Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.
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Artigo de método
Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.
Introdução
O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.
Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefin....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais utilizando animais foram realizados em estrita conformidade com os regulamentos franceses (Código Rural R214/87-R214/130) e em conformidade com as diretrizes éticas da Comunidade Económica Europeia (86/609/CEE) e a carta nacional francês sobre a ética da experimentação animal. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de ética de Charles Darwin e enviados para o Ministério da educação e pesquisa (aprovação 2015 061011367540). As instalações de animais IBPS é credenciada pelas autoridades francesas (A75-05-24).
1. preliminares considerações
Nota: Para evitar contaminações, ....
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Resultados
Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios
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Discussão
Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pilha de correspondênc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Alinhamento múltiplo para design de primer | |
| Ditiotreitol | VWR | 443852A | RT |
| Primers aleatórios | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT e PCR |
| RNasin Inibidores de ribonuclease | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Transcriptase reversa | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA polimerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / dessalinizado e diluído a 200 µ Tubos M | |
| , 0,5 mL, tampa plana | Série ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT e PCR |
| BT10 - 10 µ Ponta de Filtro L | Neptune Scientific | BT10 | RT e PCR |
| Série BT20 - 20 µ Ponta de Filtro L | Neptune Scientific | BT20 | RT e PCR |
| BT200 Series - 200 µ L Ponta de Filtro | Neptune Scientific | BT200 | RT e PCR |
| BT1000 Series - 1000 µ L Ponta de Filtro | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT e PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Brometo de Etídio | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Eletroforese em gel |
| agarose Tampão Tris-Borato-EDTA | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Eletroforese em gel de agarose |
| UltraPure | Life Technologies | 16500-500 | Eletroforese em gel de agarose |
| Φ X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Eletroforese em gel de agarose |
| EDA 290 | Kodak | Eletroforese em gel de agarose | |
| Eletroforese Fonte de alimentação EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Eletroforese em gel de agarose | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Modelo SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Eletroforese | |
| em gel de agarosePapel liso com aparência acetinada | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp solução interna |
| Hidróxido de potássio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp solução interna |
| Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N′, N′-ácido tetracético | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp solução interna |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp solução interna |
| D-gluconato de potássio | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp solução interna |
| Solução de cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp solução interna |
| 5500 Osmômetro de pressão de vapor | Wescor | Patch clamp solução interna | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Solução interna de patch clamp |
| Sacarose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Preparação de fatia |
| D-(+)-Glicose monohidratada | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Preparação de fatia |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Preparação de fatia |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Preparação de fatia |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Preparação de fatias |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Preparação de fatias |
| Solução de cloreto | de magnésio Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Preparação de fatias |
| Solução de cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Preparação de |
| Ácido quinurênico | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Preparação de fatias |
| Isoflurano | Piramal Healthcare UK | Preparação de fatias | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Preparação de fatias |
| Solução de peróxido de hidrogênio | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp limpeza de configuração |
| Parede fina Capilares de vidro com filamento | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Microscópio vertical | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70 / CE CCD B / W CÂMERA DE VÍDEO | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplificador | Patch Clamp da Molecular Devices | ||
| Digidata 1440 | Patch Clamp | Molecular Devices | |
| pCLAMP 10 pacote de software | Seringa Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series com Corpo Reto (Suporte) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Fosfato de sódio dibásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Revelação histoquímica |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Revelação histoquímica |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Revelação histoquímica |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Revelação histoquímica |
| Gelatina de pele | de peixe de água friaSigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Revelação histoquímica |
| Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado | ThermoFisher Scientific | S11223 | Revelação histoquímica |
| Placa de 24 poços | Greiner Bio-One | 662160 | Revelação histoquímica |
Referências
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
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Reimpressões e permissões
