Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Resumo

Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.

Resumo

A galinha embrionária é comumente usada como um organismo modelo confiável para o desenvolvimento de vertebrados. Sua acessibilidade e incubação curta período é ideal para a experimentação. Atualmente, o estudo destas vias do desenvolvimento do embrião de galinha é realizado através da aplicação de inibidores e drogas em locais localizados e em baixas concentrações, usando uma variedade de métodos. Em vitro tecido cultivo é uma técnica que permite o estudo dos tecidos separados do organismo hospedeiro, enquanto ao mesmo tempo ignorando muitas das limitações físicas presentes ao trabalhar com embriões inteiro, tais como a susceptibilidade de embriões para altas doses de substâncias químicas potencialmente letais. Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para cultivo a galinha embrionários meia cabeça em vitro, que apresenta novas oportunidades para o exame de processos de desenvolvimento, além dos métodos actualmente estabelecidos.

Introdução

A galinha embrionária (Gallus gallus) é um organismo de excelente modelo comumente usado no campo da biologia. Seu período de incubação é de aproximadamente 21 dias e muitos ovos podem ser incubados simultaneamente, tornando a experimentação rápida e eficiente. Talvez mais importante, o embrião é também facilmente manipulado, permitindo o estudo extensivo de processos-chave do desenvolvimento e dos genes e proteínas que impulsionam estes processos.

O olho embrionárias de galinha é um órgão complexo que se desenvolve através da interação de um número de diferentes tecidos semelhantes a muitos outros sistemas do corpo. Esse método permite que o estudo do desenvolvimento desses tecidos, particularmente em estágios avançados de desenvolvimento. Por exemplo, a retina multi-camadas pode ser de particular interesse para os que estudam o desenvolvimento do sistema nervoso. Métodos alternativos que permitem o estudo de outros tecidos oculares, tais como a córnea, o corpo de vitreal, a lente, a esclera e as pálpebras são de benefício para os investigadores. O olho embrionárias de galinha também contém uma série de ossos chatos, os ossículos scleral, que podem ser usados como um modelo para o estudo da indução óssea intramembranosa e ossificação em vertebrados¹.

Atualmente, existem vários métodos utilizados para estudar o desenvolvimento embrionário. Microinjeções de inibitórios anticorpos ou outras moléculas inibidoras^2,3, cirurgicamente microbeads embebido em inibidor⁴e eletroporação⁵ são todos os métodos que podem ser usados para downregulate genes ou proteínas de interesse em um embrião. Métodos similares são usados para upregulate proteínas. Esses métodos não são sem suas limitações. Por exemplo, ao usar produtos químicos para alterar o desenvolvimento embrionário, os efeitos letais sobre o embrião devem ser avaliados, e isso limita o uso dos métodos acima mencionados para sites localizados de aplicação em doses baixas o suficiente para garantir a sobrevivência da embrião.

In vitro , tecido cultivo tem sido utilizado em uma ampla gama de organismos, para estudar o desenvolvimento e pode ser usado para contornar algumas das limitações acima mencionadas. Por exemplo, os fêmures⁶, pena botões^7,8e membros⁹ do frango todos foram estudadas usando tecido cultivo métodos, como têm os testículos de rato¹⁰ e as raízes e caules de plantas¹¹. Esses métodos concedem cientistas um alto grau de controle sobre o desenvolvimento de tecidos, tais como a capacidade de variar a temperatura e alterar a disponibilidade de nutrientes. O isolamento do tecido do embrião inteiro também torna muito menos suscetíveis aos efeitos letais de produtos químicos, permitindo estudos de manipulação em escala global em altas concentrações. Outra vantagem notável em vitro cultivo é a preservação do ambiente celular do tecido; o arranjo dos tecidos permanece relativamente inalterado, tornando possível estudar as interações entre diferentes tecidos tipos⁹. Assim, em vitro abre portas adicionais experimental de cultivo se aproxima não disponível nos modelos no vivo ou no ovo .

