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A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

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DOI:

10.3791/57592

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22 de maio de 2018

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

Resumo

Β-amiloide (Aβ) é um peptídeo hidrofóbico com uma tendência intrínseca de auto-montagem em agregados. Entre vários agregados, oligómero Aβ é amplamente aceita como a neurotoxina principal no progresso da doença de Alzheimer (AD) e é considerado o evento crucial na patogênese da AD. Portanto, inibidores de oligómero Aβ podem impedir a neurodegeneração e têm o potencial para ser desenvolvido como doença-modificando tratamentos de AD. No entanto, protocolos de formação diferente do oligómero Aβ podem levar a oligômeros com características diferentes. Além disso, não existem muitos métodos para efetivamente tela Aβ1-42 oligómero inibidores. Um anticorpo A11 pode reagir com um subconjunto de tóxico oligómero de1-42 de Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Neste protocolo, descrevemos como preparar uma amostra de oligómero ricos A11-positivo Aβ1-42 de um sintético Aβ1-42 peptídeo em vitro e avaliar quantidades relativas de oligómero de1-42 Aβ A11-positivo em amostras por uma mancha do ponto análise usando A11 e Aβ1-42-anticorpos específicos 6E10. Usando este protocolo, inibidores de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo podem também projectados de semi-quantitativa de resultados experimentais.

Introdução

A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais importantes que afetam as pessoas idosas no mundo1. É amplamente aceito que a agregação anormal de β-amiloide (Aβ) pode ser o principal factor patológico do anúncio. Aβ agregados são os principais componentes das placas senis, dentre os marcadores biológicos nos cérebros de pacientes. Além disso, agregados Aβ, nomeadamente oligómeros, produzem neurotoxicidade potente, que pode ser a causa da morte neuronal no decorrer AD. Portanto, a inibição da formação de oligómero Aβ pode impedir a neurodegeneração e inibidores Aβ oligómero poderiam ser desenvolvidos como doença-modificando tratamentos de AD. Muitos estudos têm usado um peptídeo sintético de Aβ para formar oligômeros em vitro, explorar morfologias e estruturas de oligômeros Aβ artificiais e investigar os inibidores do oligómero Aβ usando em vitro modelos2,3 , 4. no entanto, diferentes em vitro protocolos de formação do oligómero Aβ podem levar a oligómero com diferentes características morfológicas, o que pode causar os resultados incomparáveis entre grupos de pesquisa diferentes. Portanto, um protocolo de formação standard para oligómero Aβ é urgentemente necessária.

Até agora, não há muitos métodos têm sido relatados para detectar diretamente oligómeros Aβ. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), não-desnaturação electroforese do gel, ensaio imunoenzimático (ELISA) e ponto de análise a mancha podem ser usados para examinar a quantidade e/ou morfologia de Aβ oligómero 5, 6. por exemplo, a morfologia e estrutura do oligómero Aβ podem ser observados na temperatura. Os montantes relativos e tamanho molecular de agregações de Aβ poderiam ser medidos pela electroforese do gel não-desnaturação. ELISA poderia ser usada para determinar oligómero Aβ em soro, plasma e excertos do tecido cerebral. Por último, ponto de análise, uma técnica utilizada para a detecção, a mancha analisando e identificando as proteínas, poderia ser usado para avaliar a concentração relativa de oligómero Aβ nas diferentes amostras com a ajuda do oligómero-Aβ específicas e de anticorpos. Além disso, um ponto do ensaio de mancha oferece economia de tempo significativo, como a electroforese do gel e os mancha procedimentos para géis não são necessários. Portanto, este ensaio é normalmente usada para tela potenciais Aβ oligómero inibidores da. O objetivo geral do presente protocolo é para descrever um método relativamente simples, confiável e reprodutível para preparar uma amostra da rica oligómero Aβ1-42 , para analisar as quantidades de oligómero Aβ1-42 por ponto de análise a mancha e para oligómero Aβ tela usando os resultados experimentais semi-quantitativa de inibidores.

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Protocolo

1. preparação da solução

Nota: Consulte a Tabela de materiais para fontes de reagente.

