Method Article

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A relação íntima entre a planta hospedeira e microorganismos associados é crucial para determinar a adequação de planta e pode promover maior tolerância a estresses abióticos e doenças. Como a planta microbiome pode ser altamente complexos e de baixo custo, métodos de alta produtividade como baseados em amplicon sequenciamento do gene 16S rRNA frequentemente são preferidos para caracterizar sua composição microbiana e diversidade. No entanto, a seleção de metodologia apropriada na condução de tais experiências é fundamental para reduzir preconceitos, o que podem dificultar a análise e comparações entre estudos e amostras. Este protocolo descreve detalhadamente uma metodologia padronizada para a coleta e a extração de DNA de rizosfera, solo e amostras de raiz. Além disso, podemos destacar um pipeline de sequenciamento de amplicons do rRNA 16S bem estabelecida que permite a exploração da composição das comunidades bacterianas nestas amostras e pode ser facilmente adaptados para outros genes marcadores. Esse pipeline foi validado para uma variedade de espécies de plantas, incluindo o sorgo, milho, trigo, morango e agave e pode ajudar a superar os problemas associados com a contaminação de organelas vegetais.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser cultivados em isolamento no laboratório de mídia gerado, muitos não podem, em parte porque eles podem confiar em relações simbióticas com outros micróbios, crescem muito lentamente, ou exigem condições que não podem ser replicadas em um ambiente de laboratório. Porque evita a necessidade de cultivo e é relativamente barato e de alta produtividade, baseada em sequência filogenética caracterização das amostras microbianas ambientais e associado anfitrião tornou-se um método preferido para análise do comunidade microbiana composição.

A seleção de tecnologias de sequenciamento apropriados fornecidos por vários próxima geração (NGS) plataformas1 de sequenciamento é dependente de necessidades dos usuários, com importantes fatores incluindo: cobertura desejada, comprimento de amplicons, espera-se comunidade diversidade, bem como taxa de erro, leia-comprimento e o custo-por-gerência/megabase de sequenciamento. Outra variável que precisa ser considerado em experimentos de sequenciamento baseado em amplicon é que gene vai ser amplificado e que as primeiras demão serão usadas. Quando projetando ou escolhendo as primeiras demão, pesquisadores muitas vezes são forçados a fazer compensações entre a universalidade da amplificação e a resolução taxonômica realizáveis dos amplicons resultante. Por esta razão, estes tipos de estudos muitas vezes escolheram primers e marcadores que alvejar seletivamente subconjuntos específicos da microbiome. Avaliando a composição das comunidades bacterianas é comumente realizado por sequenciamento de uma ou mais das regiões hipervariáveis do bacteriana 16S rRNA gene2,3. Neste estudo, descrevemos um amplicon baseado sequenciamento protocolo desenvolvido para uma plataforma NGS região alvos a 500 bp V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, que permite ampla amplificação de táxons bacterianas, proporcionando também variabilidade suficiente para distingui entre diferentes táxons. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso com outros conjuntos de cartilha, tais como os alvos o marcador ITS2 de fungos ou a subunidade de rRNA 18S de eucariotas.

Enquanto outras abordagens tais como espingarda metagenômica, metatranscriptomics e sequenciamento de célula única, oferecem outras vantagens, incluindo genomas microbianas resolvidas e medida mais direta da função da Comunidade, estas técnicas são normalmente mais caro e computacionais do que os perfis filogenética descrevem aqui4. Além disso, realizando metagenomics espingarda e metatranscriptomics em amostras de raiz produz uma grande percentagem de leituras pertencentes ao genoma vegetal hospedeiro, e métodos para superar esta limitação ainda estão sendo desenvolvidos5,6.

