Artigo de método

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 de junho de 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Resumo

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O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.

Introdução

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O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.

Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefinidos em células electrophysiologically identificadas5. A inclusão de um marcador neuronal em gravação pipeta mais permite a caracterização morfológica das células gravadas após a revelação histochemical6,7,8,9, 10. é uma técnica muito útil para a classificação dos tipos neuronais com base na análise multivariada de suas características fenotípicas5,9,10,11,12 ,13,14. Única célula multiplex RT-PCR é também adequado para a caracterização de células não-neuronais como astrócitos15,16,17e pode ser aplicado virtualmente a cada cérebro estrutura18, 19,20,21,22,23 e célula tipo, supondo que eles podem ser gravados em configuração de células inteiras.

Esta técnica é muito conveniente para a identificação das fontes de celulares e/ou alvos de transmissão sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,,27,28, especialmente quando os anticorpos específicos são escassos. Ele se baseia em gravações de remendo-braçadeira de células visualmente identificados29e assim também permite a segmentação de células em um ambiente celular específico8,15,16. Além disso desde a cytoarchitecture do tecido cerebral é preservada em fatias do cérebro, essa abordagem também permite que o estudo das relações anatômicas das células caracterizadas com elementos neuronais e não-neuronal7,8 , 18.

Uma vez que esta técnica é limitada pela quantidade de citoplasma colhida e pela eficiência do RT, a detecção de mRNA, expressado em número de cópia baixa pode ser difícil. Embora outras abordagens baseadas na tecnologia RNaseq permitem analisar a transcriptoma inteira de células únicas3,4,30,31, não necessariamente precisam de sequenciadores caros elevado-throughput disponível para todos os laboratórios. Desde que a técnica de RT-PCR multiplex única célula usa pontos de extremidade do PCR, exige somente thermocyclers amplamente disponível. Ele pode ser facilmente desenvolvido em laboratórios equipados com instalações eletrofisiológicas e não requer equipamento caro. Ele pode fornecer, dentro de um dia, uma análise qualitativa da expressão de um conjunto predefinido de genes. Assim, esta abordagem oferece um fácil acesso para a caracterização molecular das células individuais de forma rápida.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais utilizando animais foram realizados em estrita conformidade com os regulamentos franceses (Código Rural R214/87-R214/130) e em conformidade com as diretrizes éticas da Comunidade Económica Europeia (86/609/CEE) e a carta nacional francês sobre a ética da experimentação animal. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de ética de Charles Darwin e enviados para o Ministério da educação e pesquisa (aprovação 2015 061011367540). As instalações de animais IBPS é credenciada pelas autoridades francesas (A75-05-24).

1. preliminares considerações

Nota: Para evitar contaminações, de acordo com as seguintes recomendações antes de célula única empresa RT-PCR após remendo-braçadeira.

  1. Não use plasmídeos contendo genes de interesse em laboratório, como eles são uma fonte potencial de contaminação.
  2. Reserve uma bancada de laboratório, longe da sala de eletroforese de gel de preparar PCRs.
  3. Escreve um conjunto de pipetas e aerossol resistentes filtro dicas para manipular o DNA e RNA em concentrações inferiores a 1 ng / µ l. Nunca usá-los para analisar os produtos de PCR.
  4. Sempre use produtos livre de RNase e DNase e luvas.
  5. Use produtos químicos dedicados para a preparação de soluções de remendo-braçadeira interna. Nunca use uma espátula, mas prefiro pesando papel para pesar os pós.
  6. Use um eletrodo de pH dedicados e soluções padrão de pH, como eles podem ser uma fonte de contaminação (por exemplo, RNase).
  7. Capilares de vidro de borosilicato de loja; 20 dicas µ l longo, fino e flexível; uma micropipeta de 20 µ l; um expulsor caseiras (remendo-braçadeira pipeta titular ligado a uma seringa de 10 mL); 500 µ l da polimerase; 10 µ l dicas filtro resistente aerossol; e fina marcadores permanentes em uma caixa dedicada (Figura 1).

2. primer Design

Nota: Multiplex RT-PCR baseia-se em duas etapas de amplificação. Durante a primeira PCR, todos os genes de interesse co são amplificados pela mistura de todos os iniciadores de PCR. Para detectar confiavelmente transcrições de células únicas, é essencial para projetar primers PCR eficientes e seletivas. O uso de primers (internos) aninhadas para a segunda ronda do PCR melhora tanto a especificidade e a eficiência da amplificação.