  1. Prepare uma solução de 5% albumina de soro bovino (BSA) pela adição de 5 g de BSA para 100 mL de água bidestilada. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
  2. Prepare uma solução de A11 de anticorpo antioligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo para 10 mL da solução de 5% de BSA. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
  3. Prepare uma solução de 6E10 de anticorpo anti-Aβ (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo a 10 mL de solução a 5% BSA. Misturá-los completamente vortexing. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
  4. Prepare uma solução OC de anticorpo anti-fibrillar oligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo a 10 mL de solução a 5% BSA. Misturá-los completamente vortexing. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
  5. Prepare uma tampão Tris (TBS) estoque solução salina adicionando 24 g de base Tris e 88 g de NaCl a 1.000 mL de água bidestilada. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução a 4 ° C por até 3 meses.
  6. Prepare uma solução de Tween-20 (TBST) e salino Tris, adicionando 1 mL de Tween-20 a 100 mL de TBS estoque água bidestilada solução e 900 mL.
  7. Prepare uma solução de anticorpo secundário adicionando 10 µ l do horseradish peroxidase (HRP) cabra anti-IgG de coelho (H + L) para 10 mL de solução TBST. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
  8. Dissolva 3,68 g da curcumina em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) para formar uma solução stock de curcumina de 10 mM.
  9. Dissolva 5 mg de sintético Aβ1-42 em 2 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para formar uma solução de monômero Aβ 2,5 mg/mL. Coloque-o em temperatura ambiente (25 ° C) para alíquotas de 20 min. faça 100 µ l e armazenar a-20 ° C por até 6 meses.
    Nota: Este procedimento deve ser executado mais rápido possível. As pontas de pipeta devem ser cortadas para garantir a pipetagem precisos.
  10. Prepare eletroquimioluminescência (ECL) fluido misturando ECL fluida-A e B com uma relação de volume de 1:1. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da utilização.

2. preparação da amostra

Nota: Execute a preparação da amostra 2 dias antes do ponto de análise a mancha.

  1. Adicionar 900 μL de água bidestilada para um tubo de solução de monômero Aβ1-42 ; a concentração de Aβ1-42 será 0,25 mg/mL. Coloque a mistura em temperatura ambiente por 20 min.
  2. Evapore a solução com gás nitrogênio de alta pureza, até que seu volume é de cerca de 850 µ l. A concentração da solução de1-42 de Aβ será sobre 0,29 mg/mL.
    Nota: A solução deve ser agitada de vez em quando para garantir que o HFIP é totalmente evaporado. Normalmente, após 30 min de evaporação, o volume da solução residual é de cerca de 850 µ l.
  3. Dilua a solução-mãe de curcumina para uma solução de trabalho de curcumina (0,2 e 2 µM) com água bidestilada. Misture a solução1-42de Aβ e curcumina solução com uma relação de 1:1 do volume de trabalho. As concentrações finais de curcumina será 0,1 e 1 µM.
    Nota: Potenciais inibidores oligómero podem ser misturados com a solução de1-42 de Aβ em qualquer proporção, se necessário.
  4. Agitar a solução continuamente em um agitador magnético (ver Tabela de materiais).
    1. Conserte uma caixa de plástico divisor para o agitador magnético. 2 lugar magnético agitar bares nos 2 cantos da caixa e coloque os tubos de amostra no centro da caixa.
    2. Agite a caixa à temperatura ambiente (25 ° C) por 48 h.
      Nota: A velocidade do agitador magnético é em torno de 60 rpm.
  5. Centrifuga os tubos por 15 min a 4 ° C e 18.000 x g. recolher o sobrenadante.

3. análise de mancha dot

Nota: Incubação do todo é executadas num agitador horizontal.

