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Artigo de método

Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

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DOI:

10.3791/57632

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24 de julho de 2018

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

Técnicas de cultivo microbianas no local da enriquecimento ou em situ podem facilitar o isolamento dos táxons de difícil-para-cultura microbianos, especialmente de ambientes de baixa biomassa ou geoquímica extremas. Aqui, descrevemos um set-up eletroquímico sem usar uma fonte de alimentação externa para enriquecer cepas microbianas capazes de transporte de elétrons extracelular (EET).

Resumo

Respiração anaeróbica, juntamente com o transporte de elétrons para minerais insolúveis (referido como o transporte de elétrons extracelular [EET]) é pensada para ser crítico para a produção de energia microbiana e persistência em muitos ambientes de subsuperfície, especialmente aqueles falta de aceitadores de electrões terminal solúvel. Enquanto micróbios capazes de EET foram isolados com sucesso de vários ambientes, a diversidade de bactérias capazes de EET é ainda mal compreendida, especialmente em difícil-para-amostra, baixa energia ou ambientes extremos, como muitos subsuperficial ecossistemas. Aqui, descrevemos um sistema eletroquímico no local para enriquecer bactérias EET-capaz usando um ânodo como um aceptor de elétron terminal respiratória. Este ânodo está ligado a um cátodo capaz de catalisar a redução de oxigênio abióticos. Comparar esta abordagem com electrocultivation métodos que usam um potentiostat para equilibrar o potencial de eletrodo, o sistema de dois-eletrodo não requer uma fonte de energia externa. Nós apresentamos um exemplo de nosso enriquecimento no local utilizado em um lago alcalino, cedros, um site serpentinization terrestres no norte da Califórnia. Tentativas anteriores para cultivar bactérias redutoras minerais foram infrutíferas, que é provavelmente devido a natureza de baixa biomassa deste site e/ou a baixa abundância relativa de metal reduzindo os micróbios. Antes de implementar nosso enriquecimento de dois elétrodos, medimos o perfil vertical da concentração de oxigénio dissolvido. Isso nos permitiu colocar o carbono de feltro ânodo e platina-galvanizado carbono feltro cátodo em profundidades que apoiaria aeróbias e anaeróbias processa, respectivamente. Após incubação no local, estamos ainda mais enriquecido o elétrodo anódico em laboratório e confirmou uma comunidade microbiana distinta em comparação com a superfície-anexado ou comunidades de biofilme normalmente observadas nos Cedros. Este enriquecimento que posteriormente levado ao isolamento do primeiro micróbio electrogenic de cedros. Este método de enriquecimento microbiano no local tem o potencial para aumentar consideravelmente o isolamento de bactérias EET-capaz de baixa biomassa ou difícil a habitats de amostra.

Introdução

Vários minerais-reduzindo micróbios foram mostrados para utilizar minerais de fase sólida como aceitadores de electrões terminal, por processos de transporte de elétrons extracelular (EET) que conduzir elétrons para o exterior da célula através de de enzimas redox1. EET é fundamental, não apenas para processos de micróbio-mineral mas também energia aplicada e tecnologias ambientais, tais como células de combustível microbianas2, síntese de eletrodo3e biorremediação4. Nova bactéria capaz de EET é muito procuradas e têm sido muito estudadas a partir de uma perspectiva fundamental ou aplicada5. No entanto, temos apenas limitado insight sobre a importância ecológica ou biogeoquímico destas bactérias. A maioria dos micróbios capazes de EET foram isolada após enriquecimento do aqua, sedimentos ou Digestores anaeróbicos usando aceitadores de electrões sólido como MnO2, Fe2O3 ou eletrodos preparados no laboratório6, 7 , 8. no entanto, esses métodos produzem frequentemente similares consórcios e potencialmente perder os táxons mais sensíveis que podem dominar a baixa energia ou sistemas de biomassa baixa, a capacidade destes micróbios para adaptar-se ao laboratório ou ambiente de cultura axénica9 de polarização . Geralmente para ambientes de baixa biomassa, grandes quantidades de água de um site são filtradas para concentrar as células bacterianas. No entanto, bactérias capazes de EET, muitas vezes, apresentam metabolismo anaeróbico e, portanto, exposição de oxigênio ainda mais pode inibir ou impedir o seu cultivo. Metodologias no local alternativas para concentrar as células sem expô-los ao oxigênio poderiam facilitar o isolamento de bactérias capazes de EET. Aqui, nós relatamos detalhes de configuração para uma técnica eletroquímica no local enriquecer o micróbio capaz de EET durante um longo período de tempo sem a necessidade de uma fonte de energia externa.