  1. Recupere as sequências de mRNA com curadoria de genes de interesse em sequência de dados do NCBI referência32 , bem como aqueles de sua família relacionada (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Digite o nome dos genes e as espécies de interesse como uma consulta e clique na sequência relevante obtida.
    2. Para restringir a análise à sequência de codificação dos genes, clique em Enviar para (canto superior direito) e selecione codificação de sequências e FASTA Nucleotide como formato. Em seguida, clique em Criar arquivo e salvar a sequência FASTA usando uma extensão de arquivo ".nt".
  2. Use o MACAW software33 (construção de alinhamento múltiplo & Analysis Workbench) ou qualquer outro software de alinhamento múltiplo para determinar as regiões de homologia.
    1. Clique no arquivo | Novo projeto... e selecione o DNA como o tipo de sequência. Para importar as sequências do gene, selecione sequência | Sequência de importação... e carregar um arquivo de ".nt". Repita o procedimento para todas as sequências relacionadas.
    2. Clique e arraste todas as sequências na janela esquemático para selecionar as sequências inteiras.
    3. As regiões de homologia da pesquisa selecionando alinhamento | Busca de blocos... (CTRL + S). Selecione o par de segmento se sobrepõem no Método de pesquisa. Ajustar o Pairwise marcar limite para um valor relativamente elevado (por exemplo, 1.000) e o min. seqs. por bloco , o número total de sequências para alinhar e clique em começar.
    4. Na janela de Resultado da pesquisa aparece, selecione o resultado (s) com a maior pontuação-MP e clique no Link. Se nenhum resultado for encontrado, diminua a Pairwise marcar o corte e/ou o min. seqs. por bloco.
    5. Para facilitar a visualização de regiões homólogas, selecione alinhamento | Sombreamento | Quer dizer a pontuação.
    6. Selecionar partes desvinculadas das sequências e repita os passos 2.2.3–2.2.4 para potencialmente determinar outras regiões de homologia com uma MP-pontuação mais baixa.
    7. Para obter os primers mais específicos, selecione as regiões com a homologia de sequência a menos.
  3. Buscar as sequências de todas as variantes da tala e repita etapas 2.2.1–2.2.6. Selecione suas regiões comuns para uma deteção global. Considere a alternativas cassettes para tala dedicado variantes análises20,34,35,36.
  4. Alinhe as sequências de mRNA no genoma de modelo animal usando genomas de37 explosão (básica Local Alignment Search Tool) para determinar a estrutura intron-exon dos genes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Selecione o genoma do rato explosão clicando no rato e carregar a sequência FASTA obtida na seção Digite a sequência de consulta . Na Seleção do programa, selecione otimizar para sequências altamente similares (Megarajada)e, em seguida, clique no botão de explosão .
    2. Na seção de descrições , selecione o alinhamento com a identidade mais alto (até 100%). Certifique-se de que ele corresponde ao gene de interesse conforme indicado nas características da seção de alinhamentos .
    3. Classificar o alinhamento por consulta posição inicial na mesma seção para obter a sucessão de exões da sequência de codificação. Observe as posições inicial e final de todos os hits que correspondem aproximadamente à posição dos intrões na sequência de consulta (Figura 2A).
  5. Selecione dois exões diferentes para os sentido e antisentido primers para diferenciar facilmente do cDNA de amplificação de DNA (gDNA) genômica com base num critério de tamanho (Figura 2).
    Nota: A amplificação de gDNA pode ocorrer com pouca frequência quando o núcleo é colhido com o citoplasma. Assim, é essencial para projetar intrão overspanning pares da primeira demão (Figura 2A). No caso de genes intrão-menos, a coleção do núcleo é problemática, pois pode levar à confusão potencialmente os resultados. Para resolver esse problema, incluem um conjunto de primers vista amplificar uma sequência intrônicas para investigar a presença de gDNA25. Se o controle de genômico é positivo, os resultados para todos intrão-menos genes devem ser rejeitados.
  6. Para conseguir uma amplificação eficiente, selecione as primeiras demão gerando amplicons com um comprimento ideal compreendido entre 200 e 400 pares de base (Figura 2).
  7. Para amplificar simultaneamente vários cDNAs durante a etapa de PCR multiplex, projetar primers com um comprimento entre 18 e 24 nucleotídeos e uma temperatura de fusão (Tm) entre 55 e 60 ° C.
  8. Para minimizar a formação de estruturas secundárias, que reduzem o rendimento de amplificação, selecione sentido e anti-sentidos primers com prendendor mínima e comprimentos de frente e verso (Figura 2B).
  9. Projetar primers internos, usando os mesmos critérios (etapas 2.5-2.8).
  10. Verifique se a especificidade dos primers PCR, alinhando os primers no banco referência de sequência de RNA do organismo de interesse usando um nucleotídeo explosão.
    1. Na explosão (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), clique no nucleotídeo explosão. Cole a sequência de um primer na Sequência de consulta digite.
    2. Na seção Escolha o conjunto de pesquisa , clique em outros (nr etc.), selecione sequências de RNA de referência (refseq_rna) na opção de banco de dados e especificar o organismo (por exemplo, Mus musculus (taxid:10090) ) para restringir a análise à espécie desejada.
    3. No Programa de seleção selecione otimizar para sequências algo semelhantes (blastn). Na seção parâmetros de algoritmo reduza o tamanho da palavra até 7 para aumentar a chance de obter sucessos.
  11. Para projetar primers seletivas, manter apenas aqueles cuja sequência tem pelo menos 3 incompatibilidades com os cDNAs indesejadas quando possível.
  12. Ordenar as primeiras demão demolhadas numa concentração relativamente elevada (por exemplo, 200 µM) para garantir que todos os fixadores externos podem ser misturados em uma concentração final de 1 µM.

