Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata

Resumo

O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.

Resumo

Bactérias benéficas associadas a planta é um papel importante na promoção do crescimento e prevenção de doenças em plantas. A aplicação (PGPR) rizobactérias promotoras de crescimento da planta como agentes de biofertilizantes ou biocontrole tornou-se uma alternativa eficaz para o uso de fertilizantes convencionais e pode aumentar a produtividade das culturas a baixo custo. Interações planta-micróbio dependem de sinais de planta-secretada de acolhimento e uma reação diante de suas bactérias associadas. No entanto, os mecanismos moleculares de bactérias benéficas como respondem a seus associados de origem vegetal os sinais não são totalmente compreendidos. Avaliar a resposta de transcriptomic de bactérias exsudados de raiz é uma poderosa abordagem para determinar a expressão de gene bacteriano e regulamento sob condições rizosférico. Tal conhecimento é necessário compreender os mecanismos subjacentes envolvidos em interações planta-micróbio. Este artigo descreve um protocolo detalhado para estudar a resposta de transcriptomic de b. mycoides EC18, uma cepa isolada do endosphere a batata, exsudados de raiz de batata. Com a ajuda da recente tecnologia de sequenciamento de alta produtividade, este protocolo pode ser executado em várias semanas e produzem enormes conjuntos de dados. Primeiro, nós coletamos os exsudados de raiz em condições estéreis, após o qual eles são adicionados à b. mycoides culturas. O RNA destas culturas é isolado, usando um método de fenol/clorofórmio, combinado com um kit comercial e submetido a um controlo de qualidade por um instrumento automatizado de electroforese. Após o sequenciamento, análise de dados é executada com o pipeline de T-REx baseado na web e um grupo de genes diferencialmente expressos é identificado. Este método é uma ferramenta útil para facilitar novas descobertas sobre os genes de bactérias envolvidas em interações planta-micróbio.

Introdução

As plantas podem exsudato até 20% do carbono fixado durante a fotossíntese através de raízes para a rizosfera¹, ou seja, a zona estreita de solo perto das raízes. Devido à maior disponibilidade de nutrientes, a rizosfera é um habitat adequado para diversos microorganismos, incluindo bactérias promotoras de crescimento vegetal. Os exsudados de raiz contêm uma variedade de compostos inorgânicos como íons, ácidos inorgânicos, oxigênio e água. No entanto, a maioria dos exsudados da raiz é formada por materiais orgânicos, que podem ser divididos em compostos de baixo peso molecular e alto peso molecular de compostos. Os compostos de baixo p....

Protocolo

1. germinação de batata em condições esterilizadas

1. Enxague a superfície de batata com água estéril. Banhar-se a batata em etanol a 70% e, depois, em 3% de hipoclorito de sódio, por 5 min cada. Enxágue novamente com água esterilizada para remover qualquer restante hipoclorito de sódio.
2. Preparar os materiais necessários para a germinação e crescimento de tubérculos de batata; esterilizar os potes plásticos, cestas de enxertia, vermiculita e regar em autoclave a 121 ° C por 20 min.
   Nota: Certifique-se que todos os materiais utilizados são autoclaváveis. Caso contrário, use outros métodos de esterilização.
3. Colocar a batata superfície-ester....

Resultados

Microorganismos associados a planta podem influenciar positivamente crescimento das plantas e a saúde. No entanto, os mecanismos das complexas interações entre plantas e seus simbiontes microbianos não são totalmente compreendidos. Exsudados de raiz desempenham um papel importante na regulação da atividade rhizobacterial e comportamento, e geralmente postula-se que a colonização microbiana de raízes se inicia com a atração de micróbios exsudados de raiz. O objetivo deste trabalho foi inve.......

Discussão

Interações planta-micróbio tem sido a hipótese de ser determinado por um equilíbrio afinado entre bactérias e plantas. Tais interações são altamente complexas e difíceis de estudar em um sistema natural, que é composto por diversas espécies microbianas, potencialmente atuando como consórcios. Este artigo descreve um protocolo simplificado para estudar a resposta bacteriana exsudados de raiz em condições bem controladas. O perfil do transcriptoma de rizobactérias, após a exposição exsudados de raiz, fornece informações de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
hipoclorito de sódio	Sigma	CAS: 7681-52-9;	10-15%  cloro ativo
Aquecedor de caldo
	New Brunswick Scientific	Innova 4000
espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
vidro de nitrogênio
	Sigma	G8893	0.5 µ m
Tubo de 2,0 ml com tampa			Isento de RNase
1,5 ml e 2,0 ml Tubo			Homogeneizador de moinho de esferas sem RNase
	Centrífuga de Mini_beadbeater BioSpec	607
Eppendorf	5430
Dietilpirocarbonato (DEPC)	sigma	CAS: 1609-47-8
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)	sigma	CAS: 151-21-3	Solução a 10% preparada com água MQ tratada com DEPC
Tampão			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
fenol	Sigma		RNA grau
clorofórmio-isoamílico álcool			preparar 24:1 de clorofórmio: álcool isoamílico, armazenar em temperatura ambiente Kit de
isolamento de RNA de alta pureza		Roche 11828665001
	Invitrogen	AM9780	RNase-Zap
Instrumento de eletroforese automatizado	Agilent	2100	Bioanalyzer
Espectrofotômetro de microvolume	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop ND-1000
	Agilent	RNA 6000 Nano kit
Inibidor de RNase	Thermo Fisher Scientific	RiboLock
Biblioteca de RNA Direcional Kit de preparação	NEB	Ultra	para Illumina

Luria-Bertani (LB) contas de líquido de rosca eppendorf TE Solução de descontaminação de RNase Kit de análise de qualidade de RNA