O objetivo do protocolo aqui apresentado é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado de Bacillus mycoides exsudados de raiz de batata. Este método facilita a identificação de genes de bactérias importantes envolvidos em interações planta-micróbio e em princípio aplicável a outros fungos endofíticos e plantas, com pequenos ajustes.
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Artigo de método
Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bactérias benéficas associadas a planta é um papel importante na promoção do crescimento e prevenção de doenças em plantas. A aplicação (PGPR) rizobactérias promotoras de crescimento da planta como agentes de biofertilizantes ou biocontrole tornou-se uma alternativa eficaz para o uso de fertilizantes convencionais e pode aumentar a produtividade das culturas a baixo custo. Interações planta-micróbio dependem de sinais de planta-secretada de acolhimento e uma reação diante de suas bactérias associadas. No entanto, os mecanismos moleculares de bactérias benéficas como respondem a seus associados de origem vegetal os sinais não são totalmente compreendidos. Avaliar a resposta de transcriptomic de bactérias exsudados de raiz é uma poderosa abordagem para determinar a expressão de gene bacteriano e regulamento sob condições rizosférico. Tal conhecimento é necessário compreender os mecanismos subjacentes envolvidos em interações planta-micróbio. Este artigo descreve um protocolo detalhado para estudar a resposta de transcriptomic de b. mycoides EC18, uma cepa isolada do endosphere a batata, exsudados de raiz de batata. Com a ajuda da recente tecnologia de sequenciamento de alta produtividade, este protocolo pode ser executado em várias semanas e produzem enormes conjuntos de dados. Primeiro, nós coletamos os exsudados de raiz em condições estéreis, após o qual eles são adicionados à b. mycoides culturas. O RNA destas culturas é isolado, usando um método de fenol/clorofórmio, combinado com um kit comercial e submetido a um controlo de qualidade por um instrumento automatizado de electroforese. Após o sequenciamento, análise de dados é executada com o pipeline de T-REx baseado na web e um grupo de genes diferencialmente expressos é identificado. Este método é uma ferramenta útil para facilitar novas descobertas sobre os genes de bactérias envolvidas em interações planta-micróbio.
Introdução
As plantas podem exsudato até 20% do carbono fixado durante a fotossíntese através de raízes para a rizosfera1, ou seja, a zona estreita de solo perto das raízes. Devido à maior disponibilidade de nutrientes, a rizosfera é um habitat adequado para diversos microorganismos, incluindo bactérias promotoras de crescimento vegetal. Os exsudados de raiz contêm uma variedade de compostos inorgânicos como íons, ácidos inorgânicos, oxigênio e água. No entanto, a maioria dos exsudados da raiz é formada por materiais orgânicos, que podem ser divididos em compostos de baixo peso molecular e alto peso molecular de compostos. Os compostos de baixo peso molecular incluem aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares, compostos fenólicos, ácidos graxos e uma matriz de metabólitos secundários. Os compostos de alto peso molecular consistem de mucilagem e proteínas de2,3. Microrganismos da rizosfera podem usar alguns destes compostos como fonte de energia para o crescimento e desenvolvimento. Os exsudados de raiz desempenham um papel importante na formação da comunidade de rhizobacterial, desde que os compostos vegetais produzidos no exsudado podem influenciar o comportamento das bactérias associadas a rizosfera afetando a expressão de genes específicos.
Compreender a resposta bacteriana exsudados de raiz é um passo fundamental em decifrar os mecanismos de interação planta-micróbio. Como a resposta bacteriana às interações planta-micróbio é o produto da expressão gênica diferencial, podem ser estudado pela análise do transcriptoma. Usando esse método, estudos anteriores identificaram vários importantes genes envolvidos em interações planta-micróbio. Em Pseudomonas aeruginosa, genes envolvidos no metabolismo, quimiotaxia e tipo de secreção II foram mostrados para responder a de exsudados de raiz de beterraba4. Ventilador et al. 5 estudou o perfil transcriptomic de b. amyloliquefaciens FZB42 em resposta exsudados de raiz de milho. Seus resultados mostram que, dos genes fortemente induzidos por exsudados da raiz, vários grupos estão envolvidos em vias metabólicas relacionadas com a utilização de nutrientes, quimiotaxia, motilidade e não-ribossomais síntese de peptídeos antimicrobianos e policetídeos.