3. preparação dos reagentes RT

  1. 5 x RT-mistura: preparar em água livre de RNase 400 µ l de solução de mistura de RT (5x) contendo primers aleatórios em 25 µM e dNTPs 2,5 mm para cada trabalho. Armazene esta mistura de trabalho como 20 alíquotas µ l em tubos de 500 µ l.
  2. 20 x ditiotreitol (DTT): preparar 1 mL de 0,2 M TDT em RNase-livre água e armazená-lo como 50 alíquotas µ l.
  3. Loja 2.500 U de inibidor de RNase (40 U / µ l) e 10.000 U de transcriptase reversa (RTase, 200 U / µ l) como 5 alíquotas µ l.
  4. Para garantir uma qualidade óptima dos reagentes RT, armazenar as alíquotas a-80 ° C. Usá-los para até 10 células e apenas por um dia.

4. PCR validação

  1. Prepare os cDNAs, fazendo uma transcrição reversa em uma quantidade relativamente grande de total do RNA (tipicamente 1 µ g) extraído38 da estrutura de interesse.
    1. Não utilize as pipetas dedicadas a única célula RT-PCR para essas etapas preliminares, mas usar as pipetas RNase-livre. Dilua o RNA total até 1 µ g / µ l.
    2. Em um tubo PCR 500 µ l, adicione 1 µ l de RNA total diluído e 8 µ l de água livre de RNase. Desnaturar a 95 ° C por 1 min e refrigerar para baixo o tubo no gelo.
    3. Adicionar 4 µ l de buffer de 5 x RT fornecido pelo fabricante, 4 µ l da solução de mistura de RT, 1 µ l de RTase, 1 µ l de inibidor de RNase e 1 µ l de 200 mM DTT (ver secção 3).
    4. Agite o tubo, girar e incubar durante uma noite a 37 ° C.
    5. Armazene os cDNAs a-80 ° C por até vários anos. Prepare-se uma alíquota de cDNAs diluídos a 1 ng / µ l de equivalentes de RNAs totais.
  2. Misturar e diluir cada par de primer em 1 µM com as pipetas dedicadas a única célula RT-PCR. Use 20 µ l de cada mistura de cartilha para 100 µ l PCRs.
  3. No gelo, prepare-se para cada par de primer uma pré-mistura contendo: água (QS, 80 µ l), 10 µ l de 10x buffer, 1 µ l de 100 x dNTPs (50 µM cada), 500 – 1.000 pg do cDNA diluído a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
  4. Use tubos PCR que encaixam firmemente os poços da máquina do PCR para um controle de temperatura ideal. Adicione 2 gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral a pré-mistura sem tocar a parede ou a tampa do tubo do PCR.
  5. Para minimizar a formação de dímeros de cartilha, executar um começo quente, colocando os tubos PCR no thermocycler pre-aquecido a 95 ° C. Após 30 s, rapidamente expulsar 20 µ l do mix primeira demão em cima do óleo.
  6. Após 3 min a 95 ° C, executar 40 ciclos (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) seguido por uma etapa de alongamento final a 72 ° C por 5 min.
  7. Analise 10 µ l de cada produtos PCR por agarose gel de electroforese (2%, peso/volume)39. Se alguns produtos PCR não tem o tamanho esperado, re-projetar outros primers (ver secção 2).
