Method Article

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A relação íntima entre a planta hospedeira e microorganismos associados é crucial para determinar a adequação de planta e pode promover maior tolerância a estresses abióticos e doenças. Como a planta microbiome pode ser altamente complexos e de baixo custo, métodos de alta produtividade como baseados em amplicon sequenciamento do gene 16S rRNA frequentemente são preferidos para caracterizar sua composição microbiana e diversidade. No entanto, a seleção de metodologia apropriada na condução de tais experiências é fundamental para reduzir preconceitos, o que podem dificultar a análise e comparações entre estudos e amostras. Este protocolo descreve detalhadamente uma metodologia padronizada para a coleta e a extração de DNA de rizosfera, solo e amostras de raiz. Além disso, podemos destacar um pipeline de sequenciamento de amplicons do rRNA 16S bem estabelecida que permite a exploração da composição das comunidades bacterianas nestas amostras e pode ser facilmente adaptados para outros genes marcadores. Esse pipeline foi validado para uma variedade de espécies de plantas, incluindo o sorgo, milho, trigo, morango e agave e pode ajudar a superar os problemas associados com a contaminação de organelas vegetais.

Introduction

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Microbiomes planta-associado consistem em comunidades microbianas dinâmicas e complexas, compostas de archaea, bactérias, vírus, fungos e outros microorganismos eucarióticos. Além de seu papel bem estudado em causar doença de planta, planta associada micróbios também positivamente podem influenciar fitossanidade, melhorando a tolerância a estresses bióticos e abióticos, promovendo a disponibilidade de nutrientes e realçando o crescimento das plantas através de a produção de fitohormônios. Por esta razão, particular interesse existe em caracterizar os táxons que associam a planta raiz endospheres, rhizospheres e o solo circundante. Enquanto alguns micróbios podem ser c....

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Protocol

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1. recolha e separação de raiz Endosphere, rizosfera e amostras de solo

  1. Antes de entrar em campo, água ultrapura autoclave (pelo menos 90 mL de água por exemplo) para esterilizar. Prepare o buffer de remoção de epífitas (pelo menos 25 mL por amostra), acrescentando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4e 1 mL de Triton X-100, para 1 L de água estéril. Esterilize o buffer usando um filtro de vácuo com tamanho de poro 0,2 µm.
    1. Para etapas de 1.2 a 1.5, desgaste luvas esterilizadas esterilizadas com etanol em todos os momentos e substituir as luvas entre cada amostra para evitar a contaminação. Esterilizar todos os....

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Results

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Executar o protocolo recomendado deve resultar em um conjunto de dados de leituras de emparelhado-final indexados que podem ser combinados para cada amostra e atribuído a qualquer um bacteriano unidades taxonômicas operacionais (OTU) ou sequência exata variante (ESV, também conhecido como amplicon variante de sequência (ASV) e sub-operational unidade taxonômica (sOTU)), dependendo de análise a jusante. A fim de obter dados de sequência de alta qualidade, deve ter-se cuidado em cada etapa .......

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Discussion

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Este protocolo demonstra um pipeline estabelecido para explorar a raiz endosphere, rizosfera e composições de comunidade microbiana do solo, de amostragem de campo de processamento de amostra e sequenciamento a jusante. Estou estudando microbiomes associada a raiz apresenta desafios únicos, devido em parte às dificuldades inerentes em amostragem do solo. Os solos são altamente variável em termos de propriedades físicas e químicas, e as condições do solo diferentes podem ser separadas por tão pouco quanto alguns milímetro.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS é suportado pelo NSF Research Fellowship graduação.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 e micro; L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-3810Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific1615-5510Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
10 µ L pipeta multicanalEppendorf3122000027Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
10 µ L, 100 µ L e 1000 µ L micropipetasEppendorf3120000909Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
100 µ L pipeta multicanalEppendorf3122000043Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
1000 µ L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1122-1830Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tubos de microcentrífuga de 2 mLUSA Scientific1620-2700Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Peneira de solo de 2 mmFornecedores florestais60141009Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
200 µ L pontas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-8810Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Reservatórios de 25 mL VWRInternational LLC89094-664Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Frascos cônicos de 50 mLThermo Fisher Scientific352098Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Filtros de vácuo de 500 mL (0,2 µ tamanho dos poros m)VWR International LLC156-4020
Microplacas de 96 poçosUSA Scientific655900
Placas PCR de 96 poçosBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP BeadsThermo Fisher ScientificNC9933872Instruções de uso:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Calçadão de folha de alumínio7124Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Balança analítica com resolução de 0,001 gOhaus PioneerPA323Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Bioruptor Plus ultrassônicoDiagenodeB01020001
Albumina de soro bovino (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
CentrífugaEppendorf5811000908Incluindo adaptadores de balde de placa de 50mL e 96 poços
Luvas criogênicasMillipore SigmaZ183490Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Kit DNeasy PowerClean (opcional)Qiagen Inc.12877-50Anteriormente MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Anteriormente MoBio
Gelo secoQualquer
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321DNão substitua o
etanolVWR International LLC89125-188Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Sacos de congelação do tamanho de um galãoZiplocNAPode substituir com equivalente de outros fornecedores.
Leitor de microplacas Gemini EMDispositivos molecularesEMPode usar outro fluorômetro que lê placas de 96 poços a partir do topo.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
JalecoWorkriteJ1367Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Líquido N2QualquerNAPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Líquido N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Sistema de purificação de água ultrapura Milli-QMinicentrífuga Millipore SigmaSYNS0R0WW
Eppendorf5404000014
Água de grau molecularThermo Fisher Scientific4387937Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
ArgamassasVWR International LLC89038-150Pode ser substituído por equivalente de outros fornecedores.
Luvas de nitriloThermo Fisher Scientific19167032BPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Toalhas de papelVWR International LLCBWK6212Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Película de vedação de placa PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
Tubos de tiras PCRUSA Scientific1402-2700
PilõesVWR International LLC89038-166Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Espátulas de plásticoLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - cloroplasto e mitocondrialPNA BioNACertifique-se de verificar a sequência bioinformaticamente
Óculos de proteçãoMillipore SigmaZ759015Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Qubit 3.0 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS kit de ensaioThermo Fisher ScientificQ32854
Martelo de borracha (opcional)Ace Hardware2258622Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Tesouras ou tesourasVWR International LLC89259-936Pode substituí-las por equivalentes de outros fornecedores.
PáHome Depot2597400Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Coletor de núcleo de solo (pequeno diâmetro: < 1 polegada)Ben Meadows221700Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Frascos de spraySanta Cruz Biotechnologysc-395278Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Primers padrão com código de barras dessalinizados (10 µ M) (Tabela 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo com dessalinização padrão. O adaptador NGS e o primer de sequenciamento (Tabela 1) são projetados para uso com o Illumina MiSeq usando química v3.
TermocicladorThermo Fisher ScientificE950040015Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Pode substituir por equivalente de outros fornecedores.
Barcos de pesagemSpectrum ChemicalsB6001WPode substituir por equivalente de outros fornecedores.
ímã NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic cl....

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