Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Summary

Este artigo descreve uma metodologia detalhada de usando uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para perfundir vasculatura murino para quantificação do diâmetro da aorta em um modelo do rato de aneurisma da aorta e dissecação.

Abstract

Dissecção e aneurisma da aorta está associadas com significativa morbi -mortalidade na população e pode ser altamente letais. Enquanto existem modelos animais de doenças da aorta, na vivo imagens da vasculatura tem sido limitada. Nos últimos anos, a tomografia micro-computadorizada (micro-CT) surgiu como uma modalidade preferencial para grandes e pequenos vasos de imagem in vivo e ex vivo. Em conjunto com um método de fundição vascular, com sucesso usamos micro-CT para caracterizar a frequência e a distribuição de patologia da aorta no β-aminopropionitrile-tratada C57/Bl6 ratos. Limitações técnicas deste método incluem variações na qualidade da perfusão introduzida por má preparação de animais, a aplicação de metodologias adequadas para quantificação de tamanho de navio e a não-capacidade de sobrevivência deste procedimento. Este artigo detalha uma metodologia para a perfusão intravascular de uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para a caracterização quantitativa da aortopathy em um modelo do rato do aneurisma e dissecação. Além de visualizar a patologia da aorta, esse método pode ser usado para examinar outros leitos vasculares na vivo ou camas vascular removidas post-mortem.

Introduction

A incidência da dissecção da aorta é 3 casos por 100.000 por ano¹. Dissecção aórtica e doenças aneurismática conta para mais de 10.000 mortes nos Estados Unidos a cada ano, respondendo por 1-2% de todas as mortes em países ocidentais². Dissecação da aorta é iniciada por uma lágrima na camada da íntima do vaso com a propagação de sangue através das camadas da parede da aorta sob pressões fisiológicas. As pressões de pulso elevada do paciente estão associadas com um aumento da incidência de dissecção e complicações. Tensão de cisalhamento da parede aumentado está associado com a expansão da parede da aorta conduz a uma formação de aneurisma^3,4. Consequências da dissecção da aorta incluem a oclusão do fluxo sanguíneo para órgãos distantes, incluindo o cérebro, rins, intestinos e os membros, a formação de aneurismas crônicos, ruptura ou morte^5,6,7.

Neste momento, os processos bioquímicos e celulares envolvidos na iniciação e progressão dos aneurismas da aorta e as dissecções são ainda mal compreendidos. Reprodutíveis modelos animais de aneurisma da aorta e dissecação são a chave para a compreensão de sua fisiopatologia. Β-aminopropionitrile (BAPN) é um inibidor da lisil oxidase, que impede que o cross-linking de elastina e colágeno e foi mostrado para alterar significativamente a estrutura da matriz extracelular vaso parede e sua integridade biomecânica^{6, 8}. Roedores tratados com BAPN tem sido utilizados como um modelo animal comum de aneurisma da aorta e dissecação^9,10.

Modalidades de imagem vasculares são instrumentais em identificar a patologia vascular, confirmando a patência do vaso e avaliar perfusão de órgão. Recentemente, a microtomografia computadorizada (micro-CT) tem sido utilizada para estudar o sistema vascular de ratos e, da mesma forma, animais de porte. Ao contrário do osso, a imagem axial dos vasos sanguíneos pela tomografia computadorizada é limitada, como sangue intraluminal é inerentemente relativamente radiotransparente. Quando combinado com agentes de contraste intravascular, no entanto, o micro-CT permite reconstruções tridimensionais detalhadas de animais vasculatures para o estudo da patologia vascular anatômico macro¹¹.