    Cuidado: Brometo de etídio é um químico intercalante que pode induzir mutações de DNA. Consulte o escritório local de segurança antes de usá-lo. Use sempre luvas quando manipular isso. Use uma solução comercial de solução (10 mg/mL) de brometo de etídio em vez de pó para minimizar o risco de inalação. Da mesma forma, a luz UV pode ser prejudicial, então certifique-se de usar uma máscara ou óculos de proteção UV. Retire géis sujos, dicas, luvas e buffer em contentores de resíduos de etídio.
  8. Uma vez que todos os pares da primeira demão foram validados individualmente, teste o protocolo multiplex (Figura 3).
    1. Misturar e diluir todos os fixadores externos juntos loja 1 µM. os primers multiplex misturam a-20 ° C por até várias semanas.
    2. No gelo, preparar um premix contendo: água (QS, 80 µ l), 10 µ l de 10x buffer, 1 µ l de 100 x dNTPs (50 µM de cada), 500 – 1.000 pg de cDNAs diluídos a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
    3. Agite o tubo do PCR, girá-lo e adicionar duas gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral.
    4. Execute um começo quente conforme descrito na etapa 4.5 com 20 µ l do mix de multiplex da primeira demão. Depois de 3 min a 95 ° C, execute 20 ciclos PCR idênticas da etapa 4.6.
    5. Prepare um número de tubos PCR idênticos ao número de genes para analisar. Prepare um premix como passo 4.8.2, mas usando 1 µ l do primeiro produto do PCR por gene como modelo. Ajuste todos os volumes de acordo com o número de genes para analisar e considerar o uso de 10% do volume extra para compensar erros de pipetagem.
    6. Agite, girar o tubo, expedir 80 µ l de pré-mistura em cada tubo PCR e adicionar duas gotas (~ 100 µ l) de óleo mineral pelo tubo sem tocar a parede ou a tampa dos tubos.
    7. Executar um quente começar (consulte a etapa 4.5) pela expulsão 20 µ l de mistura interna cartilha preparada na etapa 4.2. Execute 35 ciclos PCR idêntico ao passo 4.6.
    8. Analise os produtos PCR segundo por eletroforese em gel de agarose. Certifique-se de que cada segundo PCR gera um amplicon do tamanho esperado. Em caso de amplificações ineficientes ou inespecíficas, re-projetar novas Cartilhas (etapas 2.5 – 2.12) e validá-los (passos 4.2 – 4.8).

5. preparação e validação da solução de Patch-clamp intracelular

Nota: O seguinte protocolo descreve a preparação e validação de um /gluconate K+baseado solução interna, mas virtualmente qualquer tipo de solução de remendo-braçadeira pode ser usado, desde não impeça a eficiência de RT-PCR. Uso de luvas é obrigatória para obter uma solução interna livre de RNase.