Tal como acontece com qualquer plataforma experimental, criação de perfil baseada em amplicon pode introduzir um número de possíveis enviesamentos que devem ser considerados durante a análise de dados e projeto experimental. Estes incluem os métodos de coleta de amostra, DNA extração, seleção de primers PCR e como é realizada a preparação da biblioteca. Diferentes métodos podem significativamente afetar a quantidade de dados utilizáveis gerados e podem também prejudicar os esforços para comparar os resultados entre os estudos. Por exemplo, o método de remoção de bactérias rizosfera7 e a utilização de técnicas diferentes de extração ou escolha de extração de DNA a kits8,9 foram mostrados para impacto a jusante análise, que leva a conclusões diferentes sobre os quais os micróbios são presente e suas abundâncias relativas. Desde a criação de perfil baseada em amplicon pode ser personalizada, fazer comparações entre estudos pode ser um desafio. O projeto de Microbiome terra sugeriu que pesquisadores estudando sistemas complexos tais como a planta associada microbiome beneficiaria o desenvolvimento de protocolos padronizados como um meio de minimizar a variabilidade causada pela aplicação de diferentes métodos entre estudos10,11. Aqui, discutimos muitos dos tópicos acima e oferecer sugestões sobre as melhores práticas onde apropriado.

O protocolo demonstra o processo de coleta de solo rizosfera e amostras de raiz de Sorghum bicolor e extrair DNA usando uma bem-estabelecida kit isolamento de DNA11. Além disso, o nosso protocolo inclui um fluxo de trabalho sequenciamento detalhado amplicon, usando uma plataforma NGS comumente utilizada, para determinar a estrutura das comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo foi validado para o uso em uma ampla gama de hospedeiros de planta em um recente estudo publicado das raízes e rizosfera associado-solos de 18 espécies de plantas, incluindo Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Este método também foi validado para uso com outros genes marcadores, como demonstrado pela sua aplicação bem sucedida para estudar o gene marcador ITS2 fúngico em estudos do agave microbiome16,17 e microbiome morango 18.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. recolha e separação de raiz Endosphere, rizosfera e amostras de solo

  1. Antes de entrar em campo, água ultrapura autoclave (pelo menos 90 mL de água por exemplo) para esterilizar. Prepare o buffer de remoção de epífitas (pelo menos 25 mL por amostra), acrescentando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4e 1 mL de Triton X-100, para 1 L de água estéril. Esterilize o buffer usando um filtro de vácuo com tamanho de poro 0,2 µm.
    1. Para etapas de 1.2 a 1.5, desgaste luvas esterilizadas esterilizadas com etanol em todos os momentos e substituir as luvas entre cada amostra para evitar a contaminação. Esterilizar todos os equipamentos com etanol a 70% e limpe todos os equipamentos entre as amostras. Antes da amostragem, determinar a profundidade de amostragem ideal para sua experiência e ser coerente com todas as coleções de solo e raiz.
  2. Para coletar amostras de solo em massa, use um coletor de núcleo de solo etanol-esterilizados para obter solo que é livre de raízes de plantas, recolhendo um núcleo aproximadamente 23 a 30 cm da base da planta.
  3. Transferir o solo para um saco de plástico, homogeneizar o solo por agitação suave e transferir uma alíquota da amostra de solo (cerca de 600 mg) para encher um tubo de 2 mL. Imediatamente, coloque o tubo de 2 mL em gelo seco ou flash congelar o tubo no líquido N2 até estar pronto para prosseguir com a extração de DNA (etapa 2).
