Direto a fita para trás da sonda para ajudar o recipiente no lugar do assento e visualizar o fim do L-suporte, permitindo o fechamento deslizante para ser protegido.
    2. Certifique-se que o navio é > 75% do tamanho da ponta de prova para garantir um fluxo firme ajuste e precisão de medições.
    3. Cuidadosamente, corte a extremidade da fita umbilical perto da sonda e puxe delicadamente a outra extremidade para remover a fita da nave. A fita vai interferir com as medições se não forem removidos.
    4. Aplicar o gel de ultra-som e ajuste a posição da sonda e o cabo para melhorar a qualidade e a intensidade do sinal.
  9. Repita as etapas de 7,6 – 7.7.4 no que se refere à colocação de uma fluxo de perivascular-sonda ao redor do duto arterioso 6-8 mm.
  10. Remova qualquer gaze protetora de 2 x 2 no peito e permitir que o pulmão para re-posicionar.
  11. Coloque uma 2x2 Gaze nova ao redor de cada suporte de metal da sonda fluxo para proteger o pulmão.
  12. Feche o peito em camadas usando uma agulha cónica e sutura de monofilamento sintético 2.0. Prenda os cabos das sondas-fluxo para o exterior da pele com um loop usando uma agulha de corte e sutura seda 2.0.

8. não-invasivo medição

  1. Prenda de EKG na axila direita, axila esquerda e área inguinal direita (ECG de três). Saturação da oxihemoglobina arterial pré e pós ductal (SpO2) é monitorada com um oxímetro de pulso, colocado sobre o membro anterior direito e qualquer membro posterior, respectivamente. Fixe um monitor espectroscópio infravermelho próximo (NIR) sobre a testa com um molho opaco e suturas.

9. coleta de dados

  1. Coletar e registrar dados utilizando um software de aquisição de dados. A Figura 1 ilustra os parâmetros não-invasiva e invasivos, incluindo: pressão de sangue venoso central e arterial, fluxo de carótida, esquerdo sangue arterial pulmonar e ductal esquerdo comum, ECG, SpO2, NIRS, ETCO2.
    Nota: A configuração de software e equipamento para coleta de dados pode variar e está além do escopo deste artigo.

10. protocolo experimental

  1. Occlude e cortar o cordão umbilical e mover o cordeiro do abdome materno para um aquecedor radiante.
  2. Durante o período no, inserir um cateter umbilical venoso para administração de epinefrina (0,01-0,03 mg/kg IV, por recomendações de NRP).
  3. Inserir um cateter arterial umbilical para coletar pós ductal gasometria arterial.
  4. Monitore o cordeiro para assistolia iminente, que pode ser definida como a ausência de fluxo da carótida detectado e pressão.
  5. Certifique-se de que o pessoal adequado está disponível e escreve cada pessoa as seguintes tarefas: (1) gerenciar a ventilação e a via aérea (2) realizar compressões torácicas, (3) administrar a medicação, (4) tirar amostras de sangue, (5) o código sem chumbo.
  6. Começa ressuscitação, fornecendo a ventilação de pressão positiva (PPV) com uma peça em T resuscitator sob pressões de 35/5 cm H2o O. iniciar o temporizador de 20 min para protocolo de ressuscitação experimental.
  7. Após 30 s de ventilação, iniciar as compressões torácicas, colocando o polegar e os dedos de uma mão em lados opostos do peito.
    1. Fornece as compressões torácicas apertando os dedos e o polegar juntos a uma profundidade de aproximadamente 1/3.
  8. Administre epinefrina em intervalos de 3 min.
  9. Prosseguir os esforços de ressuscitação até o retorno da circulação espontânea ou até 20 min.
  10. No retorno de circulação espontânea, contínuos fluidos IV (5 cc/kg/hr) e fentanil (0,5-2,0 mcg/kg/hr; tituladas para o efeito), são dadas através do cateter venoso jugular estabelecido anteriormente. Após o período de reanimação de 20 min, o animal é sacrificado. Se os cordeiros não alcançar ROSC por 20 min, proceda com a eutanásia.

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Resultados

Após instrumentação dos cordeiros fetais, variáveis hemodinâmicas podem ser gravada (Figura 3 e Figura 4), em seguida, analisaram e interpretados (Figura 5). Podem ser colhidas amostras de sangue frequentes, e a Figura 6 mostra o pH e PaCO2 dados de um dos experimentos. Ocasionalmente, cateteres ou sondas de fluxo podem avariar ou ter desalojadas e dados, port...

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Discussão

O modelo de cordeiro é comparável em tamanho ao recém-nascidos humanos e permite fácil instrumentação medir as variáveis hemodinâmicas invasivas. O modelo de cordeiro do feto/recém-nascido tem sido uma ferramenta de pesquisa inestimável que ricamente contribuiu para a compreensão da circulação de transição, bem como a fisiologia de cardiovascular e pulmonar do recém-nascido. Vários modelos experimentais de cordeiro se estabeleceram ao longo dos anos para estudar estratégias de ventilação ideal em prematuros cordeiros

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Divulgações

Os autores têm sem conflitos de interesse, para declarar

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pinça BabcockMiltex16-44
Transdutor de pressão arterialBecton DickinsonP23XL-1Usado com cúpulas de diafragma cheias de solução salina
Tesoura de ponta rombaMiltex98SCS50-56
CapnógrafoPhilips7900Usado com sensores de fluxo neonatal
Lápis de cauterizaçãoValley Lab287879
Unidade de cauterizaçãoValley LabSSE2K
Fórceps curvoEverost711714
Software de aquisição de dadosBiopac Systems Inc.
EKGBiopac Systems Inc.
Tubo endotraqueal - moduladorde fluxo Rusch111780035
Transonic Systems Inc. Sonda de fluxo T403
Transonic Systems Inc. MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA
Tubo gástricoJorgensen Labs Inc.J0106LEPara descomprimir e drenar o estômago de ovelha
Máquina de cortar cabeloAndis Company65340 # 40 Lâmina de aparador
Aquecedor radiante infantilGE healthcare7810
Cateteres intravenososBecton Dickinson381234
Iris tesoura cirúrgicaPatterson510585
Kelly ForecepsPatterson
510535 Pinça de MosquitoRICA Surgical Products INC1-74
Espectroscopia de infravermelho próximoNonin Medical Inc. X-100MSensmart Equanox & Sensor PureSAT
RSO2 NoninMedical Inc. 8004CB-NANeonatal 
Cabo e lâmina de bisturiEverost707203
Suturas -seda 2-0CovidienSS-695Usado para amarrar cateteres a vasos
Suturas -vicryl  2-0EthiconJ269HUsado para fechar toracotomia 
Ressuscitador em TNeo-TeeMCM1050812
Laços umbilicaisJorgensen Labs Inc.
Retrator WeitlanderMiltex11-625
ACK100WECG100Ccom punhoJ0025UA

Referências

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