  1. 60 mL de solução de gravação interna da remendo-braçadeira, prepare extemporaneamente 10ml de 0,1 M de KOH.
  2. Dissolva 11,4 mg de EGTA (0,5 mM final) em 0,9 mL de 0.1 M de KOH.
  3. Adicionar 40 mL RNase-livre de água e dissolver 2,02 g de K-gluconato (144 mM final), 143 mg de HEPES (final de 10 mM) e 180 µ l de 1m MgCl2 (final de 3 mM).
  4. Ajuste o pH para 7.2 Adicionando ~ 6 mL de 0.1 M de KOH.
  5. Ajuste a osmolaridade para 295 mOsm com ~ 13 mL de água livre de RNase.
  6. Desde que a solução interna é usada também como um amortecedor para a transcrição reversa, controle cuidadosamente a concentração de Mg2 + . Compensa uma menor concentração de Mg2 + na solução interna adicionando MgCl2 depois para chegar a uma concentração final de 2 mM na reação de RT.
  7. Para rotular a célula colhida após a gravação da remendo-braçadeira, adicione 2 – 5 mg/mL de biocytin RNase-livre para a solução interna descrita acima (etapas 5.1 – 5.5).
  8. A solução interna do filtro (tamanho de poros de 0,22 µm) e armazená-lo a-80 ° C alíquotas de mais de 100 – 250 µ l.
  9. Para validar o uso da solução interna para célula única RT-PCR, adicionar 0,5 µ l de RNA total, diluído a 1 ng / µ l a 6 µ l da solução da remendo-braçadeira e deixá-lo no banco por cerca de 30 min.
  10. Com uma micropipeta de 2 µ l, adicionar 2 µ l de 5 x RT-mistura, 0,5 µ l de 20 x DDT, inibidor de RNase 0,5 µ l e 0,5 µ l RTase e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  11. Gire o tubo. No gelo, adicione água (QS, 80 µ l), 10 µ l de tampão de 10x e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) da Taq polimerase.
  12. Execute 40 ciclos de PCR usando um conjunto de primers validados (etapas 4.4 – 4.6).
  13. Analisar os produtos PCR por eletroforese em gel de agarose (consulte a etapa 4.7) e verifique se eles têm o tamanho esperado.
    Nota: Omitindo a 0,5 µ l de RNA total e substituindo-o por água livre de RNase a µ l 0,5 irão garantir que a solução interna está livre de contaminações de RNA ou DNA.

6. aguda fatia preparação

Nota: Este protocolo descreve o procedimento de corte para juvenil (ou seja, menos de 28 dias pós-parto) ratos machos e fêmeas. Outras soluções de corte, como baseados em sacarose artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) também são utilizáveis40.

  1. Prepare-se 2 L de aCSF contendo (em mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 22, 1 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glicose e sacarose 15. Para reduzir a atividade de glutamatérgico durante a preparação da fatia, prepare uma solução de corte pela adição de 1 mM de ácido cinurênico.
  2. Antes de cortar, prepare um kit de dissecação contendo tesoura cirúrgica, tesoura íris fina, duas espátulas, pinças, um disco de papel filtro e cola de cianoacrilato.
  3. Usar solução de corte gelada saturada com O2/CO2 (95/5%) e de arrefecimento da câmara de corte a-20 ° C.
  4. Anestesia o mouse com um pequeno papel toalha embebida com isoflurano. Depois de ~ 2 min, certifique-se de que o mouse está sob anestesia profunda, verificando a ausência de resposta a pitada de pata.
  5. Rapidamente decapitar o mouse. Retire o couro cabeludo e abrir o crânio. Extrair o cérebro com cuidado e coloque-o num pequeno copo preenchido com solução de corte de gelo frio (~ 4 ° C) oxigenada com O2/CO2.
  6. Remova a câmara de corte de condições de-20 ° C e umidade com uma toalha de papel.
  7. Cuidadosamente, disseca o cérebro para isolar a região de interesse, cola-lo na câmara de corte e adicionar a solução de corte gelada oxigenada com O2/CO2.
  8. Corte 300 µm de espessura utilizando um vibratome. Transferi-los à temperatura ambiente em uma descanso câmara cheia de solução de corte oxigenado e permitir a recuperação pelo menos 0,5 h.

