Artigo de método

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

DOI:

10.3791/57576

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3 de junho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Resumo

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Laser captura microdissection (LCM) tem permitido a análise da expressão de genes de células únicas e enriquecido populações de células em cortes de tecido. LCM é uma ótima ferramenta para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes a diferenciação celular e o desenvolvimento e a progressão de várias doenças, incluindo o glaucoma. Glaucoma, que compreende uma família de neuropatia óptica progressiva, é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo. Mudanças estruturais e danos dentro da malha trabecular (TM) podem resultar em aumento da pressão intra-ocular (Pio), que é um importante fator de risco para o desenvolvimento de glaucoma. No entanto, os mecanismos moleculares precisos envolvidos são ainda mal compreendidos. A capacidade de realizar análise de expressão do gene será crucial na obtenção de mais insights sobre a função dessas células e seu papel na regulação do desenvolvimento IOP e glaucoma. Para conseguir isso, um método reprodutível para isolar altamente enriquecido TM de seções congeladas do olhos de rato e um método para análise de expressão do gene a jusante, tais como RT-qPCR e RNA-Seq é necessária. O método descrito neste documento é desenvolvido para isolar altamente pura TM de olhos de rato para a jusante do PCR digital e análise de microarray. Além disso, esta técnica pode ser facilmente adaptada para o isolamento de outras células oculares altamente enriquecidas e compartimentos de célula que tem sido difícil isolar-se dos olhos de rato. A combinação da análise de LCM e RNA pode contribuir para uma compreensão mais abrangente dos eventos celulares subjacentes glaucoma.

Introdução

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Glaucoma é um grupo de doenças caracterizadas por neuropatia óptica e retinopatia que aprimorem a cegueira irreversível1,2. Estima-se que por 2020 over 70 milhões de pessoas no mundo inteiro estaremos vivendo com alguma forma de doença3,4,5,6,7. Glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), o tipo mais prevalente de glaucoma, é caracterizada por uma diminuição no escoamento do humor aquoso (AH) levando ao aumento da pressão intra-ocular (Pio)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Esquerda não tratada, cronicamente elevada IOP conduz ao dano progressivo e irreversível à retina e cabeça do nervo óptico causando cegueira radial1,2,19. Todos os métodos atuais para retardar a progressão do glaucoma enfocam reduzindo IOP, diminuindo a taxa de produção de AH pelo corpo ciliar ou aumentando a vazão1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. a malha trabecular (TM) desempenha um papel vital na regulação ativamente o caminho de saída primário AH e sua função inadequada é um fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. No entanto, os mecanismos moleculares associados com disfunção TM e como regula AH drenagem não são compreendidos ainda inteiramente e é atualmente um grande foco de glaucoma pesquisa1,2,19, 20. enquanto vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) têm associados um número de genes para glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM, os mecanismos moleculares exatos que levam à doença não são ainda totalmente compreendidos21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Modelos animais melhoraram grandemente nosso conhecimento atual de progressão da doença no glaucoma (extensivamente revisado em3,15,16,26,,27,28, 29,30,31,32,33). Vários métodos pioneiros foram desenvolvidos para estudar o TM34,35,36 e esses métodos têm sido amplamente utilizados para fazer avançar a nossa compreensão atual do tecido normal e doente. Uma área que não tem sido extensivamente explorada é a utilização de modelos de rato geneticamente modificado para estudar os mecanismos moleculares da falha de TM. Transgênico bater-no e estudos de mata-mata rato de genes TM associado, tais como Myocilin (Myoc)37,38 e Cyp1b139, têm sido as principais ferramentas para estudar os mecanismos moleculares de TM função. Compreensivelmente, o pequeno tamanho da TM em camundongos representa um sério obstáculo que deve ser superado a fim de começar a estudar este tecido. Modelos de mouse representam uma poderosa ferramenta para estudar a genética e os mecanismos moleculares da doença, enquanto os avanços em tecnologias de LCM fornecem as ferramentas necessárias para capacitar o estudo dos tecidos menores e mais delicados, incluindo o TM.