Usando nossos experimentos de electrocultivation de uma fonte altamente alcalina no norte da Califórnia, os cedros10, descrevemos esta técnica eletroquímica no local. A geoquímica das molas nos cedros são impactados por serpentinization no subsolo. As molas são altamente redutoras, com concentrações de oxigênio abaixo do limite de detecção sob a interface ar água, destacando o potencial para a produção de energia microbiana através de EET neste ambiente anóxico funcionalmente11. No entanto, não há provas para apoiar a micróbios EET-capaz de cedros (em 16S rRNA ou análise de Metagenomic). Mesmo que este ambiente tem sido caracterizado como aceitador de electrões limitado, o potencial para o uso de minerais insolúveis como aceitadores de electrões terminal, incluindo minerais tais como o ferro descobrindo minerais que resultam de serpentinization (i.e., magnetita), não tem sido extensivamente investigada12. Nós, portanto, implantado o nosso sistema eletroquímico no parque de campismo da Primavera, uma mola de pH elevado em cedros, enriquecer para EET-capaz de micróbios (Figura1)13.

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Protocolo

1. construção de um sistema de dois-eletrodo para incubação ambiental

  1. Preparação do material do ânodo e tratamento de carbono sentiram eletrodo (Figura 2).
    1. Corte o carbono sentiu igual dimensões dependendo do enriquecimento de biomassa desejado. Mergulhe cada eletrodo em etanol a 90% por 30 min e, em seguida, enxágue pelo menos 8 vezes com água desionizada, sonicating por 1 min depois de cada lavagem.
    2. Lave os eletrodos duas vezes em 1 M de HCl, mexendo durante um período mínimo de 12 h para cada lavagem.
    3. Seque os eléctrodos em forno quente (37 ° C) por 6-12 h ou até livre de líquido.
    4. Coloque eléctrodos ao fio de titânio, usando cola epoxy de grafite por protocolo do fabricante em um prato de politetrafluoroetileno (superfície non-stick).
      Nota: Usamos um fio de titânio devido à sua alta tolerância à corrosão aeróbia.
    5. Asse o eletrodo a 120 ° C, durante 6 h.
    6. Teste a resistência entre o fio de titânio e carbono de feltro com um ohmímetro e confirmar que a resistência entre o fio e eletrodos de feltro é inferior a 5 ohms.
  2. Electroplation de platina sobre o carbono sentiu eletrodo para preparação do material do cátodo
    1. Mergulhe os elétrodos do carbono feltro, preparados na etapa 1.1, em M 2 KOH durante um período mínimo de 12 h em um recipiente de vidro.
    2. Para limpeza eletroquímica, coloque o eléctrodo como eletrodo (WE) a trabalhar em um reator de três-elétrodo, que também acomoda uma referência (RE) e o elétrodo contrário (CE). Conectar-se a nós, RE e CE para o potentiostat pelo jacaré. Confirme todas as conexões com um ohmímetro.
      Nota: Usamos uma Ag/AgCl (KCl saturado) arame eletrodo e um de platina como RE e CE, respectivamente.
    3. Poise o eletrodo no 1,0 V vs. Ag/AgCl para 600 s em solução eletrolítica contendo 2 M KOH (usando uma quantidade suficiente para submergir o eléctrodo inteiro). Retire o eletrodo do reator eletroquímico (que é feito de vidro). Enxague o eletrodo em água desionizada pelo menos 8 vezes, sonicating por 1 min depois de cada lavagem. Eletrodos de secos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h.
    4. Para preparar a solução do chapeamento, adicione 100 g de ácido cítrico, 5 g de sulfato de sódio e 2 g de-hidrogenofosfato hexachloroplatinate (IV) hexa-hidratado para 1 L de ácido sulfúrico de 2m.
    5. Pesagem limpos secos eletrodos como preparado em etapas 1.2.1–1.2.2 e em seguida, cobrir o eletrodo em uma solução do chapeamento como preparado na etapa 1.2.3. Proceda à sonicação o eletrodo na solução do chapeamento três vezes para 30 s cada.
    6. Galvanizar os eléctrodos por equilibrar o potencial de eletrodo no-0.2 V vs Ag/AgCl para 460 s no chapeamento de solução. Lave os eletrodos duas vezes em água desionizada e descartar os resíduos de platina.
    7. Lave os eléctrodos em água desionizada pelo menos 3 vezes, sonicating por 20 s após cada lavagem. Enxaguar sem sonication pelo menos três vezes mais.
    8. Eletrodos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h. eletrodo de pesagem para quantificar a platina eletrodepositada sobre o eletrodo de carbono sentiu a seco.