A precisão desses estudos baseia-se na coleção de exsudados radiculares. Embora vários métodos descreveu a coleção de exsudados radiculares para finalidades diferentes, eles exigem instrumentos sofisticados ou não são executados em condições bem controladas6,7,8. Além disso, microrganismos inibindo a rizosfera podem influenciar a composição do exsudado de raiz, afetando a permeabilidade de membrana da célula de planta e danificar os tecidos da raiz, particularmente no caso dos consórcios de microorganismos9. Ao investigar a resposta microbiana exsudados de raiz, é importante usar bem definidas condições para evitar a alteração dos compostos por outros microorganismos10. Além disso, o RNA de alta qualidade é necessária para RNA-seq baseados em estudos de transcriptoma. No entanto, quando se lida com as estirpes não-modelo-bacteriana, os protocolos padrão ou jogos comerciais geralmente têm uma baixa eficiência devido a fatores desconhecidos ou propriedades especiais de crescimento.
O protocolo descrito aqui foi verificado usando b. mycoides, que é uma bactéria Gram-positiva, formadoras de esporos do filo Firmicute. É onipresente na rizosfera de várias espécies de plantas. Várias propriedades promover crescimento de planta têm sido relatadas para esta espécie, incluindo indução de resistência sistemática (ISR) na beterraba açucareira11, inibição do umedecimento-fora agente patogénico Pythium para pepino12, bem como nitrogênio fixação na rizosfera girassol13. No entanto, os mecanismos moleculares de sua interação com a planta hospedeira não são bem estudados.
O objetivo dos experimentos apresentados aqui é estudar a resposta de transcriptomic de endosphere-isolado b. mycoides exsudados de raiz de batata. Em suma, o protocolo consiste das seguintes etapas: primeiro, recolher exsudados de raiz de batata em condições estéreis. Em seguida, extrai o RNA de alta qualidade de células bacterianas tratadas com exsudados de raiz. A etapa final é a análise de dados usando o web-based T-REx gasoduto14. Este protocolo foi usado para identificar genes de b. mycoides que mostram uma mudança nos níveis de expressão em caso de contacto com exsudados de raiz e, portanto, podem desempenhar um papel importante nas interações planta-micróbio.
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Protocolo
1. germinação de batata em condições esterilizadas
- Enxague a superfície de batata com água estéril. Banhar-se a batata em etanol a 70% e, depois, em 3% de hipoclorito de sódio, por 5 min cada. Enxágue novamente com água esterilizada para remover qualquer restante hipoclorito de sódio.
- Preparar os materiais necessários para a germinação e crescimento de tubérculos de batata; esterilizar os potes plásticos, cestas de enxertia, vermiculita e regar em autoclave a 121 ° C por 20 min.
Nota: Certifique-se que todos os materiais utilizados são autoclaváveis. Caso contrário, use outros métodos de esterilização. - Colocar a batata superfície-esterilizados para o cesto de enxertia e colocar isso em um pote esterilizado contendo vermiculita úmida.
- Manter o pote em uma câmara climática a 24 ° C durante três semanas. Defini-lo em ciclos de 16 h de luz (120 µmol m-2s-1) e 8 h de escuridão. Para evitar contaminações microbianas, use uma caixa de fibra de vidro grande para cobrir o pote.
2. recolha de exsudados de raiz de batata
- Quando o broto de brotos, transferência a cesta com a batata inteira para um copo esterilizado preenchido com 150 mL de água destilada esterilizada, com a batata tubérculos colocados logo acima da superfície da água e as raízes submersas na água (ver Figura 1). Manter as mudas em câmara climática e usar as mesmas configurações como antes [24 ° C; ciclos de 16 h de luz (120 µmol m-2s-1), 8 h das trevas].
- A partir do segundo dia, recolher a água que contém o exsudado e volte a encher o copo com água desionizada estéril. Executar a amostragem todos os dias até o sétimo dia após a transferência o seedling.
- Armazenar cada amostra separadamente a 4 ° C. Para cada amostra, espalhar 100 µ l em um Luria-Bertani (LB; triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 0,5% NaCl) placa de ágar para verificar se há contaminação microbiana. Descarte as amostras contaminadas.
- Combinar as amostras coletadas de um seedling e concentrá-las por liofilização-los a-40 ° C, até um volume final de 150 mL.
3. cultivo de bactérias
- Marcam uma estirpe b. mycoides de um estoque de glicerol-80 ° C em uma placa de ágar LB e incubar a placa a 30 ° C durante a noite.
- Inocular um meio líquido de LB com uma única colônia da placa e crescer a cultura numa incubadora agitando a 200 rpm durante a noite a 30 ° C.