Neste relatório, um método robusto e reprodutível é descrito para o LCM de TM altamente enriquecido de olhos de rato junto com posterior isolamento do RNA e amplificação para análise de expressão a jusante. Métodos semelhantes têm sido utilizados com sucesso em ratos para isolar outros tipos de olho tecidos40,41,42,,43,44, a metodologia aqui indicada pode ser aplicada a outros discretos tecidos do olho para estudar microRNA, RNA, DNA e proteínas. Importante, esta técnica permite o uso de camundongos geneticamente modificados para melhor compreender a patogênese molecular da imparidade TM em glaucoma e doença ocular3,15,16,17 ,18,26,31,,45,46. A capacidade de isolar o TM de olhos de rato por LCM será uma técnica útil na obtenção de mais insights sobre os mecanismos moleculares de diversas doenças oculares.

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Protocolo

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O cuidado do Animal nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e Comité de uso (ACUC) aprovaram todos metodologia deste estudo sob o NIEHS Animal estudar proposta IIDL 05-46.

1. coleção tecido ideal para o Laser Microdissection

  1. Obter 2 a 3 meses, ratos, masculino ou feminino C57BL/6. Eutanásia com CO2 por um período mínimo de 1 min ou até respiração cessou. Retire o animal da gaiola e assegurar a morte por deslocamento cervical, decapitação ou toracotomia.
  2. Antes de dissecação, certifique-se de todas as ferramentas de dissecação são limpos e esterilizados.
    Nota: Para a remoção dos olhos curvado tesoura e pinça com ponta serrilhada (preferido do tamanho da ponta: 0.5 x 0.4 mm) serão necessários.
  3. Estabelecer o mouse sobre uma superfície plana de lado para que o olho é facilmente acessível. Agarrar o canto do olho (o canto do olho) com a pinça para estabilizar o mouse, em seguida, usando a tesoura curva, enfrentando a curva longe o olho, corte em volta do olho usando o soquete do olho como um guia até o globo ocular pode facilmente ser tomado da tomada (use a curva não o pontas da tesoura).
  4. Puxe delicadamente e, usando a tesoura curva, cortar o nervo óptico, que libera o olho da tomada da orbital. Retire cuidadosamente o tecido não-ocular de olho e enxágue em 1 x salina tamponada fosfato (PBS). Repita 1.3-1.4 para o olho contralateral.
  5. Borre o olho com uma toalhita de tecido para remover qualquer umidade antes de incorporação. Coloque o olho num molde de amostra (25 x 20 x 5 mm3) para que a lente e o nervo óptico são paralelos à parte superior do banco a fim de obter as seções sagitais. Incorporar os olhos no ideal corte temperatura (O.C.T.) composto e coloque sobre o gelo seco para congelar. Uma vez congelado, armazenar os blocos a-80 ° C.

