Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.
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Artigo de método
Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha
Neste artigo
Resumo
Resumo
A galinha embrionária é comumente usada como um organismo modelo confiável para o desenvolvimento de vertebrados. Sua acessibilidade e incubação curta período é ideal para a experimentação. Atualmente, o estudo destas vias do desenvolvimento do embrião de galinha é realizado através da aplicação de inibidores e drogas em locais localizados e em baixas concentrações, usando uma variedade de métodos. Em vitro tecido cultivo é uma técnica que permite o estudo dos tecidos separados do organismo hospedeiro, enquanto ao mesmo tempo ignorando muitas das limitações físicas presentes ao trabalhar com embriões inteiro, tais como a susceptibilidade de embriões para altas doses de substâncias químicas potencialmente letais. Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para cultivo a galinha embrionários meia cabeça em vitro, que apresenta novas oportunidades para o exame de processos de desenvolvimento, além dos métodos actualmente estabelecidos.
Introdução
A galinha embrionária (Gallus gallus) é um organismo de excelente modelo comumente usado no campo da biologia. Seu período de incubação é de aproximadamente 21 dias e muitos ovos podem ser incubados simultaneamente, tornando a experimentação rápida e eficiente. Talvez mais importante, o embrião é também facilmente manipulado, permitindo o estudo extensivo de processos-chave do desenvolvimento e dos genes e proteínas que impulsionam estes processos.
O olho embrionárias de galinha é um órgão complexo que se desenvolve através da interação de um número de diferentes tecidos semelhantes a muitos outros sistemas do corpo. Esse ....
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Protocolo
Nota: Para estágios do embrião, utilizam o Hamburger e Hamilton12 (HH) tabela de preparo.
1. o embrião incubação
- Incube os ovos fertilizados de galinha numa incubadora estéril, controlo de temperatura em 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% de umidade.
- Vire os ovos 1 x por dia e permitir que incube ao HH34 (fertilização pós de 8 dias).
2. preparação e esterilização dos materiais
- Para 12 embriões, autoclave 2 L de água destilada, 1 L de solução salina de garota de 0,85%, 12 pipetas de vidro, 1 caixa de tecido de papel, 24 2,5 x 2,5 cm quadrados de papel de filtro semi ....
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Resultados
Usando esse método, olho embrionárias de galinha pode ser cultivado desde o dia 8 do seu desenvolvimento (HH34) em vitro por 4 dias. Quatro dias de desenvolvimento no ovo corresponde ao HH38.
Este método de cultivo apoia o desenvolvimento de brotos de pena em torno do olho e nas pálpebras (figura 1B). Estes botões de penas não estão presentes no ovo em HH34 antes do cultiv.......
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Discussão
Este protocolo faz uso de tecido estabelecido técnicas de cultivo para o crescimento de um olho galinha embrionário dia 8 (HH34) em vitro por 4 dias. Este método de cultivo a grade foi originalmente descrito por Trowell15. Nós aperfeiçoamos um protocolo de Pinto e do Hall 1991 estudo16 utilizando uma membrana semi porosa com a grade para estudar sinais indutivos entre camadas de tecido separada da galinha embrionários olho15. Usando esse mét.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer Gregory Haller (Mount Saint Vincent University), por seu trabalho preliminar no desenvolvimento do protocolo. Os autores também gostaria de agradecer a Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) por seus conhecimentos técnicos e assistência com a filmagem e produção da parte do áudio/visual do manuscrito. Daniel Andrews foi suportado pelo financiamento do MSVU e as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) através de um prêmio de pesquisa de estudante de graduação. Tamara A. Franz-Odendaal é suportada por um fundo de descoberta NSERC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri para cultura de células de 35 mm | Corning | 353001 | fácil de segurar, poliestireno, placas de |
| Petri de cultura de células não pirogênicas de 100 mm | 353003 Corning | , poliestireno, tecido de papel não pirogênico | |
| Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 por caixa | |
| malha de arame | n/a | n/a | malha de arame de aço inoxidável (tamanho da grelha 0,7 mm) |
| pipetas de vidro descartáveis | VWR | 14673-010 | Vidro borossilicato descartável 5 3/4" |
| meio nutriente | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamina com vermelho de fenol (BGJB) |
| penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 unidades/mL de penicilina estreptomicina solução estabilizada |
| filtro papel | Whatman | 1454 090 | papel de filtro semi-poroso 90mm |
| ovos de galinha fertilizados | Dalhousie University Agricultural College | n / a | pode ser obtido a partir de fazendas locais |
| cloreto de sódio (NaCl) | EMD | SX0420-3 | cristais de cloreto de sódio, grau de reagente |
| 1 L garrafa de vidro | VWR | 89000-240 | 1 L pirex garrafa de vidro autoclavável |
| etanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% |
| recipientes tupperware | n/a | n/a | comprados em loja e esterilizados com |
| lâminas de barbear descartáveis | VWR | 55411-050 | lâminas de barbear industriais de borda única (aço carbono cirúrgico) |
| colheres de plástico | n/a | n/a | compradas em loja e esterilizadas com |
| máscara de poeira | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldeído, grau reagente, |
| formalina cristalina tamponada neutra | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutro tamponado formalina |
| fosfato tamponado salina (PBS) | n/a | n/a | 10X tampão fosfato salina pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4) |
| 15 ml tubos de falcão | VWR | 21008-216 | centrífuga pré-esterilizada |
| FST | n/a | pinça fina | |
| para pintinhos salino | n/a | n/a | 0,85% de NaCl |
| papel alumínio | n/a | n/a | de papel comprada em loja |
| n/ | a n/a | comprada em loja |
Referências
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton
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Reimpressões e permissões
