Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

Summary

Aqui apresentamos, e contraste dois protocolos usados para decellularize de tecidos vegetais: uma abordagem baseada em detergente e uma abordagem livre de detergente. Ambos os métodos deixam a matriz extracelular dos tecidos da planta utilizada, que pode então ser utilizada como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Abstract

Os enxertos autólogos, sintéticos e derivados de animais usados atualmente como andaimes para substituição de tecido têm limitações devido à baixa disponibilidade, pobre biocompatibilidade e custo. Tecidos vegetais têm características favoráveis que as tornam excepcionalmente adequado para usar como andaimes, tais como elevada área superficial, transporte de água excelente e retenção, porosidade interconectada, preexistente redes vasculares e uma vasta gama de mecânica Propriedades. Dois métodos bem sucedidos de decellularization planta para aplicações de engenharia de tecido são descritos aqui. O primeiro método é baseado em banhos de detergente para remover matéria celular, que é semelhante aos métodos estabelecidos anteriormente usados para limpar tecidos de mamíferos. O segundo é um método livre de detergente, adaptado de um protocolo que isola a vasculatura de folha e envolve o uso de uma lixívia aquecida e o banho de sal para limpar as folhas e caules. Ambos os métodos produzem andaimes com propriedades mecânicas comparáveis e baixo impacto metabólico celular, permitindo que o usuário selecione o protocolo que melhor se adapte às sua aplicação pretendida.

Introduction

Engenharia de tecidos surgiu na década de 1980 para criar tecidos vivos substitutos e potencialmente endereço importantes órgãos e tecidos escassez¹. Uma estratégia tem andaimes usados para estimular e orientar o corpo para regenerar tecidos ou órgãos. Embora avançado abordagens de fabricação, tais como impressão 3-d produziram andaimes com propriedades físicas originais, a capacidade de fabricar andaimes com uma variada gama de propriedades físicas e biológicas realizáveis permanece um desafio^{2 , 3}. Além disso, devido à falta de uma rede vascular funcional, estas técnicas têm sido limitadas em regenerar tecidos 3-dimensional. A utilização de tecidos animais e humanos decellularized como andaimes tem auxiliado em contornar este problema,^4,5,6,7. No entanto, custo elevado, lotes de variabilidade e disponibilidade limitada podem limitar a utilização generalizada de animal decellularized moldes⁸. Também existem preocupações sobre a transmissão de doença potencial aos pacientes e uma reação imunológica de alguns tecidos de mamíferos decellularized⁹.

Celulose, derivada da planta e fontes bacterianas, tem sido extensivamente usado para gerar biomateriais para uma ampla gama de aplicações na medicina regenerativa. Alguns exemplos incluem: osso^10,11, cartilagem^12,13,14 e¹⁵de cicatrização de feridas. Andaimes que são compostas de celulose têm um benefício adicional em que eles são duráveis e resistentes a ser discriminadas em células de mamíferos. Isto é devido ao fato de que células de mamíferos não produz as enzimas necessárias para quebrar as moléculas de celulose. Em comparação, andaimes produziram usando macromoléculas da matriz extracelular, como o colágeno, são facilmente quebrados¹⁶ em podem não ser adequados para aplicações de longo prazo. Andaimes de colágeno podem ser estabilizadas por químicos do cross-linking. No entanto, há um trade-off devido a toxicidade inerente dos cross-linkers que afetam a biocompatibilidade dos andaimes¹⁷. Por outro lado, a celulose tem o potencial de permanecem presentes no local da implantação por períodos prolongados de tempo porque é impermeável à degradação enzimática por pilhas mamíferas^18,19,20. Isto pode ser alterado por meio do ajuste da taxa de degradação através de pré-tratamento de hidrólise e co entrega dos andaimes com cellulases²¹. A biocompatibilidade de celulose de origem vegetal decellularized andaimes na vivo também foi demonstrada em um estudo feito em ratos²².

Através de centenas de milhões de anos de evolução, as plantas refinaram sua estrutura e composição para aumentar a eficiência do transporte de fluidos e retenção. Planta vasculares vasos minimizam resistência hidráulica, ramificando em vasos menores, semelhantes da vasculatura mamíferos de acordo com Murray lei²³. Depois da decellularization, complexa rede da planta de vasos e poros interconectados é mantida. Tendo em conta o vasto número de espécies de plantas distintas prontamente disponíveis, andaimes de origem vegetal têm potencial para superar as limitações de projeto atualmente afetando andaimes em tecido engenharia^24,25. Por exemplo, Modulevsky et al demonstraram que angiogênese e célula de migração ocorreu quando apple decellularized tecido foi implantado por via subcutânea na parte de trás de um rato de²². Da mesma forma, Gershlak et al mostrou que as células endoteliais poderiam ser crescidas dentro da vasculatura de folhas decellularized²⁴. Em um experimento separado, Gershlak et al também foram capazes de mostrar que cardiomyocytes poderiam ser cultivadas na superfície das folhas e foram capazes de contrato²⁴.