    1. Em alguns ambientes, do solo circundante pode conter material vegetal. Nesse caso, use uma peneira de 2mm esterilizado para separar os restos de plantas do solo antes de colocá-lo num saco de plástico.
  4. Para coletar a raiz e a rizosfera, use uma pá de etanol-esterilizados para desenterrar a planta, tendo o cuidado de obter o máximo da raiz quanto possível. Profundidade é dependente da planta. Enquanto pequenas plantas como o trigo podem ser removidas por cavar vários centímetros, plantas maiores tais como sorgo podem exigir 30 cm ou mais. Agite delicadamente fora excesso solo das raízes até há cerca de 2 mm do solo, aderindo à superfície da raiz.
    Nota: tenha cuidado ao trabalhar com pequenas plantas, com raízes frágeis, ou em solos conteúdos secos, alta-argila. Idealmente, só deve haver uma camada fina de solo, permanecendo nas raízes após agitação. Se continuam a ser grandes agregados do solo, um martelo de borracha pode ser usado para deslocar o solo batendo suavemente a base da filmagem. Se a quantidade de solo restante após este processo excede ou fica aquém de 2 mm, a espessura aproximada deve notar-se.
  5. Para plantas grandes, use tesoura esterilizada e/ou tesouras para cortar uma subseção representativa das raízes e colocar um mínimo de 500 mg de tecido de raiz dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL. Para gramíneas menores, coloque todo o sistema de raiz dentro do frasco. Adicionar suficiente reserva de remoção de epífitas para cobrir as raízes, em seguida, imediatamente, colocar a amostra em gelo seco ou flash congelar a amostra do líquido N2.
    Nota: tenha cuidado para não encher demais o recipiente cónico de 50 mL, como ele vai fazer lavagem passo difícil. Deve haver bastante espaço vazio, tal que o buffer de epífitas é capaz de fluir para o fundo, cercam as raízes ao longo do frasco e cobrir o topo. Porque algumas gramíneas tem mais biomassa de raiz que vai caber dentro de um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, uma subseção de raízes deve ser colhida. No entanto, deve notar-se que corte as raízes poderia levar a bactérias endofíticas sendo lavadas para fora para a fração de rizosfera, raízes o namoro deve ser minimizado. Se as amostras não são processadas imediatamente após retornar para o laboratório, eles podem ser armazenados a-80 ° C.
  6. Para separar as raízes, a rizosfera, descongelar a amostra de raiz no gelo e, em seguida, proceda à sonicação das amostras de raiz a 4 ° C por 10 min com pulsos de 160 W por 30 s, separados por 30 s. transferência as raízes em um gelado (4 ° C), limpe 50 mL tubo usando Pinças esterilizadas. Não elimine o tubo original com amortecedor e solo, que é a fração de rizosfera (Figura 1).
  7. Centrifugar o tubo contendo tampão e rizosfera para 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar o sobrenadante, flash congelar o tubo contendo a fração de rizosfera em líquido N2e armazenar a fração de rizosfera a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o DNA extração (etapa 2).
  8. Para lavar as raízes, adicione cerca de 20 mL de água estéril refrigerados (4 ° C) para a fração de raiz. Lave a raiz agitando vigorosamente (à mão ou mixer, para 15 a 30 s) e em seguida, drenar a água.
  9. Repita este passo pelo menos duas vezes, até que nenhum solo permanece na superfície de raiz. Se a extração de DNA (etapa 2) não é executada imediatamente, envolva as raízes em folha de alumínio estéril, flash congelar as raízes no líquido N2e armazenar as amostras a-80 ° C até pronto para prosseguir com a extração de DNA.