O agente de contraste selecionado (consulte a Tabela de materiais) é uma borracha de silicone radiopaco que contém o cromato de chumbo e sulfato de chumbo. Em cima de perfusão na presença de um catalisador, que endurece rapidamente para formar um elenco de vasculatura com mínimas alterações na arquitetura macroanatômico dos vasos, fazendo com que a vasculatura altamente radiopaco em contraste com os tecidos de fundo quando examinou-se radiograficamente. Este agente de contraste é vantajoso porque é fácil de manusear e evita a degradação do tecido e perda de navio devido à quebra, frequentemente associada com corrosão elenco vascular. Como cura com encolhimento mínimo¹², embarcações de sangue permanecem patentes e permitam uma avaliação correcta da vasculatura-macro animal em experiências não-sobrevivência. Trabalhos anteriores tem utilizado com sucesso o contraste radiopaco do silicone de borracha em uma variedade de estudos com animais. Especificamente, foi mostrada aplicabilidade em Visualizar a coronária, glomerular, placentária e circulações cerebral^{11,12,13,14,15} . Neste trabalho, detalhamos a metodologia de punção ventricular esquerda aberta para a perfusão intravascular de borracha de silicone radiopaco à base de chumbo para caracterizar quantitativamente a patologia da aorta BAPN-induzido em um modelo do rato por micro-CT.

Protocol

Protocolos para manuseio de animal foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Maryland, Baltimore (número de animais protocolo 0116024) e institucionais Cuidado Animal e conduzidos de acordo com as normas internacionais de AAALAC.

1. preparação dos reagentes

1. Heparina
   1. Diluir 250 µ l de 1000 sulfato de heparina U/mL em 50 mL de fosfato tampão salino tornar-se uma concentração final de 5 U/mL.
   2. Aquecer o heparinizado (5 U/mL) tampão fosfato-salino, que irá substituir o sangue na vasculatura num banho de água situado a 37 ° C.
   3. Preparar a bomba de pressão controlada, conectando-se a tubagem necessária e 2 esvaziar seringas de 10 mL, 1 para o buffer de soro heparinizado e 1 para o agente de contraste.
   4. Encha o tubo com a solução salina tamponada de fosfato heparinizado morno e remover as bolhas de ar da tubulação da bomba de pressão.
2. Agente de contraste
   Nota: Consulte a Tabela de materiais para componentes do kit de agente de contraste.
   1. Misture um composto pigmentado com um diluente para alcançar uma tintura 1:6, a proporção de diluente.
   2. Imediatamente antes do uso (etapa 2.3.12), adicione 200 µ l de um agente de cura para cada alíquota de 5 mL do composto pigmentado diluído e misture-os bem (4% em volume).
      Nota: O fabricante informou que o tempo de trabalho é de 40 min. Como o agente de contraste de borracha de silicone começa a polimerizar 20 min após a adição do agente de cura, é importante preparar a solução imediatamente antes de sua infusão.
3. Água potável BAPN
   1. Β-aminopropionitrile (BAPN), dissolva em água potável para criar uma concentração final de 3 g/L (adaptado de protocolos anteriormente descritos na literatura)^9,16,17.
   2. Administrar a água potável que contêm BAPN a um grupo de ratos, uma vez que eles são 4 semanas de idade até o tempo de perfusão para micro-CT.