2. biópsia de preparação para o Laser Microdissection

  1. Antes de usar incube polietileno tereftalato (PET) da membrana em cross-linker UV a máxima potência durante 45 min.
  2. Pulverize a solução de descontaminação RNase sobre a escova, fórceps, acoplamento vidrinhos e montando o chuck. Limpe cuidadosamente. Enxague com água livre de nuclease e seque. Limpe o criostato com 100% de etanol para evitar contaminação cruzada.
  3. Ajustar o criostato a-18 ° C. Remover um bloco congelado do congelador-80 ° C em um tempo e entregar o criostato com gelo seco. Permitir que o bloco congelado equilibrar com a temperatura do criostato para um mínimo de 10 min.
  4. Espremer uma pequena quantidade de O.C.T. a massa de montagem (figura 1A) e remover o bloco do tecido do molde e coloque cuidadosamente o bloco sobre o mandril de montagem (figura 1B). Uma vez que o bloco de tecido sobre o mandril de montagem está congelado, insira o suporte de amostra do criostato (Figura 2A).
  5. Ajuste o criostato para 8 µm de seções de corte e secção cuidadosamente através do bloco O.C.T. para chegar a amostra de tecido. Uma vez que o tecido é observado, seccionamento, aparar os blocos congelados por todos os lados, usando uma lâmina limpa e deixam 3 a 4 mm de O.C.T. o tecido circundante para habilitar o tratamento com a escova de pintura (Figura 2B). Use um pincel limpo de novo em vez da placa entre cada mudança de amostra para evitar a contaminação da amostra.
  6. Secção através do olho a trabalhar rapidamente. Mancha cada terceira seção inundando o slide com um rápido passo hematoxilina e eosina (H & E) Mancha por 60 s, enxágue com água da torneira, ar seco, claro no despachante e montar em uma placa de vidro carregada com uma lamela. Ver no microscópio e continuar até que o TM é evidente nas seções de corte de corte.
  7. Uma vez que o TM começa a aparecer, 2 seções de corte e montar numa lâmina de vidro carregada por rotina, H & E mancha para formar um mapa para corte com LCM.
    Nota: Consulte a seção 3 para mapa e detalhes de coloração.
  8. Após a primeira H & E mapeiam slide, cortar e linha 6 seções de espessura 8 serial-µm em criostato e montar simultaneamente para o slide de membrana de PET (Figura 3A, B). Aderir o tecido brevemente deslizando com o polegar ao longo das costas da membrana. Após a montagem, coloque o slide de membrana PET imediatamente em uma caixa de slides em gelo seco.
    Nota: Menos seções podem ser montadas, no entanto, várias seções para o slide de montagem ao mesmo tempo é recomendado para reduzir a degradação do RNA, limitando a quantidade de tempo que cada seção é exposta ao ar a temperatura ambiente.
  9. Continue a seção o olho, depois cada dois slides de membrana de PET com 6 seções cada, recolher duas seções sobre uma lâmina de vidro carregada para criar outro slide de mapa para coloração H & E. Continue o seccionamento, aproximadamente 100 µm-8 serial espessas seções, até TM não é mais visível. Confirme pela coloração rapidamente uma seção sobre uma placa de vidro carregada (ver 2.6).
  10. Armazenar todos os slides de membrana de PET a-80 ° C para uso posterior do LCM.

3. H & Slide de mapa E manchando o protocolo e análise morfológica

  1. Para visualizar e revisar os slides mapa nas corrediças de vidro carregada, fix o tecido pela transferência imediatamente para um frasco de coloração preenchido com 100 mL da solução de fixação rápida para 7 s. Enxágue o slide mergulhando-a em água destilada, 10 - 20 vezes , então transfira o slide para um frasco de acoplamento com água destilada limpa.
  2. Retirar a lâmina da água e borre secas bordas com limpeza do tecido. Pipetar 200 µ l modificado filtrada Harris Hematoxylin em cada seção e incube por 30 s, à temperatura ambiente. Lave cuidadosamente o slide sob água corrente até que água saia clara. Borre o fim do slide com um tecido de limpeza entre cada etapa (borrão entre cada etapa de 3,2-3.5) para remover o excesso de líquido.
  3. Slide de lugar em 1X PBS em temperatura ambiente por 30 s. Então, cuidadosamente, enxágue o slide sob água corrente por 30 s.
  4. Mergulhe o slide 3 - 4 vezes em banho de etanol 95%. Aplique bastante solução de corante eosina Y para cobrir o tecido no slide e incube por 15 s à temperatura ambiente.
  5. Enxágue o slide no banho de etanol 95% duas vezes com os mergulhos rápidos 10-20. Enxágue o slide no banho de etanol 100% duas vezes com os mergulhos rápidos 10-20. Em seguida, enxágue slide duas vezes num banho de xileno (10-20 rápidos mergulhos cada).
  6. Montagem aplicando o meio de montagem resinoso ao tecido, adicionar lamela cuidadosamente para evitar bolhas de ar e deixe secar durante a noite no bairro.
  7. Revisão H & E slides visualmente ou por meio de um scanner de slides digitais. Identifica o mapa slides com TM claramente visível e acessível para o corte. Usar o PET mapeiam de slides membrana entre estes slides para LCM.