2. extração de DNA

Nota: Durante as etapas 2 e 3, luvas esterilizadas esterilizadas com etanol devem ser usadas em todos os momentos e todo o trabalho deve ser realizado sobre uma superfície esterilizada com etanol.

  1. Extrai o DNA de amostras de solo e da rizosfera.
    1. Uso uma espátula estéril para transferir rapidamente 250 mg do solo e da rizosfera de passos 1.3 e 1.7 nos tubos de coleta seletiva fornecida em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA utilizando o fornecedor kit protocolo.
    2. Após a eluição do DNA no buffer de eluição fornecido pelo kit de isolamento de DNA, armazene o DNA a-20 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o passo 3.
  2. Extrai o DNA de amostras de raiz.
    1. Acalme um esterilizado pilão usando líquido N2. Meça 600 a 700 mg de tecido de raiz e coloque o tecido no almofariz. Cuidadosamente, adicione o suficiente de líquido N2 para cobrir as raízes.
    2. Moa as raízes em pedaços pequenos. Continuar o processo de adição de líquido N2 e moagem (pelo menos duas vezes, ser consistente entre amostras), até que as raízes são um pó fino. Certifique-se de que o tecido de raiz Não descongele durante esta etapa.
      Atenção: Utilize equipamento de protecção adequado (jaleco, óculos de proteção e luvas criogênicas) quando trabalhar com líquido N2.
      Nota: Para uma extração de DNA de baixa qualidade, pode ser benéfico moer raízes em excesso em pó e armazenar o pó a-80 ° C.
    3. Rapidamente, antes da raiz em pó começa a descongelar, use uma espátula estéril para transferir o pó da raiz em tubos pré-pesados 1,5 mL no gelo. Registre o peso do tubo e do pó. Normalmente, 300-400 mg de pó é transferida.
    4. Uso uma espátula estéril rapidamente transferir 150 mg de pó de raiz para o tubo de coleta fornecido em um kit de isolamento de DNA comercial projetado para extração do solo e, em seguida, prosseguir com isolamento de DNA usando o protocolo do kit fornecedor.
      Nota: Para algumas amostras de raiz, pode haver uma alta concentração de orgânicos, permanecendo na pelota do ADN, que impede a amplificação do DNA durante a PCR, especialmente quando um protocolo de extração de DNA diferente (ex., extração CTAB) é usado. Se necessário, limpe o DNA, seguindo as instruções fornecidas no kit de limpeza ambiental do DNA.
  3. Medir a concentração de todas as amostras de DNA usando um dados de bancada de alta sensibilidade.
    1. Adicione 1 a 20 µ l de cada amostra de DNA eluted em tubos fornecidos no kit de ensaio de alta sensibilidade de dsDNA. Adicione a solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200) até 200 µ l.
    2. Prepare dois tubos adicionais contendo 10 µ l de DNA (0 em ng / µ l DNA) o padrão 1 ou 10 µ l de 2 padrão (100 ng / µ l) e adicionar 190 µ l da solução de trabalho de dados para cada norma.
    3. Medir a concentração das normas e cada amostra. Se não for feito automaticamente, calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear das duas normas.