2. construção e instalação do sistema dois-eletrodo

  1. Investigação do local de instalação para cada eletrodo no ambiente natural.
    1. Determine a concentração de oxigênio usando uma sonda de oxigênio dissolvido (DO).
    2. Verificar o perfil de profundidade de fazer no site.
      Nota: As condições ambientais desejadas para o ânodo são anóxia e hidratação consistente. Se desejado, remova a influência da fotossíntese oxygenic protegendo o ânodo de luz. As condições ideais para a colocação do cátodo são consistentemente hidratadas e perto de superfície águas fossem oxic. Se necessário, fixe flutuadores para manter contato de superfície no cátodo.
  2. Construção do sistema de incubação de 2-eletrodo de tipo de célula de combustível
    1. Conecte o fio isolado de comprimento desejado e uma pista de fio de titânio de eletrodos (um ânodo e um cátodo chapeado platina) rodando as duas linhas. Cobrir as conexões com cera resistente à água e proteger ainda mais usando tubos de encolher calor marinho da classe.
    2. Conecte dois cabos com um cátodo e um ânodo por um resistor de resistência conhecida.
      Nota: Para sistemas biológicos, resistores de baixas (10 a 1.000 Ω) resultam em atividade biológica mais consistente. Se desejado, um resistor de resistência elevada impedirá atividade biológica, como controlo negativo. Para evitar a corrosão de qualquer conexão entre o resistor e pistas, protegemos com tubos de psiquiatra do calor.
  3. Medição de tensão e registro de temperatura ao longo do tempo.
    1. Verificar a tensão entre as extremidades do resistor para estimar a produção atual da reação da célula de combustível.
    2. Medir a diferença de tensão ao longo do tempo usando um voltímetro de log de dados com as conexões apropriadas, levando para o ânodo e o cátodo (Veja o protocolo do fabricante).
      Nota: O registo de dados de temperatura simultânea é opcional, mas esta informação pode ajudar a relacionar as alterações no atual para abióticos em oposição a flutuações biológicas.
  4. Proteção de registrador de dados e conexões elétricas
    1. Use um saco estacionário e/ou plástico para proteger o agente de log e todas as conexões elétricas de chuva.
    2. Fixe os cabos firmemente para proteger do vento forte e um saco de plástico. Um exemplo é mostrado na Figura 1.