4. polietileno tereftalato (PET) membrana desliza protocolo de transformação e coloração

  1. Antes de remover slides de PET do congelador primeiro preparar solução estoque de cresilo violeta dissolvendo 0,3 g de acetato de cresilo violeta em 20 mL de etanol 75% e colocar no abanador para 2 h. filtrar a solução com 0,22 µm unidade de filtro estéril e loja a 4 ° C, para não mais do que 6 seg THS.
  2. Prepare eosina Y solução alcoólica com fresco 75% de etanol na proporção de 1:4. Prepare soluções de desidratação (75%, 95% e 100% de etanol) e fixação (75% de etanol) em tubos polipropileno cônico de 50ml limpo, livre de nuclease, no gelo. Adicione inibidor de RNase para cada solução.
  3. Remova a caixa de slides contendo seções de tecido congelado do congelador-80 ° C e coloque-o em gelo seco. Processe um slide no momento. Corrigir slides, colocando o slide imediatamente em álcool etílico frio de 75% por 30 s.
  4. Mergulhe delicadamente o slide em água livre de nuclease por 10-15 s para dissolver O.C.T. sem interferir com as secções de tecido.
  5. Cuidadosamente, pipete 300 µ l de solução de acetato de violeta de cresilo 1,5% diretamente sobre as seções e incubar durante 45 s em temperatura ambiente. Em seguida, lavar uma vez, colocando-o em banho de etanol 75% por 30 s. Pipetar 200 µ l eosina Y solução sobre as seções e incubar durante 3-5 s.
  6. Desidrata-se tecido, colocando o slide posteriormente em 75% de etanol, etanol 95% e, finalmente, banho de etanol 100% por 30 s cada. Borre o fim do slide com uma toalhita de tecido entre todos os passos para remover o excesso de líquido. Deixe o ar de slide secar completamente sob o capô, por 5 min. Depois de seco, execute LCM imediatamente a seguir.
    Nota: Recomenda-se evitar o uso de xileno para esta etapa, pode causar cortes histologicos de vínculo inadequadamente para o slide de membrana e reduz a eficiência de captura de tecido.

5. laser Microdissection com Laser UV

  1. Ligue o computador e permitir que a bota. Ligue a fonte de alimentação de luz branca de microscópio. Ligue a chave do laser UV e um amarelo LED acenderá. Inicie o software de LCM, permitem carregar totalmente e um vídeo ao vivo irão exibir. Pressione o botão do laser na caixa do controlador e um LED verde acende.
  2. Carregar uma nova lâmina de vidro para o palco do microscópio e, em seguida, coloque o slide de membrana de PET com o lado do tecido manchado virado para baixo diretamente na parte superior da lâmina de vidro. Certifique-se que a membrana e a lâmina de vidro estão emparelhados firmemente no palco microscópio.
  3. LCM iniciar definindo os limites do slide. Escolha o mais baixo 4 X ampliação no painel objetiva (Figura 4). Em seguida, defina a área de trabalho do slide membrana movendo o microscópios xy-palco até o canto superior esquerdo, onde se encontram o metal e a membrana é visível no vídeo ao vivo de alimentação, pressione o botão "Limite 1" e um retângulo vermelho aparecerá sobre o roteiro. Em seguida, passar para a fase de xy para o canto oposto e pressione o botão "limitar a 2". Pressione o botão "scan" para criar uma imagem de roteiro da membrana e tecidos entre os limites definidos.
  4. Dê um duplo clique perto o TM de uma das seções olho dentro do roteiro, a TM pode ser localizado perto do ápice do ângulo iridocorneal (Figura 5A). Uma vez que o TM foi identificado, aumente a ampliação de 10x e manualmente o foco no TM. Repita com 20 X e 40 X de objectivos. Quando o TM está em foco, com o objetivo de X 40 (Figura 5B), navegar em uma área em branco nas proximidades (foco pode precisar ser ajustada ligeiramente), selecione a "ferramenta de desenho à mão livre" e desenhe uma linha de tempo em uma área em branco do tecido.
  5. Defina os parâmetros do laser para que a velocidade de"corte" é de 34%, "foco" é de 58%, e "poder" é de 70% (Figura 4) e, em seguida, pressione o botão "cortar". Fazer ajustes de laser bem a velocidade, foco e parâmetros de potência até uma linha de corte fino e claro for observada (ver Figura 5). Para um corte preciso, certifique-se de ação de corte segue a linha desenhada.
  6. Carregue a tampa do tubo de isolamento no suporte da tampa e abra o tubo. Anexar o cap-titular para o cap-elevador e verifique se que o tubo está invertido. Assegurar que o material do tampão adesivo se projeta para além da ponta da PAC para garantir que o tecido desejado corretamente é capturado.
  7. Selecione o modo de dissecação "Manual" no painel de software. Reveja com cuidado que o TM (Figura 5B) está diretamente abaixo do tubo de isolamento. Definir o balanço de branco e ajustar o brilho para adquirir a qualidade de imagem ideal (Figura 4).
  8. Para iniciar o corte, manualmente ajustar o foco e desenhe uma linha utilizando a ferramenta mão livre, certifique-se de que a tampa da coleção permanece na posição ainda não tocar a membrana. Desenhar círculos parciais perto de onde o TM encontra a esclera (Figura 5), em seguida, pressione "corta". Uma vez que são feitos os primeiros cortes, posicione a tampa na posição para baixo e re-ajustar o foco e, em seguida, desenhe duas linhas no espaço livre ou aberto para conectar os dois círculos parciais, completando o círculo em torno do TM, em seguida, pressione "cortar" e coletar tecido de seção , certifique-se de que a TM foi apanhada pela PAC microdissection (Figura 5D-F).
  9. Coloque a tampa de volta para a posição correcta e repita (5,2-5,8) nas restantes secções. Ligeiramente ajuste a posição da tampa para que todas as amostras isoladas o encaixe no PAC e não sobrepor (Figura 5). Para obter consistência, a janela de tempo para um slide é 20 min. Use menos seções por animal deslize se é necessário mais tempo para isolar TM de todas as seções. Para a membrana de PET próxima, inserir um novo tubo de isolamento e repetir a seção 5.

