A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Resumo

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

Resumo

Β-amiloide (Aβ) é um peptídeo hidrofóbico com uma tendência intrínseca de auto-montagem em agregados. Entre vários agregados, oligómero Aβ é amplamente aceita como a neurotoxina principal no progresso da doença de Alzheimer (AD) e é considerado o evento crucial na patogênese da AD. Portanto, inibidores de oligómero Aβ podem impedir a neurodegeneração e têm o potencial para ser desenvolvido como doença-modificando tratamentos de AD. No entanto, protocolos de formação diferente do oligómero Aβ podem levar a oligômeros com características diferentes. Além disso, não existem muitos métodos para efetivamente tela Aβ_1-42 oligómero inibidores. Um anticorpo A11 pode reagir com um subconjunto de tóxico oligómero de_1-42 de Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Neste protocolo, descrevemos como preparar uma amostra de oligómero ricos A11-positivo Aβ_1-42 de um sintético Aβ_1-42 peptídeo em vitro e avaliar quantidades relativas de oligómero de_1-42 Aβ A11-positivo em amostras por uma mancha do ponto análise usando A11 e Aβ_1-42-anticorpos específicos 6E10. Usando este protocolo, inibidores de oligómero de_1-42 de Aβ A11-positivo podem também projectados de semi-quantitativa de resultados experimentais.

Introdução

A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais importantes que afetam as pessoas idosas no mundo¹. É amplamente aceito que a agregação anormal de β-amiloide (Aβ) pode ser o principal factor patológico do anúncio. Aβ agregados são os principais componentes das placas senis, dentre os marcadores biológicos nos cérebros de pacientes. Além disso, agregados Aβ, nomeadamente oligómeros, produzem neurotoxicidade potente, que pode ser a causa da morte neuronal no decorrer AD. Portanto, a inibição da formação de oligómero Aβ pode impedir a neurodegeneração e inibidores Aβ oligómero poderiam ser desenvolvidos como doença-modificando....

Protocolo

1. preparação da solução

Nota: Consulte a Tabela de materiais para fontes de reagente.

1. Prepare uma solução de 5% albumina de soro bovino (BSA) pela adição de 5 g de BSA para 100 mL de água bidestilada. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
2. Prepare uma solução de A11 de anticorpo antioligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo para 10 mL da solução de 5% de BSA. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.
3. Prepare uma solução de 6E10 de anticorpo anti-Aβ (1:1, 000), adicionando 10 µ l de s....

Resultados

Para investigar se um monômero de_1-42 de Aβ pode formar um oligómero de_1-42 de Aβ após preparação, utilizou-se análise de temperatura. Não agregados visíveis foram observados na amostra de monômero de_1-42 de Aβ HFIP-dissolvido (Figura 1A). Além disso, principalmente globulares agregados com um diâmetro de ao redor 10-80 nm foram observados na amostra_1-42 Aβ após 48 h de tremer, sugerindo que Aβ_.......

Discussão

Neste protocolo, registramos um método para preparar amostras contendo oligómero Aβ_1-42 e analisar as quantidades de oligómero de_1-42 de Aβ A11-positivo por um ponto de análise a mancha. Embora nossos métodos para a preparação de amostras de ricos oligómero Aβ_1-42 são bastante simples, confiáveis e reprodutíveis, existem ainda alguns pontos para ser notado. Em primeiro lugar, HFIP é usado para dissolver o péptido sintético de_1-42 de Aβ. Um peptídeo de_1-42 de Aβ agreg.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A11 (ab126892 Rb pAb para Oligômeros Amilóides)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amilóide Rabbit Ab)	Célula  Tecnologia de Sinalização	2454S
OC (Anti-Fibrilas Amilóides OC Anticorpo)	Millipore	AB2286
Marcador de Peroxidase de Rábano (HRP) IgG anti coelho de cabra (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ 1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumina	Sigma	C1386
Albumina Bovina V	Solarbio	A8020
Cloreto de sódio	Sangon Biotech	D920BA0003
Dodecil sulfato de sódio		SCR 30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glicina	Solarbio	G8200
Dimetil sulfóxido Solarbio		D8370
5× gel não desnaturante PAGE Marcador de Proteína	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Membrana de Nitrocelulose Pura	Pall Corporation	T50189
Metanol	SCR	10014118
Etanol	SCR	10009218
Super faixa baixa  Marcador de proteína	Solarbio	PR1300
Membranas de transferência	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Solução de coloração rápida	Beyotime	P0017
Tudo - sistema automático de imagem por quimioluminescência	Tanon	Tanon 5200
Imagem J	National Institutos de Saúde
Software de processamento de imagem	Adobe	Photoshop CS6
Agitador magnético	Xangai Huxi