2. ato cirúrgico

1. Preparação de animais
   1. Desmamar os ratos em 3 semanas de idade, mantê-las em um ciclo 12 h luz/12 h escuro e alimentá-los comer roedor padrão. Para o grupo BAPN-tratada, administre preparados na hora BAPN potável água para 16-26 semanas ad libitum. Fornece que os animais de controle com padrão bebendo água ad libitum.
2. Técnica anestésica
   Nota: 24 h antes da análise do CT, o procedimento a seguir é executada. Procedimentos cirúrgicos são promulgados para preparar a amostra para uma post-mortem perfusão intracardíaca.
   1. Induzi uma anestesia através de um tanque de indução, com 100% O₂ e 3% de isoflurano entregadas via um vaporizador de precisão. Após a indução da anestesia, descontinuar o isoflurano e lave a câmara com O₂. Manter a anestesia com 2-2,5% de isoflurano e 1 L/min de O₂ através de um cone de nariz.
   2. Anexe tanto a câmara de indução e a máscara para um limpador de carvão para a adsorção do gás waste para proteger o pessoal. Certifique-se de um plano anestésico adequado, demonstrando que não há resposta a estímulos nocivos (pitada de dedo do pé).
   3. Prepare um campo operatório consiste em uma bandeja cirúrgica e os instrumentos cirúrgicos necessários.
   4. Transferir o animal para o campo cirúrgico e posicioná-lo em prostração dorsal.
3. Técnica operatória
   1. Usando a tesoura, faça uma incisão através da pele e tecidos moles da meio caminho entre a sínfise púbica para o entalhe do esterno, estendendo-se através da pele e tecidos moles sobrejacentes esterno.
   2. Usando a tesoura, crie um buraco no diafragma no processo xifoide para entrar na cavidade torácica.
   3. Use a tesoura para dissecar o diafragma da parede ventral do tórax, bilateralmente.
   4. Corte as cartilagens costais para separar as costelas do esterno na fronteira bem esternal.
   5. Aplicar uma fina pinça hemostática à ponta do esterno (perto do processo xifoide) e mover a pinça hemostática cranialmente para que ele seja posicionado na cabeça do rato. Isto fará com que retorne o Timo e o esterno, longe do coração, expondo o coração e grandes vasos para outra manipulação.
   6. Agudamente disse os anexos entre o coração e a parede torácica.
   7. Conectar a 27-IV cateter agulha de uma seringa pre-loaded com 10 mL de soro fisiológico heparinizado tamponado de fosfato (5 U/mL) e preencher todos os tubos com o buffer para remover as bolhas de ar dos tubos da bomba de pressão.
   8. Tenha cuidado ao preparar o fluido como bolhas na linha de líquido pode impedir o enchimento de embarcações menores. Limite o número de navios que são danificados durante a preparação de animais, como isso fará com que o agente de contraste vazar fora os vasos cortados, alterando o volume necessário para um enchimento completo e introdução de artefatos para a imagem final.
   9. Punção no ventrículo esquerdo com uma agulha de calibre 27 que é estabilizada com uma pinça de ângulo reto. Imediatamente faça uma incisão no ventrículo direito ou a veia cava inferior para drenar a solução de heparina e sangue.
      Nota: A heparina é usada como anticoagulante para impedir que o sangue nos vasos de coagulação após a morte do animal.
   10. Perfundir o animal a uma taxa constante de 2 mL por minuto usando uma bomba de seringa único. Observe o branqueamento visível dos órgãos. Continue a perfusão até o perfusato drenagem de circulação venosa está livre de sangue (cerca de 5-6 mL). Pare a bomba.
   11. Desconecte o tubo de cateter IV a seringa de 10 mL, tomando cuidado para não perturbar a posição da agulha no ventrículo esquerdo.
   12. Imediatamente após a sangria completa, separar a solução de agente de contraste em alíquotas de 5 mL e adicionar o agente de cura neste momento (consulte a etapa 1.2). Misture-os bem. Elaborar-se 5 mL da mistura de agente de contraste em uma seringa de 10 mL e perfundir o animal com ele.
   13. Para um enchimento completo dos vasos (artérias e veias), continue a infusão passou do ponto, quando pode ser visto saindo a solução venosa. Procure por sinais de uma bem sucedida perfusão, incluindo a visualização de um agente de elenco nas artérias coronárias, artérias pulmonares, intestino e fígada vasculatura.
   14. O agente de contraste vai curar após aproximadamente 20 min à temperatura ambiente. Após a cura, colher os órgãos individuais, conforme necessário e corrigi-los em formol tamponado a 10% neutro. Corrigi carcaças inteiras se as amostras não são usadas para o micro-CT varredura no dia seguinte. Se as carcaças forem usadas no dia subsequente, posicione-os em uma bandeja de metal e coloque-os em um refrigerador a 4 ° C, para curar durante a noite.