Plantas também incluem a organização complexa do celular à escala macroscópica, que é difícil de alcançar, mesmo com as mais avançadas técnicas de fabricação desenvolvidas até à data. A complexa concepção hierárquica de tecidos vegetais torna-los mais forte do que a soma dos seus constituintes,²⁶. Plantas possuem uma infinidade de propriedades mecânicas diferentes, que vão desde componentes rígidos e duros como hastes, para os muito mais flexíveis e maleáveis, tais como folhas de²⁷. Folhas variam dependendo da espécie em termos de tamanho, forma, quebrar a força, o grau de vascularização e podem levar a diferentes graus de Hidrofilia. Em geral, essas propriedades da planta sugerem que plantas decellularized podem servir como únicos e altamente funcionais de dispositivos médicos, incluindo como andaimes de engenharia de tecidos.

Este protocolo centra-se em dois métodos de decellularize de tecidos vegetais, tais como folhas e caules, para utilização como andaimes em engenharia de tecidos. O primeiro método é uma técnica baseada em detergente que usa uma série de banhos para retirar DNA e matéria celular, que foi adaptada de uma técnica amplamente utilizada decellularize mamíferos e vegetais tecidos^{6,22,25 ,28,29,30}. O segundo método é livre de detergente e é uma adaptação de um protocolo de "esqueletonização", geralmente usado para remover os tecidos moles de folhas³¹. Trabalhos anteriores mostraram que ferver as folhas em uma solução de água sanitária e bicarbonato de sódio facilitou a separação da vasculatura do tecido mole circundante³¹. Esta técnica pode ser citada para experiências realizadas no^dia 17 e^{18 séculos, tais como o trabalho de Albertus Seba32 e Edward Parrish33} . Estas experiências centradas em torno de deixando matéria vegetal, como folhas e frutos, submersos em água por longos períodos de tempo (semanas ou meses) e permitindo que os tecidos mais macios à deterioração embora naturalmente. Aqui, a abordagem de "esqueletonização" é adaptada para usar condições mais leves, tais como tempos de incubação mais longos a temperaturas mais baixas, para remover resíduos celulares e para não perturbar significativamente a estrutura de tecido mole. Para os experimentos detalhados neste documento, foram utilizados três tipos de plantas: Ficus hispida, Pachira aquatica e uma espécie de Garcinia. Resultados de DNA quantificação, ensaios mecânicos e impacto sobre a atividade metabólica celular de ambos os métodos são descritos.

Protocol

1. decellularization do tecido de planta usando a abordagem baseada em detergente

1. Use o fresco ou congelado F. hispida, amostras de folha. Congele não utilizadas amostras frescas em uma loja para uso futuro (até um ano) e congelador-20 ° C.
   Nota: Use tecido de tronco ou folha de quase qualquer planta desejada. Tempos de armazenagem prolongada podem causar danos aos tecidos.
   1. Determinar o tamanho e a forma de amostras a ser processados com base na utilização do exemplo (ou seja, amostras cortadas em tiras são adequadas para aplicações de testes mecânicas, entretanto, amostras de disco de 8 mm são úteis em aplicações de cultivo multi bem ). Corte a folha em discos de 8 mm com uma biópsia afiada, limpa soco enquanto submerso sob temperatura ambiente (20-25 ° C) água deionizada H₂O.
      Nota: Este protocolo pode ser usado em caules e folhas de toda. No entanto, as amostras menores serão decellularize mais rápido.
   2. Incube as amostras durante 5-10 min à temperatura ambiente (20-25 ° C) água deionizada H₂O em um conjunto de placa de agitação para uma configuração de baixa velocidade para lavar e/ou descongelá-los. Uso bastante água deionizada H₂O para garantir que todas as amostras são completamente molhadas.
2. Preparar uma solução de 10% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em desionizada H₂O. lugar as amostras em um recipiente adequado (um copo ou prato plástico é ideal) e adicione solução de SDS para cobrir completamente as amostras. Incube as amostras por 5 dias em temperatura ambiente (20-25 ° C) em um conjunto de placa de agitar a baixa velocidade para evitar danos às amostras.
   Nota: Não sobrecarregar o contêiner como isso pode retardar o processo de decellularization e levar a um tratamento desigual por SDS. Durante esta etapa, as amostras devem adquirir uma tonalidade marrom.
   1. Depois de 5 dias, substitua a solução de SDS desionizada H₂O. Incubar as amostras para um adicional 10-15 min na placa de agitação para enxaguar fora qualquer solução residual de SDS.
3. Prepare um tensoativo não-iônico de 1% (v/v) em solução 10% (v/v). Para fazer uma solução de 500 mL, misturar 5 mL de tensoativo não-iônico com 50 mL de água sanitária, em seguida, adicionar 445 mL de deionizada H₂O. submergir amostras em solução recentemente preparada.
   Nota: A solução de tensoativo não-iônico/água sanitária não tem uma vida útil longa, portanto, deve ser usado dentro de 48 h de preparação.
4. Substitua a solução de tensoativo não-iônico/lixívia cada 24h até as amostras são completamente desmarcadas (consulte a figura 1A , para comparação visual). Então incube a amostra em água desionizada num prato de agitar por 2 min para enxaguar a excesso tensoativo não-iônico/lixívia solução. Coloque a placa de agitação para um baixo ajuste para não danificar as amostras.
   Nota: O tempo necessário para limpar as amostras utilizadas varia, dependendo do tipo e da espécie da planta. A descoloração completa das amostras é indicativo de decellularization completo (realizar a quantificação de DNA para garantir a limpeza completa).
   1. Lyophilize as amostras para armazená-los até um ano (flash congelamento com nitrogênio líquido é preferencial, congelar as amostras em-80 ° C também é aceitável) e armazená-los em temperatura ambiente (20-25 ° C) em baixa umidade.
   2. Reconstituir as amostras em Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) usando o suficiente para amostras de casaco. Lave as amostras 2 - 3 vezes em media serum-free suavemente utilizando uma micropipeta antes do uso (ou seja, uso de 150-300 µ l por enxágue, em um prato bem 24 padrão).
      Nota: Tampão Tris-HCl e media serum-free (ou seja, DMEM, mas qualquer célula básica cultura mídia pode ser substituída) é mais eficaz na redução do impacto de viabilidade celular das amostras de SDS tratada do que aqueles tratados com desionizada H₂O sozinho.