  1. Corte a membrana de nitrocelulose em tiras de largura de 1 cm.
    Nota: A largura da membrana de nitrocelulose pode ser ajustada de acordo com necessidades experimentais.
  2. Coloca as amostras de 2 µ l uniformemente sobre 2 tiras (tira 1 e 2) com cada intervalo ponto a 0,5 cm.
  3. Coloque as tiras em temperatura ambiente por 5 min até a gota na banda é seca.
  4. Incube as tiras com uma solução de BSA de 5% durante 30 min à temperatura ambiente.
  5. Enxague as tiras com uma solução TBST por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Aspire a solução TBST. Por 1h à temperatura ambiente, incubar a tira 1 com um anticorpo antioligómero A11 solução e tira 2 com uma solução de 6E10 de anticorpo anti-Aβ.
  7. Enxague as tiras com uma solução TBST três vezes, cada vez por 5 min à temperatura ambiente.
  8. Aspire a solução TBST. Incube as tiras com uma solução de anticorpo secundário por 40 min à temperatura ambiente.
  9. Enxague as tiras com uma solução TBST três vezes, cada vez por 5 min à temperatura ambiente.
  10. Aplica uniformemente o fluido ECL misto na superfície das tiras. Expor as tiras em uma quimioluminescência automática, sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: Normalmente, 300 µ l de fluido ECL é suficiente para uma membrana. A membrana deve ser mantida úmida durante a exposição. O tempo de exposição é calculado automaticamente pelo sistema da imagem latente.
  11. Fazer uma análise de tons de cinza usando o ImageJ (National Institutes of Health) ou outro software de processamento de imagem para obter resultados semi-quantitativa.

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Resultados

Para investigar se um monômero de1-42 de Aβ pode formar um oligómero de1-42 de Aβ após preparação, utilizou-se análise de temperatura. Não agregados visíveis foram observados na amostra de monômero de1-42 de Aβ HFIP-dissolvido (Figura 1A). Além disso, principalmente globulares agregados com um diâmetro de ao redor 10-80 nm foram observados na amostra1-42 Aβ após 48 h de tremer, sugerindo que Aβ...

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Discussão

Neste protocolo, registramos um método para preparar amostras contendo oligómero Aβ1-42 e analisar as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo por um ponto de análise a mancha. Embora nossos métodos para a preparação de amostras de ricos oligómero Aβ1-42 são bastante simples, confiáveis e reprodutíveis, existem ainda alguns pontos para ser notado. Em primeiro lugar, HFIP é usado para dissolver o péptido sintético de1-42 de Aβ. Um peptídeo de1-42 de Aβ agreg...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (U1503223, 81673407, 21475131), o projeto de pesquisa aplicada na tecnologia sem fins lucrativos de Zhejiang província (2016C 37110), Ningbo Internacional de ciência e tecnologia Projecto de cooperação (2014D 10019), a equipe de inovação Municipal de Ningbo da ciência da vida e saúde (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech projeto riqueza comum 2017C 50042, Li Dak soma Yip Chin Yio Kenneth Li Marine biofarmacêutica fundo de desenvolvimento, e o fundo de K. C. Wong Magna na Universidade de Ningbo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A11 (ab126892 Rb pAb para Oligômeros Amilóides)AbcamGR91739-58
6E10 (beta-Amilóide Rabbit Ab)Célula  Tecnologia de Sinalização2454S
OC (Anti-Fibrilas Amilóides OC Anticorpo)MilliporeAB2286
Marcador de Peroxidase de Rábano (HRP) IgG anti coelho de cabra (H+L) BeyotimeA0208
Aβ 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladdinI1523078
CurcuminaSigmaC1386
Albumina Bovina VSolarbioA8020
Cloreto de sódioSangon BiotechD920BA0003
Dodecil sulfato de sódioSCR 30166428
TRISSolarbioT8060
GlicinaSolarbioG8200
  Dimetil sulfóxido SolarbioD8370
5× gel não desnaturante PAGE Marcador de ProteínaBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Membrana de Nitrocelulose PuraPall CorporationT50189
MetanolSCR10014118
EtanolSCR10009218
Super faixa baixa  Marcador de proteínaSolarbioPR1300
Membranas de transferênciaImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Solução de coloração rápidaBeyotimeP0017
Tudo - sistema automático de imagem por quimioluminescênciaTanonTanon 5200
Imagem JNational Institutos de Saúde
Software de processamento de imagemAdobePhotoshop CS6
Agitador magnéticoXangai Huxi

Referências

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
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  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
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