3. Biblioteca de amplicons preparação e submissão

  1. Conjunto de materiais para a reação de amplificação.
    1. Descongelar as amostras de DNA em 4 ° C e mantê-los no gelo em toda a etapa 3. Randomize a ordem das amostras de DNA para minimizar o viés devido à localização na placa do PCR (tabela 2).
    2. Em um prato PCR de 96 poços, dilua DNA de cada amostra em água molecular-classe a 5 ng / µ l em um volume total de 20 µ l. Adicionar 20 µ l de água molecular grau aos poços quatro canto como controles negativos para amplificação (vazias) (tabela 2).
    3. Organize os primers de código de barras (10 µM) em cadeia da polimerase tira ou uma placa de 96 poços, tais que podem ser adicionados com uma pipeta multicanal (Figura 2).
    4. Prepare a mistura de mestre PCR suficiente para amplificar cada amostra de DNA em triplicado. Prepare-se 1,5 µ l de BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l de pre-feitos 2x mestre mix (composto de tampão PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerase), 0.57 µ l de cloroplasto PNA (100 µM), 0.57 µ l de PNA mitocondrial (100 µM) e 25.86 µ l de água molecular da classe.
    5. Deite a mistura de mestre para um estéril 25 mL de reservatório de pipeta multicanal e distribuir 66 µ l do mix mestre em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços, com uma pipeta multicanal.
      Nota: Quando calcular volumes de reagente para a mistura de mestre, certifique-se de incluir também os 4 poços em branco por placa.
    6. Usando uma pipeta multicanal, adicione 6 µ l de 5 ng / µ l ADN (a partir da placa de DNA normalizada) para a placa de mistura de mestre. Em seguida, adicione ao µ l placa mestra 1.5 de primer para a frente de 10 µM, tal que cada coluna tem um código de barras para a frente diferente e 1,5 µ l de 10 µM reverter a primeira demão, tal que cada linha tem um código de barras reverso diferente (Figura 2).
      Nota: Antes da adição de cartilhas, as placas randomizadas e mestre mistura poderiam ser usados para amplificar os genes de fungos ITS ou ITS2 se diferentes iniciadores foram adicionados. Se este for o caso, um projeto da primeira demão semelhante pode ser usado.
    7. Spin-down a placa brevemente no 3.000 g. x Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente e, em seguida, dividir em três placas com 25 µ l de mistura reacional.
      Nota: Apesar de três repetições não são estritamente necessárias, diminui o impacto da variabilidade técnica.
  2. Amplificar o DNA em cada placa usando um thermocycler definido para as seguintes condições: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturação), 78 ° C, durante 10 s (PNA recozimento), a 55 ° C por 60 s (recozimento da primeira demão) e 72 ° C por 90 s (extensão) , então 600 s a 72 ° C, seguido por um 4 ° C segurar o passo. Após a amplificação, juntar as três placas de replicar em uma única placa de 96 poços.
  3. Quantificar o DNA usando reagentes de alta sensibilidade de dados em um leitor de placa de 96 poços.
    1. Adicione 2 µ l de cada produto do PCR para uma microplaca de 96 poços, juntamente com 98 µ l da solução de trabalho de dados (tintura: tampão de 1: 200). Inclui 4 poços como padrões: 5 µ l de DNA 1 padrão (0 ng / µ l DNA), 1 µ l de padrão 2 (10 ng / µ l), 2 µ l de padrão 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l de padrão 2 (50 ng / µ l). Em seguida, adicione solução de trabalho de dados para um volume final de 100 µ l.
      Nota: Cada amostra pode ser medida usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3 se um leitor não está disponível.
    2. Calcule a concentração de DNA na saída de absorvância por uma regressão linear dos quatro padrões.
    3. Para o código de barras com sucesso amplificado produtos (aqueles que têm uma concentração maior que 15 ng / µ l), piscina 100 ng de cada amostra em um tubo único 1,5 mL (tabela 2).
    4. Calcule o volume médio de amostras adicionado ao pool usando a função =AVERAGE() em um programa de planilha. Adicione o volume dos produtos do PCR "em branco" para as amostras em pool.
      Nota: Desde que os produtos PCR "em branco" têm suas próprias combinações de código de barras único, eles podem ser sequenciados para verificar se há quaisquer contaminantes de laboratório.
  4. Medir a concentração do produto em pool usando um bancada de dados conforme descrito no passo 2.3 e tomar 600 ng de DNA e diluir em água molecular grau até um volume final de 100 µ l em um tubo de 1,5 mL. Armazenar o produto em pool restante a-20 ° C.
  5. Lave a 600 ng DNA alíquota, seguindo o processo de purificação do PCR estabelecido com grânulos de purificação paramagnética em um formato de 96 poços, com algumas exceções.
    1. Fazer um fresco µ l 600 alíquota de etanol a 70%. Agite bem o frasco de grânulos magnéticos para re-suspender contas que resolver até o fundo.
    2. Adicione 1 volume x (100 µ l) da solução de grânulo de alíquota 600 ng de DNA. Misture bem, pipetando 10 vezes. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Coloque o tubo sobre o carrinho magnético por 2 min (ou até solução é clara) para separar os grânulos de solução. Enquanto o tubo é ainda no suporte magnético, aspirar o sobrenadante claro, cuidadosamente, sem tocar as esferas magnéticas e descartar o sobrenadante claro.
      Nota: neste ponto, os amplicon produtos são obrigados às esferas magnéticas. Quaisquer contas que são perturbada ou perdida durante a aspiração resultará em perda de DNA.
    4. Deixar o tubo no suporte magnético e adicionar 300 µ l de etanol 70% para o tubo; incube a temperatura ambiente por 30 s. Aspire o etanol e o descarte. Repita este processo e remover todos os etanol após a segunda lavagem. Retire o tubo do suporte magnético e o ar seco por 5 min.
    5. Adicionar 30 µ l de água molecular grau para os grânulos secos e misture pipetando 10 vezes. Incube a temperatura ambiente por 2 min. o tubo de retorno para o suporte magnético para 1 min para separar as contas da solução. Transfira o eluato para um tubo novo.
      Nota: Grânulos magnéticos não afetará as reações a jusante.
  6. Medir a concentração final de limpos, DNA agrupado usando um bancada de dados, conforme descrito na etapa 2.3. Diluir uma alíquota de 10 nM em um volume final de 30 µ l, ou para a concentração e volume preferido pela facilidade de sequenciamento.