3. coleta da amostra do eletrodo de meio ambiente

  1. Para impedir que a qualidade da amostra ânodo sendo danificado devido a contaminação, colete o eletrodo sob condições anaeróbicas.
  2. Pelo menos 30 min antes da coleta da amostra de eletrodo, colocar um tubo de ensaio em uma localização anaeróbica. Por exemplo, colocar o tubo de ensaio e tampa separadamente na parte inferior da lagoa para fazer a garrafa dentro anaeróbica.
  3. Cortar a ponta do elétrodo com um cortador de fio de titânio, delicadamente coletar a amostra de eletrodo para o tubo de ensaio e selá-lo na zona anaeróbica água. Para manter a amostra fresca, armazene a amostra a 4 ° C imediatamente após a coleta de amostra.
    Nota: Como alternativa, eletrodos podem ser transferidos diretamente para anóxica (N2 purgado) médio. Usamos um meio de cedros (descrito por Suzuki et al . 11) que foi concebido a partir da geoquímica aquosa medido no local e alterado para fornecer nutrientes suficientes para o crescimento microbiano. Essa mídia foi modificada para experimentos de laboratório diferente.

4. laboratório confirmação para a atual produção e análise de DNA

  1. Eletroquímica confirmação para a atual capacidade de produção de consórcios microbianos anexar para o eletrodo.
    1. Construir um reator eletroquímico de14,15 com uma Ag/AgCl (KCl saturado), um fio de platina e o eletrodo amostrado eletrodo como nós, CE e ré, respectivamente, em uma câmara anaeróbica. Encha o reator eletroquímico com meio de cedros contendo doadores de elétron de carboidratos solúveis.
    2. Equilíbrio do potencial de eletrodo no + 0,2 V vs Ag/AgCl e a medida da produção atual.
  2. Extração de DNA da amostra eletrodo usando um DNA microbiano kit (veja a tabela de materiais).
    1. Limpar o interior do anaeróbico luvas com 70% de etanol e colocar um prato esterilizado em papel alumínio.
      Nota: Câmara anaeróbica mantém a concentração de oxigênio a menos de 1 ppm por manter uma atmosfera de hidrogênio em torno de ~ 2-3% para eliminar o oxigênio na presença de um catalisador de paládio.
    2. Abra o reator eletroquímico no porta luvas, colocar o eletrodo de amostra sobre o prato e cortar para um tamanho para caber o tubo utilizado no kit de DNA. Prossiga com o protocolo do fabricante.

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Resultados

Produção atual foi medida com êxito durante cerca de 3 meses usando um registrador de dados de tensão conforme mostrado na Figura 3. Desta vez foi escolhida como era o mais longo período de incubação estável para a primavera, devido à forte queda de chuvas que afetam a primavera. Um período mais curto pode ser suficiente, apesar de um período mais longo poderia fornecer mais forte enriquecimento da biomassa. Nós confirmou a conexão do sistema de dois-eletrodo...