6. lise de Microdissected TM tecido

  1. Recentemente prepare o tampão de lise de RNA para lyse tecido isolado de LCM. Adicione 10 µ l de β-Mercaptoetanol para cada 1 mL de tampão de Lise. Armazene a Lise com β-Mercaptoetanol à temperatura ambiente para não mais de 1 mês.
  2. Retire o tubo de isolamento do titular do cap dentro de 20 minutos desde o início do microdissection. Visualize a superfície da tampa pelo olho para garantir a captura de TM.
  3. Pipete cuidadosamente lise de 10 µ l para a tampa do tubo da coleção, garantindo a Lise cubra completamente o microdissected TM. Delicadamente feche adesiva tampa e incubar o tubo da coleção do avesso à temperatura ambiente por 10 min. Após a incubação, centrifugar a 800 x g por 2 min e coloque lisado em gelo seco. Loja lysates a-80 ° C para posterior análise e purificação.

7. RNA isolamento e análise de qualidade

  1. Analise a qualidade do RNA por descongelar amostras à temperatura ambiente. Piscina junto todas as amostras isolaram de um único rato em um tubo de microcentrífuga de RNase-livre 1,5 mL.
    Nota: por exemplo, para replicar cada biológico, 10-12 tubos com tampas de microdissected em 10 µ l lisado foram gerados e lisados todos foram transferidos para um tubo único para cada replicar biológico (100-120 µ l de lisado).
  2. Adicione um volume de etanol a 70% (feito com água livre de RNase) recentemente preparada para cada solução lisada. Em seguida, purifica o RNA total, seguindo as diretrizes de usuário de kit de isolamento de RNA. Garantir a remoção do DNA genômico de cada amostra de RNA.
    Nota: O DNA genômico pode interferir com análise de RNA a jusante.
  3. Medir a qualidade do RNA isolado do TM juntos pool de amostras de cada mouse e analisando a integridade do RNA ribossomal (figura 6A).
    Nota: Devido ao pequeno tamanho da TM, picos de RNA ribossomal podem não ser observável (Figura 6B) no perfil de qualidade de RNA (dois picos observados entre 1.000-4.000 bp na figura 6A, C) que é usado para calcular o número de integridade do RNA (RIN) 47.
    1. Obter uma medida mais precisa da integridade do RNA, isolando o RNA do tecido remanescente do slide de membrana mais abundante. Para obter um representante RIN, isolado do RNA do tecido-ocular do slide de membrana por pipetagem 10 lise µ l de buffer na seção de um tecido e realizar o isolamento de RNA. Analisar a qualidade do RNA e calcular RIN (Figura 6).
  4. Para aplicações a jusante do RNA, uso um kit de RNA de entrada baixo para geração de sequenciamento e cDNA biblioteca produzir reprodutíveis resulta do tão pouco quanto 80 seções de LCM isolado TM.