3. micro-CT varredura e parâmetros

Nota: Os parâmetros de aquisição de imagem específica será dependentes da máquina em uso.

1. Adquira imagens de tomografia computadorizada de radiografia computadorizada de cada rato no dia seguinte a perfusão usando um scanner de micro-CT usando uma tensão de tubo de raio x de 55 kVp, uma corrente de 150 mA, um fator de ampliação do sistema de 2.19 e CCD câmera pixel binning factor 2. Isso resulta em um tamanho de pixel eficaz de 29 µm.
   1. Coloque a carcaça do mouse em decúbito dorsal sobre a mesa do micro-CT scanner e obter um olheiro verificação de raio-x.
   2. O detector de campo de visão de 57,4 mm (axial) x 37,1 mm (transaxial) focar o torso para a imagem de toda a extensão da aorta.
   3. Adquira 180 projeções de imagem com um incremento de rotação de 2 graus e uma vez por projeção de 2800 ms.
2. Reconstruir as imagens usando um algoritmo de Fernandez modificado; o tamanho de voxel reconstruído é 29 x 29 x 29 µm³ (fatia espessura = 29 µm) usando a visualização 3D Multimodal plug-in para o software usado aqui.

4. pós-processamento e transformação

1. Converta os dados de CT para um formato DICOM usando o software apropriado.
2. Analise as imagens para identificar se um aneurisma estava presente. Medir o diâmetro do eixo menor no ponto mais largo do arco aórtico, aorta torácica, a descer e aorta abdominal como descrito anteriormente¹⁸ (Figura 1).
   Nota: Em nosso estudo, imagens foram analisadas por dois observadores independentes (um cego) utilizando um visualizador DICOM para identificar se um aneurisma estava presente. O diâmetro do eixo menor foi medido no ponto mais largo do arco aórtico, descendente de aorta torácica e aorta abdominal como descrito anteriormente¹⁹ (Figura 1). Quer dizer não-aneurismática segmentos arteriais de ratos BAPN-tratada estabeleceram diâmetros navio normal, servindo como os valores de controle de idade correspondente.
3. Os aneurismas são definidos como uma dilatação localizada ou difusa dos segmentos da aorta para diâmetros superiores a 50% do diâmetro da referência. Localize estas com base nas medidas acima.

Results

Para avaliar este protocolo, 20 ratos adultos masculinos, de fundo misto como descrito anteriormente,¹⁹ e 20-30 semanas de idade, com ou sem tratamento de BAPN, foram pintados com uma borracha de silicone radiopaco à base de chumbo (veja a tabela de materiais ) usando o protocolo detalhado acima. Eles foram submetidos a micro-CT varredura no dia seguinte (Figura 1 e Figura 2

Discussion

Imagem de micro-CT pode ser usada para fornecer reconstruções altamente detalhadas e tridimensionais de patologia vascular em modelos animais. Através da utilização de meios de contraste aprimorado intravasculares, tecidos moles não-avançado, tais como o lúmen de um vaso sanguíneo, podem ser diferenciados daqueles que estão aumentando. Enquanto o laser Doppler, microangiography, ressonância magnética, angiografia, histologia com microscopia confocal, ou dois fotões pode ser utilizada para avaliar leitos vasculares, eles ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	Usamos amarelo, uma cor diferente pode ser encomendada conforme desejado. O kit inclui composto MV, diluente MV e agente de cura MV.
Heparina (1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
Solução salina tamponada com fosfato	Corning	21-031-CV
Isoflurano	Vet One, MWI	502017
3-Aminopropionitrile fumarato sal	Sigma-Aldrich	A3134
Bomba de seringa única	Fisher Scientific	14-831-200
27-gauge agulha de conjunto de veias do couro cabeludo	Exel Int	26709	27G x 3/4", tubo de 12"
Inveon Micro-CT scanner	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		Versão 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		Versão 4.2
Roedor Chow	Harlan Teklad	2018sx