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Discussão

O estudo descrito, vamos mostrar o enriquecimento de um consórcio microbiano, ligado com a produção atual em situ . Dimensiona os padrões observados no atual apoio atividade microbiana neste sistema ao longo do tempo curto e longo. O passo fundamental para a construção de um sistema funcional dois elétrodos (tipo de célula de combustível) está identificando e utilizando um local com um estábulo nível de água e concentração de oxigênio no ambiente. O cátodo é exposto ao oxigênio na interface água ar, enquanto o â...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nós gostaríamos de reconhecer Roger Raiche e David McCrory nos permitir acesso aos cedros e consultoria sobre locais para a incubação de longo prazo. Agradecemos também a equipe de campo de cedros durante a temporada de 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam e Matthew Schechter. Adicional graças a Shino Suzuki e Gijs Kuenen para investigação perspicaz e cultivo de apoio. Este trabalho foi financiado através de um subsídio para jovens cientistas, A e B da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant Japão número 17H 04969 e 26810085, respectivamente e o Japão agência de pesquisa médica e desenvolvimento (17gm6010002h0002). EUA financiamento previstas por nos escritório da Global pesquisa Naval (N62909-17-1-2038) e o centro de investigações de Biosfera de energia escura (C-DEBI) (OCE0939564) e do Instituto de astrobiologia da NASA - vida subterrânea (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte deste trabalho foi realizado como parte de uma sociedade de Japão para a promoção das Ciências: a curto prazo bolsa pós-doutorado em Annette Rowe (PE15019) da Universidade de Tóquio, no laboratório de Kazuhito Hashimoto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folha de feltro de carbonon / an / aUsado para ânodo e cátodo
Fio de titânioA Nilaco CooporationTI-451485Usado para construir sistema de célula de combustível
Epóxi de grafiteElectrolytica lnc.n/aUsado para conectar os eletrodos
e o fio de Ti
Forno de secagemYamatoDY300assar o eletrodo para
solidificar epóxi grafite condutor
Multímetro digitalFluke616-1454para verificar o valor ôhmico
de resistência Sonda de
oxigênio dissolvidoSper Science#  850045para verificar a concentração de oxigênio
no ambientes
ResistorSodialUsado para construir sistema de célula de combustível
Fio condutorPico81141sUsado para construir sistema de célula de combustível
Voltímetro e registrador de dadosT& D corporationVR-71Usado para gravação de dados
Hexacloroplatinato de hidrogênio (IV) Hexahidratadowako18497-13-7Usado para eletropolação
Ácido cítricoWako038-06925Usado para eletropolação
Ácido sulfúricoWako192-04696Usado para eletropolação
HClWako083-01095Usado para lavagem de eletrodos
Cilindro de vidroN/AN/AFeito sob medida, usado como reator eletroquímico
Tampa e base de PTFEN/AN/AFeito sob medida, usado como cobertura e fundação do reator eletroquímico
Borracha butílicaN/AN/AFeito sob medida, inserido entre cada componente do reator eletroquímico
SeptaGL Science3007-16101Usado como uma porta de injeção do reator eletroquímico
Eletrodo de óxido dopado com estanho de índio (ITO)GEOMATECNo.0001Usado como um eletrodo de trabalho, eletrodo saturado de 5Ω/sq
Ag/AgCl KClHOKUTO DENKOHX-R5Usado como um eletrodo de referência, Φ fio da platina de 0.30mm
O Nilaco CooporationPT-351325usado como um elétrodo contrário
NaHCO3Wako191-01305usado para os meios dos cedros (CMS)
CaCO3Wako030-00385usado para o CMS
NH4ClWako011-03015usado para o CMS
MgCl2  &touro; 6H2OWako135-00165Usado para CMS
NaOH Wako198-13765Usado para CMS
Na2SO4Wako194-03355Usado para CMS
K2HPO4Wako164-04295Usado para
CMS CABSSANTA CRUZSC-285279Usado para incubadora
CMS TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.LTI-601SDUsado para máquina de autoclave de pré-cultivo
TOMY SEIKO CO., LTD.LSX-500Usado para esterilização do reator eletroquímico e do meio
Bancada limpaSANYOMCV-91BNFUsado para evitar a contaminação do reator eletroquímico e do meio com outros micróbios
Separador de centrífugaEppendorf5430RVelocidade de rotação de até 6000× g é necessário
Gerador de gás nitrogênioPuequ CO. LTD.PNTN-2O cilindro de gás nitrogênio também pode ser usado em vez do gerador de gás
Espectrômetro UV-visSHIMADZUUV-1800Usado para otimização da densidade celular
PotenciostatoBioLogicVMP3Usado para formação de biofilme e experimentos de efeito de isótopos cinéticos
Circulador de água térmicaCOMO UMTR-1AUsado para manutenção da temperatura do reator eletroquímico
Gaiola de FaradayHOKUTO DENKOHS-201SUsado para experimentos eletroquímicos
anaeróbicaCOYTypeB (Vinil)TO realizar experimentos
sob condição anaeróbica
Ultraclean DNA Extraction kitMoBio
Câmara

Referências

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