Atualmente, estudar o desenvolvimento do olho embrionárias de galinha usando produtos químicos é particularmente desafiadora. Um número de membranas extraembryonic cobre o embrião, tornando difícil aplicar microbeads ou produtos químicos; o embrião também é muito ativo dentro do ovo, como ele fica mais velho, complicando ainda mais um método já difícil. Este protocolo permite acesso fácil para os olhos e seus tecidos circundantes, eliminando as barreiras, proporcionando também novas oportunidades para examinar os processos de desenvolvimento dentro do olho. Este protocolo foi criado para estudar a indução de scleral ossículos dentro do olho embrionário.

Protocolo

Nota: Para estágios do embrião, utilizam o Hamburger e Hamilton¹² (HH) tabela de preparo.

1. o embrião incubação

1. Incube os ovos fertilizados de galinha numa incubadora estéril, controlo de temperatura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade.
2. Vire os ovos 1 x por dia e permitir que incube ao HH34 (fertilização pós de 8 dias).

2. preparação e esterilização dos materiais

1. Para 12 embriões, autoclave 2 L de água destilada, 1 L de solução salina de garota de 0,85%, 12 pipetas de vidro, 1 caixa de tecido de papel, 24 2,5 x 2,5 cm quadrados de papel de filtro semi porosa e praças 24 2,5 x 2,5 cm de fio de aço de malha com as bordas curvadas para baixo. Para esterilizar os materiais, autoclave-los a 121 ° C durante pelo menos 15 minutos.
   Nota: A esterilização dos materiais pode ser feita com antecedência.
2. Esterilize a incubadora com etanol 70% limpando os lados, prateleiras e porta. Coloque 2 recipientes plásticos contendo autoclavado destilaram água dentro da incubadora para manter a umidade. Escaldar a incubadora de cultura a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade. Certifique-se da que incubadora está completamente escura; se a porta for transparente, cubra com papel alumínio.
3. Escaldar a 100 mL de meio nutritivo e 1 mL de penicilina, colocando-os na incubadora de cultura.
4. Cobrir a área de trabalho com uma toalha de papel e esterilizar o banco por pulverização com etanol a 70%. Esterilize 2 pares de pinças, tesouras de dissecação, uma lâmina de barbear e uma colher de plástico com etanol a 70% de forma semelhante.
5. Pratos de Petri estéril 100mm lugar 12 e 24 pratos de Petri estéril 35mm no banco para uso. Certifique-se de que pratos permanecem num saco estéril até o uso.

3. embrião preparação

Nota: A partir deste momento, use uma máscara de protecção contra o pó para evitar a contaminação das culturas. Uma infecção bacteriana ou fúngica vai estragar a cultura... e há um risco de se espalhar rapidamente a todas as culturas na incubadora.

1. Crack abrir o ovo e transferir o embrião para um prato de Petri de 100mm contém solução salina 0,85% garota. Estágio o embrião de acordo com as características anatômicas descritas no Hamburger e Hamilton encenando orientações¹² e confirmar o embrião está no HH34.
2. Cortar o pescoço e depois dividem a cabeça do embrião na linha usando uma lâmina de barbear esterilizada. Usando a pinça estéril, remova o cérebro. Deixe o bico intacto.

4. cultura Setup

1. 2 lugar dos pratos de Petri 35mm dentro de um prato de Petri de 100 mm.
2. Coloca uma malha de arame de aço no interior de cada prato de Petri de 35 mm.
3. Usando fórceps, transferi 1 das cabeças bisseccionadas para um pedaço de papel de filtro semi porosas de 2,5 x 2,5 cm com o olho virado para cima. Certifique-se o tecido é seguro e não escorregar inclinando-o ligeiramente.
4. Usando a pinça, coloque cuidadosamente o tecido do olho e o papel de filtro em cima da malha de arame de aço em 1 dos pratos Petri 35mm, criando um palco Erguido com o tecido do olho em cima.
5. Repita as etapas de 4.3 e 4.4, com a outra metade de cabeça.
6. Utilizando uma pipeta de vidro estéril, cuidadosamente adicione meio nutritivo diretamente em cada placa de Petri 35mm até atingir o nível do filtro de papel. Não mergulhe a cabeça meia no meio de nutrientes.
7. Adicione 50 µ l de 10.000 U/mL de penicilina-estreptomicina no meio de nutrientes em cada placa de Petri.
8. Dobre um pedaço de papel de seda em um pequeno quadrado e coloque-a dentro do prato de Petri de 100mm. Umedecê-la com água destilada esterilizada.
9. Coloque o prato de cultura dentro da incubadora estéril, escura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade por até 4 dias.
10. Repita as etapas 3 e 4 para cada embrião.
    Nota: O número de embriões necessários dependerá da experiência específica; aqui, descrevemos o protocolo para 12 embriões.

