O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.
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Artigo de método
Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.
Introdução
A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,....
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Protocolo
Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas.
1. ensaio de redução WST-1
- Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F.
- Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.
- Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, suplemento meios de diferenciação com o á....
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Resultados
As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura.
Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada para det.......
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Discussão
Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente de variação (CV.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coleção de Cultura C2C12 | American Type Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex complexo de soro animal | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicilina-estreptomicina | Sigma | 516106 | |
| soro de cavalo | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco | Sigma | D8537 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | T4049 | |
| Placas de cultura de 15 cm | TPP | 93150 | |
| Placas de cultura de 96 poços | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)-2H-tetrazólio Sal de Sódio (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| metossulfato de fenazina | Sigma | P9625 | |
| L-ácido ascórbico | Sigma | A5960 | |
| ascorbato oxidase | Sigma | A0157 | |
| superóxido dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dicloroindofenol sal de sódio | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glicose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sal de sódio | Sigma | H3784 | |
| cloreto de sódio | Sigma | S7653 | |
| cloreto de potássio | Fisher Scientific | BP366 | |
| sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma | M5921 | |
| cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma | C7902 | |
| fosfato de potássio | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I espectrofotômetro | Biotek Instrumentos | descontinuados | |
| Espectrofotômetro Spectronic Genesys 5 | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade microplaca de 96 poços, fundo F, transparente, não tratada, não estéril | MidSci | 781602 | |
| cloreto de ferro (II) tetrahidratado | Sigma | 220299 | |
| sulfato de ferro (II) heptahidratado | Sigma | 215422 | |
| hipoxantina | Sigma | H9636 | |
| xantina oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Instrumentos | descontinuados |
Referências
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
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Reimpressões e permissões