4. tratamento e recolha de amostras de bactérias
- Para comparar a curva de crescimento das bactérias tratadas com exsudados de raiz para um controlo negativo, prepare uma série de frascos contendo 50 mL de meio líquido LB. Adicionar 0,5 mL de cultura bacteriana durante a noite para todos os frascos e adicionar 0%, 5%, 10%, ou 15% (v/v) exsudado de raiz ou deionizada estéril para o meio, respectivamente.
- Use uma cultura com água desionizada, em vez de exsudados de raiz como um controle. Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) cada 1 h depois. Gera uma curva de crescimento plotando os valores de600 OD versus tempo.
Nota: Nós vimos que 10% dos exsudados da raiz não afetou o crescimento de b. mycoides (ver Figura 2); Esta proporção foi usada para experimentos de RNA-seq. - Diluir uma cultura de b. mycoides durante a noite com 90 mL de LB médio pré-aquecido e o OD inicial600 de ~ 0,05 num frasco de 300 mL. Adicionar 10 mL de exsudados de raiz para a cultura e incube a 30 ° C, durante 1 h.
- Use um tratamento de água desionizada estéril 10 mL como um controle. Coletar células de cultura de centrifugação a 9.000 x g por 2 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e imediatamente congelar a pelota em nitrogênio líquido, em seguida, guarde-a-80 ° C até o uso.
5. isolamento de RNA
Nota: Antes de iniciar o isolamento, prepare a bancada, cremalheiras e pipetas, limpá-las com uma solução de descontaminação de RNase (ver Tabela de materiais). Usando luvas de todos os tempos e certifique-se de todos os tubos, dicas e soluções são livre de RNase. Mantenha sempre as amostras no gelo quando possível.
- Adicionar 0,1% (v/v) de pyrocarbonate de dietilo (DEPC) para água ultrapura (100 µ l de DEPC por 100 mL de solução), misture bem e mantê-lo à temperatura ambiente durante a noite. Autoclave a mistura para inactivar o DEPC após o tratamento durante a noite. Use esta água ultrapura DEPC tratada para preparar o buffer TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] e uma solução de SDS (p/v) de 10%.
- Descongelar as pelotas de célula no gelo e suspender cada um em 400 µ l de tampão TE (DEPC). Transferi as suspensões para tubos de tampa de rosca de 2 mL.
- Premix 300 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1 v/v) e 300 µ l de fenol (ácido fenol, grau de RNA) e deixe a mistura repousar durante 5 min. Tome 500 µ l da fase orgânica superior para adicionar às células ressuspensa. Em seguida, adicione 50 µ l de SDS 10% e 0,5 g de grânulos de vidro (0,5 µm) no tubo.
- Feche a tampa firmemente e coloque o tubo em um homogeneizador de grânulo-moinho (ver Tabela de materiais). Execute uma homogeneização de pulso 3 × 45 s com um intervalo de 1 min no gelo.
- Centrifugar as amostras por 10 min a 11.000 x g (4 ° C) e transferir a fase superior para um novo tubo.
- Adicionar 500 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1) para a fase superior da etapa 5.5 e centrifugar a mistura por 5 min a 11.000 x g (4 ° C).
Nota: As etapas a seguir foram modificadas desde as instruções do fabricante de um isolamento de RNA baseado em filtro comercial vidro fibra kit (veja a Tabela de materiais). - Transferir 500 µ l da fase superior para um novo tubo, adicione 2 volumes (1 mL) de um tampão de Lise/vinculação e misture pipetando para cima e para baixo.
- Combinar os tubos do filtro e coleção (do kit de isolamento de RNA) e pipetar a mistura da etapa 5.7 no tubo do filtro. Centrifugar os tubos por 15 s em 8.000 x g e descarte o escoamento.
- Prepare-se 1,5 mL microcentrifuge tubos com 100 µ l de tampão de DNase, 10 µ l de DNase I e 5 µ l de um inibidor de RNase (ver Tabela de materiais). Adicione a mistura de solução preparada no filtro do tubo do filtro e incube-lo por 20-30 min em 15-25 ° C.
- Execute as etapas de lavagem de acordo com as instruções do fabricante. Use 50 µ l de um tampão de eluição para Eluir o RNA.
- Salve o RNA eluted a-80 ° C e coloque um filme plástico parafina em torno dele. Ao mesmo tempo, transferi alguns microlitros de amostra para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para executar uma verificação de qualidade.
6. sequenciamento e a verificação da qualidade do RNA
- Verifique o RNA com um espectrofotômetro microvolume.
Nota: Rácios de absorvância no 260/280 devem estar acima de 1.8 e rácios no 260/230 deve ultrapassar pelo menos 1.8, de preferência acima de 2.0. - Executar o RNA purificado em um instrumento de eletroforese automatizada utilizando a análise de RNA recomendo kit (veja a Tabela de materiais); o número de integridade do RNA (RIN) deve ser pelo menos acima de 7 para prosseguir.