2. preparação das amostras usando a abordagem de Decellularization livre de detergente

Nota: Os passos iniciais deste procedimento coincidem com passos 1.1-1.1.2 (veja acima).

1. Prepare uma lixívia 5% (v/v) (NaClO) e solução de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) de 3% (p/v). Aquecer a solução em uma coifa para 60-70 ° C para amostras de folha de F. hispida cortado em discos de 8 mm, agitando um prato quente.
   Nota: O bicarbonato de sódio pode ser substituído com carbonato de sódio (Na₂CO₃), ou hidróxido de sódio (NaOH). A temperatura varia muito (de temperatura de 90 ° C) e deve ser ajustada de acordo com as propriedades das amostras utilizadas.
2. Uma vez que a solução atinja a temperatura desejada, mergulhe as amostras e reduzir a velocidade de agita para evitar danificá-los. Depois que as amostras são visivelmente limpas (consulte a figura 1B para comparação visual), retirar do banho com cuidado. Incube amostras uma vez em desionizada H₂O para 1-2 min remover a solução de água sanitária em excesso.
   Nota: O tempo necessário para limpar as amostras pode variar amplamente. Por exemplo, corte de salsa pode ser cancelada em 10-15 min, enquanto amostras mais espessas e/ou maiores como todo folhas ou caules podem demorar horas em banhos de alta temperatura para limpar completamente.
3. Lyophilize as amostras e armazená-los em temperatura ambiente (20-25 ° C) em baixa umidade.

Results

Ambos os métodos renderam andaimes que foram adequados para a cultura de células e tecidos, aplicações de engenharia. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho geral do processo de decellularization, usando uma folha intacta para o método baseado em detergente e cortadas amostras (8 mm de diâmetro) para o método livre de detergente. Decellularization bem sucedido dos tecidos Ficus hispida , ambos os métodos a seguir rendeu amostras claras e intactas (

Discussion

Aqui, dois métodos de decellularize de tecidos vegetais são descritos. Os resultados apresentados aqui, juntamente com os resultados de estudos prévios²⁵, sugerem que os protocolos apresentados são prováveis aplicável a um amplo espectro de espécies de plantas e podem ser executadas em ambos os caules e folhas. Estes procedimentos são simples e não requer equipamento especializado, então decellularization de planta pode ser realizada na maioria dos laboratórios. Vale ressaltar que, após a decellul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dodecil sulfato de sódio	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Surfactante não iônico referenciado em papel. Reagente muito viscoso, pode ajudar a cortar a ponta da pipeta ao retirá-la.
Alvejante concentrado (hipoclorito de sódio a 8,25%)	Clorox	Item #: 31009	Alvejante concentrado padrão.
Bicarbonato de sódio	Acros Organics	217120010	Pode ser substituído por hidróxido de sódio ou carbonato de sódio.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Corta amostras que se encaixam bem em placa de 24 poços
Mesa Belly Dancer-Shake	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use baixas velocidades para não danificar os tecidos. Pode usar qualquer modelo/marca de mesa vibratória.
Placa quente/agitadora Isotemp	Fisher Scientific		Pode usar qualquer estilo/marca de placa quente/agitada.
Copo	Qualquer		Pode usar qualquer tamanho de copo, desde que caiba em suas amostras e não as superlote.
Hidrocloro Tris	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA ensaio	Life Technologies	P11496	Pode usar qualquer método de quantificação de dsDNA disponível.