8. análise

  1. Para verificar que o tecido coletado na verdade é enriquecido em genes associados a TM, colete vários RNA adicional de olho toda microdissected, esclera, íris, retina, córnea e lente de 3 ratos separados. Uso que esse RNA em combinação com LCM coletou RNA do isolado TM e corpo ciliar coletadas de 4 ratos separados.
  2. Converter que o RNA das amostras microdissected foi a utilização de um kit de transcrição reversa do cDNA de cDNA. Amplificar o RNA das amostras isolada de LCM e converter para cDNA usando uma entrada baixa RNA para kit de cDNA.
  3. Analisar todos os RNA para expressar genes, myocilin (MYOC) e alfa-actina-2 (ACTA2), de malha trabecular e normalizar usando o gene de limpeza HSP90a1 por PCR digital (Figura 7A-B).

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Resultados

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LCM coletados RNA de TM e corpo ciliar de 4 diferentes ratos foi isolado para ser capaz de analisar a expressão gênica e comparar a expressão com que em todo olho, esclera, íris, retina, córnea e lente isolados de três ratos separados. TM expressando genes, MYOC48 e ACTA249 foram analisados em todos os tecidos coletados para confirmar que as amostras isoladas de TM foram de fato altamente enriquecidas em TM. Devido a quanti...

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Discussão

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O TM desempenha um papel vital em manter ativamente IOP homeostático e sua disfunção é amplamente aceito como o principal fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Um número de polimorfismos de nucleotídeo único em vários genes identificados pela análise GWAS tem sido associado ao risco aumentado de glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM; no entanto, os mecanismos moleculares precisos que dão o...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Primers ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 BioanalisadorAgilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kitAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Sistema de PCR Digital de GotículasBioRad
Pincel
PequenoLâmina de Microscópio de Vidro CarregadaThermo scientific4951PLUS-001
Acetato Violeta CresylSigma AldrichC5042
Tesoura
Eosin Y coranteThermo scientific71204
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta CapacidadeApplied Biosystems4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 CryostatLeica
Millex-GS unidade de filtroEMD MilliporeSLGS033SB0.22 µ m
MMI CellCut Modelo de corte UVMáquinas moleculares e IndústriasInstrumentos LCM
MMI CellTools SoftwareMolecular Machines & Tubodo software das50202
para a microdissecação da captura do laserProdutos deASEE ST-LMD-M-500Tubo de tampão do isolamento/fabricado por Microdissect GmBH em Alemanha e distribuído por produtos de ASEE
Tubo de amostra para a microdissecação da captura do laser (alternativa)Máquinas moleculares & Indústrias
modificadas Harris HematoxilinaThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
Memebrane Slides, Produtos ASEE SEM RNASEFS-LMD-M-50rMembrana de tereftalato de polietileno (PET)/Fabricado pela Microdissect GmBH na Alemanha e distrubted por Produtos ASEE
Lâminas de memebrana, máquinas moleculares e moleculares sem RNase (alternativa) Industries50102
Rapid FixThermo científico6764212H& E coloração
RLT BufferQiagen79216bufffer de lise usado para amostras LCM
de RNAseZapSigmaR2020RNase
Proteger o inibidor de RNAseSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004Kit de isolamento de RNA
SMART-Seq v4 Kit de RNA de entrada ultrabaixaTakara Clontech634888kit de RNA para cDNA de baixa entrada para amostras LCM
SuperMix (sem dUTP)BioRad1863023mistura mestre de PCR digital
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompostoSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XilenoMacron8668
Curva Pinça de Etanol Ponta curva e serrilhada (tamanho de ponta preferido: 0,5 x 0,4 mm) de amostra indústrias LCMSolução de descontaminação

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

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