- Usar um montante total de 3 µ g de RNA por amostra para gerar bibliotecas com uma preparação de biblioteca de RNA-Seq kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as recomendações do fabricante.
Nota: Os preparativos da biblioteca foram sequenciados em uma plataforma de sequenciamento de alta produtividade e leituras emparelhado-final foram geradas.
7. dados análise usando o T-REx Pipeline baseado na Web
- Realizar uma filtragem de qualidade usando o FASTX-kit de ferramentas versão 0.0.13 (PQV escores de qualidade de > 20). Apare as leituras de RNA-Seq crus de sequências de adaptador com a ferramenta Trimmomatic.
Nota: Todas as análises a jusante foram baseadas em dados limpos com alta qualidade. - Baixar o banco de dados do genoma de ATCC 6462 NCBI b. mycoides (adesão NCBI n º: CP009692.1) e usá-lo como um genoma de referência para mapear o lê limpo usando Bowtie2/2.2.3.
- V0.6.1 de HTSeq de uso para contar o número de leituras mapeados para cada gene e as leituras por quilobase de transcrição por leituras mapeadas milhões (RPKM) de cada gene baseiam no comprimento do gene e leituras Conde mapeado para este gene.
- Para a análise dos dados pelo pipeline T-REx, use a tabela RPKM como entrada, bem como três arquivos descritivos: (i) um arquivo de fatores para descrever a experiência em fatores, (ii) um arquivo de contrastes para definir quais fatores serão comparados para expressão gênica diferencial e (iii) um arquivo de classe para descrever grupos de genes de interesse.
Nota: Os arquivos descritivos são formato de in.txt. Exemplos podem ser encontrados na página Web do T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Uma instrução detalhada para análise de dados usando o T-REx pode ser encontrada em uma publicação anterior por de Jong et al 14.
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Resultados
Microorganismos associados a planta podem influenciar positivamente crescimento das plantas e a saúde. No entanto, os mecanismos das complexas interações entre plantas e seus simbiontes microbianos não são totalmente compreendidos. Exsudados de raiz desempenham um papel importante na regulação da atividade rhizobacterial e comportamento, e geralmente postula-se que a colonização microbiana de raízes se inicia com a atração de micróbios exsudados de raiz. O objetivo deste trabalho foi inve...
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Discussão
Interações planta-micróbio tem sido a hipótese de ser determinado por um equilíbrio afinado entre bactérias e plantas. Tais interações são altamente complexas e difíceis de estudar em um sistema natural, que é composto por diversas espécies microbianas, potencialmente atuando como consórcios. Este artigo descreve um protocolo simplificado para estudar a resposta bacteriana exsudados de raiz em condições bem controladas. O perfil do transcriptoma de rizobactérias, após a exposição exsudados de raiz, fornece informações de...
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos Jakob Viel seus comentários úteis e sugestões. Agradecemos também a Anne de Jong por sua ajuda na análise bioinformática. Yanglei Yi e Zhibo Li são suportados pelo Conselho de bolsa da China (CSC). Agradecemos a NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pelo apoio financeiro ao OPK.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| hipoclorito de sódio | Sigma | CAS: 7681-52-9; | 10-15% cloro ativo |
| Aquecedor de caldo | |||
| New Brunswick Scientific | Innova 4000 | ||
| espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| vidro de nitrogênio | |||
| Sigma | G8893 | 0.5 µ m | |
| Tubo de 2,0 ml com tampa | Isento de RNase | ||
| 1,5 ml e 2,0 ml Tubo | Homogeneizador de moinho de esferas sem RNase | ||
| Centrífuga de Mini_beadbeater BioSpec | 607 | ||
| Eppendorf | 5430 | ||
| Dietilpirocarbonato (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | Solução a 10% preparada com água MQ tratada com DEPC |
| Tampão | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| fenol | Sigma | RNA grau | |
| clorofórmio-isoamílico álcool | preparar 24:1 de clorofórmio: álcool isoamílico, armazenar em temperatura ambiente Kit de | ||
| isolamento de RNA de alta pureza | Roche 11828665001 | ||
| Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap | |
| Instrumento de eletroforese automatizado | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Espectrofotômetro de microvolume | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| Agilent | RNA 6000 Nano kit | ||
| Inibidor de RNase | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Biblioteca de RNA Direcional Kit de preparação | NEB | Ultra | para Illumina |
Referências
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Reimpressões e permissões
