Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Zemfira N. Karamysheva; Elena B. Tikhonova; Petar N. Grozdanov; James C. Huffman; Kristen R. Baca; Alexander Karamyshev; R. Brian Denison; Clinton C. MacDonald; Kai Zhang; Andrey L. Karamyshev

doi:10.3791/57600

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Artigo de método

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

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DOI:

10.3791/57600

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8 de abril de 2018

Zemfira N. Karamysheva² , Elena B. Tikhonova¹ , Petar N. Grozdanov¹ , James C. Huffman²^,³ , Kristen R. Baca¹^,³ , Alexander Karamyshev¹ , R. Brian Denison¹ , Clinton C. MacDonald¹ , Kai Zhang² , Andrey L. Karamyshev¹

¹Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, ²Department of Biological Sciences, Texas Tech University, ³CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

Neste artigo

Resumo

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Resumo

Expressão de proteínas adequada na hora certa e na quantidade certa é a base da função celular normal e sobrevivência em um ambiente de rápida mudança. Por um longo tempo, os estudos de expressão do gene foram dominados pela pesquisa sobre o nível transcricional. No entanto, os níveis de estado estacionário de mRNAs não se correlacionam bem com a produção de proteína, e a Traduzibilidade dos mRNAs próprios varia muito dependendo das condições. Em alguns organismos, como o parasita Leishmania, a expressão da proteína é regulada principalmente no nível de translação. Estudos recentes demonstraram que essa proteína tradução hipotalâmica é associada com câncer, metabólica, neurodegenerativas e outras doenças humanas. Polysome de criação de perfil é um poderoso método para estudar o Regulamento de tradução da proteína. Permite medir o status translacional de mRNAs individuais ou examinar tradução na escala do genoma. A base desta técnica é a separação de polissomos, ribossomos, suas subunidades e mRNAs gratuito durante a centrifugação de uma citoplasmática lisados através de um gradiente de sacarose. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes - parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Células de Leishmania crescem livremente em suspensão e culturas de células humanas crescem em monocamada aderente, enquanto o testículo de rato representa uma amostra de tecido animal. Assim, a técnica é adaptada a todas estas fontes. O protocolo para a análise das frações polysomal inclui detecção de níveis de mRNA individuais por RT-qPCR, proteínas por Western blot e análise de RNAs ribossomal por eletroforese. O método pode ser novamente prorrogado por exame de mRNAs associação com o ribossoma num nível transcriptoma por RNA-seq profunda e análise de proteínas associadas Ribossoma por espectroscopia de massa das frações. O método pode ser facilmente ajustado para outros modelos biológicos.

Introdução

Regulação da expressão gênica em células é controlada por mecanismos transcriptional, posttranscriptional e pós-traducional. Avanços no sequenciamento de RNA profundo permitam o estudo dos níveis de mRNA de estado estacionário no genoma escala em um nível sem precedentes. No entanto, descobertas recentes revelaram que nível de mRNA de estado estacionário não sempre se correlaciona com a produção de proteína¹^,². O destino de uma transcrição individual é muito complexo e depende de muitos fatores, como estímulos internos/externos, stress, etc. Regulação da expressão gênica durante a síntese de proteína ....