Method Article

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

DOI:

10.3791/57576

⸱

June 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Abstract

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Laser captura microdissection (LCM) tem permitido a análise da expressão de genes de células únicas e enriquecido populações de células em cortes de tecido. LCM é uma ótima ferramenta para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes a diferenciação celular e o desenvolvimento e a progressão de várias doenças, incluindo o glaucoma. Glaucoma, que compreende uma família de neuropatia óptica progressiva, é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo. Mudanças estruturais e danos dentro da malha trabecular (TM) podem resultar em aumento da pressão intra-ocular (Pio), que é um importante fator de risco para o desenvolvimento de glaucoma. No entanto, os mecanismos moleculares precisos envolvidos são ainda mal compreendidos. A capacidade de realizar análise de expressão do gene será crucial na obtenção de mais insights sobre a função dessas células e seu papel na regulação do desenvolvimento IOP e glaucoma. Para conseguir isso, um método reprodutível para isolar altamente enriquecido TM de seções congeladas do olhos de rato e um método para análise de expressão do gene a jusante, tais como RT-qPCR e RNA-Seq é necessária. O método descrito neste documento é desenvolvido para isolar altamente pura TM de olhos de rato para a jusante do PCR digital e análise de microarray. Além disso, esta técnica pode ser facilmente adaptada para o isolamento de outras células oculares altamente enriquecidas e compartimentos de célula que tem sido difícil isolar-se dos olhos de rato. A combinação da análise de LCM e RNA pode contribuir para uma compreensão mais abrangente dos eventos celulares subjacentes glaucoma.

Introduction

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Glaucoma é um grupo de doenças caracterizadas por neuropatia óptica e retinopatia que aprimorem a cegueira irreversível1,2. Estima-se que por 2020 over 70 milhões de pessoas no mundo inteiro estaremos vivendo com alguma forma de doença3,4,5,6,7. Glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), o tipo mais prevalente de glaucoma, é caracterizada por uma diminuição no escoamento do humor aquoso (AH) levando ao aumento da pressão intra-ocular (Pio)

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Protocol

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O cuidado do Animal nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e Comité de uso (ACUC) aprovaram todos metodologia deste estudo sob o NIEHS Animal estudar proposta IIDL 05-46.

1. coleção tecido ideal para o Laser Microdissection

  1. Obter 2 a 3 meses, ratos, masculino ou feminino C57BL/6. Eutanásia com CO2 por um período mínimo de 1 min ou até respiração cessou. Retire o animal da gaiola e assegurar a morte por deslocamento cervical, decapitação ou toracotomia.
  2. Antes de dissecação, certifique-se de todas as ferramentas de dissecação são limpos e esterilizados.
    Nota: Para a remoção dos olhos curvad....

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Results

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LCM coletados RNA de TM e corpo ciliar de 4 diferentes ratos foi isolado para ser capaz de analisar a expressão gênica e comparar a expressão com que em todo olho, esclera, íris, retina, córnea e lente isolados de três ratos separados. TM expressando genes, MYOC48 e ACTA249 foram analisados em todos os tecidos coletados para confirmar que as amostras isoladas de TM foram de fato altamente enriquecidas em TM. Devido a quanti.......

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Discussion

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O TM desempenha um papel vital em manter ativamente IOP homeostático e sua disfunção é amplamente aceito como o principal fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Um número de polimorfismos de nucleotídeo único em vários genes identificados pela análise GWAS tem sido associado ao risco aumentado de glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM; no entanto, os mecanismos moleculares precisos que dão o.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Primers ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 BioanalisadorAgilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kitAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Sistema de PCR Digital de GotículasBioRad
Pincel
PequenoLâmina de Microscópio de Vidro CarregadaThermo scientific4951PLUS-001
Acetato Violeta CresylSigma AldrichC5042
Tesoura
Eosin Y coranteThermo scientific71204
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta CapacidadeApplied Biosystems4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 CryostatLeica
Millex-GS unidade de filtroEMD MilliporeSLGS033SB0.22 µ m
MMI CellCut Modelo de corte UVMáquinas moleculares e IndústriasInstrumentos LCM
MMI CellTools SoftwareMolecular Machines & Tubodo software das50202
para a microdissecação da captura do laserProdutos deASEE ST-LMD-M-500Tubo de tampão do isolamento/fabricado por Microdissect GmBH em Alemanha e distribuído por produtos de ASEE
Tubo de amostra para a microdissecação da captura do laser (alternativa)Máquinas moleculares & Indústrias
modificadas Harris HematoxilinaThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
Memebrane Slides, Produtos ASEE SEM RNASEFS-LMD-M-50rMembrana de tereftalato de polietileno (PET)/Fabricado pela Microdissect GmBH na Alemanha e distrubted por Produtos ASEE
Lâminas de memebrana, máquinas moleculares e moleculares sem RNase (alternativa) Industries50102
Rapid FixThermo científico6764212H& E coloração
RLT BufferQiagen79216bufffer de lise usado para amostras LCM
de RNAseZapSigmaR2020RNase
Proteger o inibidor de RNAseSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004Kit de isolamento de RNA
SMART-Seq v4 Kit de RNA de entrada ultrabaixaTakara Clontech634888kit de RNA para cDNA de baixa entrada para amostras LCM
SuperMix (sem dUTP)BioRad1863023mistura mestre de PCR digital
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompostoSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XilenoMacron8668
Curva Pinça de Etanol Ponta curva e serrilhada (tamanho de ponta preferido: 0,5 x 0,4 mm) de amostra indústrias LCMSolução de descontaminação

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D.

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