  7. Utilize os serviços de uma instalação de sequenciamento para sequenciar o DNA em uma plataforma NGS, 2 x 300 sequenciamento de bp emparelhado-final.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Executar o protocolo recomendado deve resultar em um conjunto de dados de leituras de emparelhado-final indexados que podem ser combinados para cada amostra e atribuído a qualquer um bacteriano unidades taxonômicas operacionais (OTU) ou sequência exata variante (ESV, também conhecido como amplicon variante de sequência (ASV) e sub-operational unidade taxonômica (sOTU)), dependendo de análise a jusante. A fim de obter dados de sequência de alta qualidade, deve ter-se cuidado em cada etapa ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstra um pipeline estabelecido para explorar a raiz endosphere, rizosfera e composições de comunidade microbiana do solo, de amostragem de campo de processamento de amostra e sequenciamento a jusante. Estou estudando microbiomes associada a raiz apresenta desafios únicos, devido em parte às dificuldades inerentes em amostragem do solo. Os solos são altamente variável em termos de propriedades físicas e químicas, e as condições do solo diferentes podem ser separadas por tão pouco quanto alguns milímetro...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS é suportado pelo NSF Research Fellowship graduação.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 e micro; L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-3810Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific1615-5510Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
10 µ L pipeta multicanalEppendorf3122000027Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
10 µ L, 100 µ L e 1000 µ L micropipetasEppendorf3120000909Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
100 µ L pipeta multicanalEppendorf3122000043Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
1000 µ L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1122-1830Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tubos de microcentrífuga de 2 mLUSA Scientific1620-2700Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Peneira de solo de 2 mmFornecedores florestais60141009Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
200 µ L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-8810Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Reservatórios de 25 mL VWRInternational LLC89094-664Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Frascos cônicos de 50 mLThermo Fisher Scientific352098Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Filtros de vácuo de 500 mL (0,2 µ tamanho dos poros m)VWR International LLC156-4020
Microplacas de 96 poçosUSA Scientific655900
Placas PCR de 96 poçosBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP BeadsThermo Fisher ScientificNC9933872Instruções de uso:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Calçadão de folha de alumínio7124Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Balança analítica com resolução de 0,001 gOhaus PioneerPA323Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Bioruptor Plus ultrassônicoDiagenodeB01020001
Albumina de soro bovino (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
CentrífugaEppendorf5811000908Incluindo adaptadores de balde de placa de 50mL e 96 poços
Luvas criogênicasMillipore SigmaZ183490Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Kit DNeasy PowerClean (opcional)Qiagen Inc.12877-50Anteriormente MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Anteriormente MoBio
Gelo secoQualquer
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321DNão substitua o
etanolVWR International LLC89125-188Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Sacos de congelação do tamanho de um galãoZiplocNAPode substituir com equivalente de outros fornecedores.
Leitor de microplacas Gemini EMDispositivos molecularesEMPode usar outro fluorômetro que lê placas de 96 poços a partir do topo.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
JalecoWorkriteJ1367Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Líquido N2QualquerNAPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Líquido N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Sistema de purificação de água ultrapura Milli-QMinicentrífuga Millipore SigmaSYNS0R0WW
Eppendorf5404000014
Água de grau molecularThermo Fisher Scientific4387937Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
ArgamassasVWR International LLC89038-150Pode ser substituído por equivalente de outros fornecedores.
Luvas de nitriloThermo Fisher Scientific19167032BPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Toalhas de papelVWR International LLCBWK6212Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Película de vedação de placa PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
Tubos de tiras PCRUSA Scientific1402-2700
PilõesVWR International LLC89038-166Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Espátulas de plásticoLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - cloroplasto e mitocondrialPNA BioNACertifique-se de verificar a sequência bioinformaticamente
Óculos de proteçãoMillipore SigmaZ759015Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Qubit 3.0 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS kit de ensaioThermo Fisher ScientificQ32854
Martelo de borracha (opcional)Ace Hardware2258622Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tesouras ou tesourasVWR International LLC89259-936Pode substituí-las por equivalentes de outros fornecedores.
PáHome Depot2597400Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Coletor de núcleo de solo (pequeno diâmetro: < 1 polegada)Ben Meadows221700Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Frascos de spraySanta Cruz Biotechnologysc-395278Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Primers padrão com código de barras dessalinizados (10 µ M) (Tabela 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo com dessalinização padrão. O adaptador NGS e o primer de sequenciamento (Tabela 1) são projetados para uso com o Illumina MiSeq usando química v3.
TermocicladorThermo Fisher ScientificE950040015Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Barcos de pesagemSpectrum ChemicalsB6001WPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
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References

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