5. cultura manutenção

1. Uma vez por dia, encha os recipientes de plástico na incubadora com água destilada esterilizada.
2. Verifique diariamente todas as culturas para infecções bacterianas ou fúngicas. Culturas que têm desintegrou-se ou em que o meio mudou de cor estão infectadas. Descarte todas as culturas que estão infectadas.

6. fixação

1. Após o cultivo, remover todos os pratos da incubadora.
2. Usando um par de pinças, remova suavemente o olho do papel de filtro, tomando cuidado para não rasgar o tecido.
3. Reparar o tecido do olho em paraformaldeído 4% em 1x tampão fosfato salino durante a noite a 4 ° C ou em formol a 10% neutro de buffer durante a noite em temperatura ambiente.
4. Armazene o tecido a 4 ° C em 1 x fosfato salino.

Resultados

Usando esse método, olho embrionárias de galinha pode ser cultivado desde o dia 8 do seu desenvolvimento (HH34) em vitro por 4 dias. Quatro dias de desenvolvimento no ovo corresponde ao HH38.

Este método de cultivo apoia o desenvolvimento de brotos de pena em torno do olho e nas pálpebras (figura 1B). Estes botões de penas não estão presentes no ovo em HH34 antes do cultiv...

Discussão

Este protocolo faz uso de tecido estabelecido técnicas de cultivo para o crescimento de um olho galinha embrionário dia 8 (HH34) em vitro por 4 dias. Este método de cultivo a grade foi originalmente descrito por Trowell¹⁵. Nós aperfeiçoamos um protocolo de Pinto e do Hall 1991 estudo¹⁶ utilizando uma membrana semi porosa com a grade para estudar sinais indutivos entre camadas de tecido separada da galinha embrionários olho¹⁵. Usando esse mét...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri para cultura de células de 35 mm	Corning	353001	fácil de segurar, poliestireno, placas de
Petri de cultura de células não pirogênicas de 100 mm	353003 Corning		, poliestireno, tecido de papel não pirogênico
	Kimtech	34155	Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 por caixa
malha de arame	n/a	n/a	malha de arame de aço inoxidável (tamanho da grelha 0,7 mm)
pipetas de vidro descartáveis	VWR	14673-010	Vidro borossilicato descartável 5 3/4"
meio nutriente	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamina com vermelho de fenol (BGJB)
penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458	10000 unidades/mL de penicilina estreptomicina solução estabilizada
filtro papel	Whatman	1454 090	papel de filtro semi-poroso 90mm
ovos de galinha fertilizados	Dalhousie University Agricultural College	n / a	pode ser obtido a partir de fazendas locais
cloreto de sódio (NaCl)	EMD	SX0420-3	cristais de cloreto de sódio, grau de reagente
1 L garrafa de vidro	VWR	89000-240	1 L pirex garrafa de vidro autoclavável
etanol	Fisher Scientific	BP82011	70%
recipientes tupperware	n/a	n/a	comprados em loja e esterilizados com
lâminas de barbear descartáveis	VWR	55411-050	lâminas de barbear industriais de borda única (aço carbono cirúrgico)
colheres de plástico	n/a	n/a	compradas em loja e esterilizadas com
máscara de poeira	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldeído, grau reagente,
formalina cristalina tamponada neutra	Fisher Scientific	72210	10% neutro tamponado formalina
fosfato tamponado salina (PBS)	n/a	n/a	10X tampão fosfato salina pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)
15 ml tubos de falcão	VWR	21008-216	centrífuga pré-esterilizada
FST		n/a	pinça fina
para pintinhos salino	n/a	n/a	0,85% de NaCl
papel alumínio	n/a	n/a	de papel comprada em loja
	n/	a n/a	comprada em loja