Artigo de método

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

DOI:

10.3791/57601

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21 de junho de 2018

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1Molecular Genetics of Chronic Inflammation and Allergic Disease, Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Paediatrics, University of Melbourne, 4Centre for Social and Early Emotional Development, Faculty of Health, Deakin University, 5Department of Paediatrics, University of Western Australia

Neste artigo

Resumo

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Identificação de variantes genéticas contribuindo para doenças humanas complexas nos permite identificar novos mecanismos. Aqui, vamos demonstrar uma abordagem de genotipagem multiplex de genes candidatos ou análise de percurso de gene que maximiza a cobertura de baixo custo e é passível de estudos de coorte-baseado.

Resumo

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Doenças complexas são muitas vezes sustentadas por múltiplas variantes genéticas comuns que contribuem para a suscetibilidade a doenças. Aqui, descrevemos uma abordagem de polimorfismo (SNP) de nucleotídeo único marca econômica usando um ensaio de genotipagem multiplexado com espectrometria de massa, para investigar associações de caminho do gene em coortes clínicas. Vamos investigar o locus de candidato de alergia alimentar Interleukin13 (IL13) como um exemplo. Este método eficiente maximiza a cobertura, tirando proveito do desequilíbrio de ligação partilhada (LD) dentro de uma região. Selecionado LD SNPs então destinam-se em um ensaio multiplexado, permitindo até 40 SNPs diferentes a serem analisados simultaneamente, aumentando a rentabilidade. Reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para amplificar os loci de alvo, seguido pela extensão de nucleotídeo único, e os amplicons são então medidos usando a laser assistida por matriz dessorção/ionização-tempo flight(MALDI-TOF) espectrometria de massa. A saída bruta é analisada com o genótipo de chamar o software, usando as definições de controle de qualidade estritas e cortes, e genótipos de alta probabilidade são determinados e saídos para análise de dados.

Introdução

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Em doenças humanas complexas, variantes genéticas contribuem para a suscetibilidade a doenças e quantificar essas variantes pode ser úteis para a patogênese da compreensão, identificação de grupos de pacientes de alto risco e tratamento respondentes. Na verdade, a promessa da medicina de precisão é dependente utilizando Informação Genômica para identificar subgrupos de pacientes1. Infelizmente, dentro do espaço de biologia doença complexa, onde os fenótipos de doença são sustentados por heterogeneidade genética substancial, baixa penetrância e expressividade variável, coorte tamanho requisitos para abordagens de todo o genoma identificar romanc....

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Protocolo

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O material genético utilizado neste documento eticamente foi aprovado para uso pelo escritório para crianças HREC (humano pesquisa Comitê de ética) (CDF/07/492), o departamento de HREC serviços humanos (10/07) e Hospital (RCH das crianças Royal) HREC (27047).

1. projetar o ensaio multiplexado

  1. Prepare uma lista SNP para design de ensaio.
    1. Entrada da região de destino para a função de marcador de Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Use o LD (correlação, r2) entre SNPs, abrangendo a região de destino para gerar uma lista de SNPs, que fornece uma cobertura completa da região desejada com o....

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Resultados

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Com o protocolo descrito acima, nós genótipo marca SNPs em todo o gene imune Th2 IL13 em uma coorte de alimentos alergia casos e controles9. Nós aplicamos análise de regressão logística, ajustado pela ascendência e outras covariáveis potenciais testar se as variantes genéticas dentro da região de interesse aumentaram o risco de alergias alimentares. Tabela 10 9 mostra que uma variante rs1295686 está associado com al.......

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Discussão

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Aqui, demonstramos o método de genotipagem multiplexada utilizando espectrometria de massa. Os resultados representativos foram gerados usando PCR emparelhado com espectrometria de massa4 com química de ensaio listados na Tabela de materiais13MALDI-TOF. Com esta plataforma, geramos um total de 11.295 genótipos em 1.255 indivíduos para 9 SNPs dentro 40 h no laboratório.

Podemos ilustrar a utilidade da técnica em atender hipóteses .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores têm sem agradecimentos.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DNA genômico --1 μ L a uma concentração de 5-10 ng/μ L
Primers: amplificação direta e reversa e extensãoIDT-consulte a seção 1.2.1 do manuscrito sobre design de primers
Água deionizada Por exemplo, água Milli-Q -deionizado com 18,2 MΩ. kit
de reagentes para genotipagem de resistividade cm. Conjunto de reagentes químicos iPLEX GoldAgena Bioscience#10148-2inclui todos os reagentes para reações em 2.2.1, 2.3.1 e 2.4.2, placas PCR de chip e resina
(384 poços)Abgene#ABGAB-1384Para o sistema MassARRAY, as placas da Abgene são compatíveis
com Micropipetasde um e 8 canais
Centrífugacompatível com placas de 384 poços
Termocicladorcompatível com programas de PCR conforme detalhado em 2.2.4, 2.3.2 e 2.4.3
Placa de resina DimpleAgena Bioscience6mg, 384-well
Rotador de Placa 
Analisador MassARRAY 4 SistemaAgena BiosciencesMALDI-TOF (dessorção/ionização a laser assistida por matriz – tempo de voo) Espectrômetro de Massa.
RS1000 NanodispensadorAgena Biosciences
Assay Design SuiteAgena BiosciencesFerramenta usada para projetar os ensaios de genotipagem
multiplex Hot Start TaqDNA polymerase enzyme 
Resina Agena BiosciencesFornecido com kit iPLEX

Referências

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  1. Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
  2. Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction....

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