7. única célula RT-PCR após a gravação do Patch-clamp

  1. Limpe o sistema de perfusão regularmente com ~ 100 mL de solução de 30% H2O2 e enxágue extensivamente com ~ 500 mL de água destilada para evitar o crescimento de bactérias, como é uma fonte negligenciada de contaminação de RNase.
  2. Cloração do filamento com uma pipeta de remendo cheia de lixívia concentrada cada dia de colheita. Não utilize uma micropipeta para encher a pipeta de remendo, mas prefiro uma 20 µ l longo, fino, flexível dica ligado a uma seringa de 1 mL. Em seguida, enxágue extensivamente com água livre de RNase e seque-o com um espanador de gás.
  3. Prepare uma pequena caixa de gelo contendo 5 x RT-mix e 20 alíquotas de x DTT. Armazene as alíquotas de inibidor de RTase e RNase a-20 ° C em uma bancada mais fresca.
  4. Transferi uma fatia para a câmara de gravação perfundida em 1 a 2 mL/min com aCSF oxigenado.
  5. Puxe pipetas de remendo (1-2 µm abrir diâmetro de ponta, MΩ de 3 – 5) de vidro de borosilicato usando luvas e encha um com 8 μL da solução interna. Tenha em mente que os botões do extrator a pipeta são uma fonte de contaminação de RNase.
  6. Coloca a pipeta no suporte pipeta enquanto vestindo luvas novas e não tocar o filamento com os dedos.
  7. Abordagem da pipeta de remendo com uma pressão positiva e realizar a gravação de células inteiras para caracterizar a célula alvo (Figura 4).
  8. Para preservar os mRNAs, limitar o tempo de configuração de células inteiras de 20 min41.
  9. No final da gravação, prepare um tubo PCR de 500 µ l cheio de 2 µ l de 5 x RT Mix 0,5 µ l de 20 x DTT, girá-lo e armazená-lo no gelo.
  10. Colha o citoplasma da célula, aplicando uma ligeira pressão negativa (Figura 4). Controle visualmente que o conteúdo da célula vem dentro da pipeta, mantendo um selo apertado.
    1. Evite tanto quanto possível, coletando o núcleo se consideram-se alguns genes intrão-menos. Nesse caso sempre incluem um conjunto de primers vista amplificar gDNA para investigar contaminação genômica.
    2. Se o núcleo está chegando perto a ponta da pipeta, liberar a pressão negativa e mover a pipeta longe do núcleo. Certifique-se de que o selo apertado é preservado e reinicie para coletar o citoplasma na localidade nova pipeta.
  11. Pare a colheita, quando não há mais material está vindo e/ou antes de perder o selo apertado.
  12. Retire a pipeta suavemente para formar um patch fora-fora para limitar a contaminação, os detritos extracelular (Figura 4) e a favorecer o fechamento da membrana celular para análises histoquímicas subsequentes.
  13. Tenha em mente que os botões, Micromanipuladores, teclado de computador, ou rato do computador são fontes potenciais de contaminação de RNase. Se eles foram tocados durante a gravação, mude as luvas.
  14. Anexar a pipeta para o bagaço e expulsar o seu conteúdo dentro do tubo PCR, aplicando uma pressão positiva (Figura 1).
  15. Quebre a ponta da pipeta no tubo do PCR para ajudar a coleção de seu conteúdo.
  16. Brevemente o tubo de centrifugação, adicionar 0,5 µ l de inibidor de RNase e 0,5 µ l de RTase, misture delicadamente, centrifugue novamente e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  17. Girar o tubo e armazená-lo a-80 ° C por até diversos meses até análise PCR.
  18. Execute a primeira etapa de amplificação diretamente no tubo contendo o ~ 10 µ l de produtos RT pela adição de água (QS, 80 µ l), 10 µ l de tampão de x 10 e 0,5 µ l (2,5 U) da Taq polimerase. Em seguida, siga as instruções descritas em etapas 4.8.2–4.8.8.

8. histochemical coloração da célula gravada (opcional)

  1. Após as gravações eletrofisiológicas, manter a fatia por 20 min em aCSF oxigenado para permitir a difusão do biocytin na árvore dendrítica e axonal.
  2. Coloque a fatia em um poço de uma placa de 24 e corrigir isso durante a noite a 4 ° C, com 1 mL de paraformaldeído 4% em 0,1 M de tampão de fosfato.
  3. Lave as fatias 4 vezes, 5 min cada, com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS).
  4. No mesmo bem, permeabilize e saturar a fatia durante 1 h em temperatura ambiente com 1 mL de PBS suplementado com 0,25% Triton X-100 e 0,2% de gelatina de pele de peixe de água fria (PBS-GT).
  5. Incubar durante uma noite com uma fluorescente etiquetada avidin diluído a 1/400 em 250-500 µ l de PBS-GT.
  6. Lavar 5 vezes, 5 min cada, com 1 mL de PBS e montar as fatias.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios

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Discussão

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Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pilha de correspondênc...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MACAW v.2.0.5NCBIAlinhamento múltiplo para design de primer
DitiotreitolVWR443852ART
Primers aleatóriosSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT e PCR
RNasin Inibidores de ribonucleasePromegaN2511RT
SuperScript II Transcriptase reversaInvitrogen18064014RT
Taq DNA polimeraseQiagen201205PCR
Óleo mineralSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
PCR primersSigma-Aldrich (Merck)PCR / dessalinizado e diluído a 200 µ Tubos M
, 0,5 mL, tampa planaSérie ThermoFisher ScientificAB0350RT e PCR
BT10 - 10 µ Ponta de Filtro LNeptune ScientificBT10RT e PCR
Série BT20 - 20 µ Ponta de Filtro LNeptune ScientificBT20RT e PCR
BT200 Series - 200 µ L Ponta de FiltroNeptune ScientificBT200RT e PCR
BT1000 Series - 1000 µ L Ponta de FiltroNeptune ScientificBT1000.96RT e PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Brometo de EtídioSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLEletroforese em gel
agarose Tampão Tris-Borato-EDTASigma-Aldrich (Merck)T4415-1LEletroforese em gel de agarose
UltraPureLife Technologies16500-500Eletroforese em gel de agarose
Φ X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SEletroforese em gel de agarose
EDA 290KodakEletroforese em gel de agarose
Eletroforese Fonte de alimentação EPS 3500Pharmacia BiotechEletroforese em gel de agarose
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Modelo SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Eletroforese
em gel de agarosePapel liso com aparência acetinadaFisherbrand1748BPatch clamp solução interna
Hidróxido de potássioSigma-Aldrich (Merck)60377Patch clamp solução interna
Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N′, N′-ácido tetracéticoSigma-Aldrich (Merck)E3889Patch clamp solução interna
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Patch clamp solução interna
D-gluconato de potássioSigma-Aldrich (Merck)G4500Patch clamp solução interna
Solução de cloreto de magnésioSigma-Aldrich (Merck)M1028Patch clamp solução interna
5500 Osmômetro de pressão de vaporWescorPatch clamp solução interna
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261Solução interna de patch clamp
SacaroseSigma-Aldrich (Merck)S5016Preparação de fatia
D-(+)-Glicose monohidratadaSigma-Aldrich (Merck)49159Preparação de fatia
Cloreto de sódioSigma-Aldrich (Merck)S6191Preparação de fatia
Cloreto de potássioSigma-Aldrich (Merck)60128Preparação de fatia
Bicarbonato de sódioSigma-Aldrich (Merck)31437-MPreparação de fatias
Fosfato de sódio monobásicoSigma-Aldrich (Merck)S5011Preparação de fatias
Solução de cloretode magnésio Sigma-Aldrich (Merck)63069Preparação de fatias
Solução de cloreto de cálcioSigma-Aldrich (Merck)21115Preparação de
Ácido quinurênicoSigma-Aldrich (Merck)K3375Preparação de fatias
IsofluranoPiramal Healthcare UKPreparação de fatias
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Preparação de fatias
Solução de peróxido de hidrogênioSigma-Aldrich (Merck)H1009Patch Clamp limpeza de configuração
Parede fina Capilares de vidro com filamentoWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch Clamp
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003Patch Clamp
BX51WI Microscópio verticalOlympusPatch Clamp
XC-ST70 / CE CCD B / W CÂMERA DE VÍDEOSonyPatch Clamp
Axopatch 200B AmplificadorPatch Clamp da Molecular Devices
Digidata 1440Patch ClampMolecular Devices
pCLAMP 10 pacote de softwareSeringa Molecular DevicesPatch Clamp
10 mLTerumoSS-10ESExpelling
E Series com Corpo Reto (Suporte)Phymep64-0997Expelling
Fosfato de sódio dibásicoSigma-Aldrich (Merck)S7907Revelação histoquímica
Fosfato de sódio monobásicoSigma-Aldrich (Merck)S8282Revelação histoquímica
ParaformaldeídoSigma-Aldrich (Merck)P6148Revelação histoquímica
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Revelação histoquímica
Gelatina de pelede peixe de água friaSigma-Aldrich (Merck)G7041Revelação histoquímica
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugadoThermoFisher ScientificS11223Revelação histoquímica
Placa de 24 poçosGreiner Bio-One662160Revelação histoquímica
de fatiasda

Referências

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