Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

Summary

Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.

Abstract

Em inúmeros contextos biológicos, células animais precisam interagir fisicamente com o seu ambiente através do desenvolvimento de forças mecânicas. Entre estes, as forças de tração foram bem caracterizadas, mas há uma falta de técnicas que permite a medição de protrusão forças exercidas pelas células ortogonalmente à sua carcaça. Nós projetamos uma instalação experimental para medir as forças de protrusão exercidas pelas células aderentes em sua carcaça. Células banhadas em uma folha de Formvar compatível com deformam o substrato e a topografia resultante é mapeada por microscopia de força atômica (AFM) à escala nanométrica. Valores de força então são extraídos de uma análise do perfil deformação baseado na geometria das estruturas celulares cêntrica. Portanto, as forças exercidas pelas unidades individuais salientes de uma célula viva podem ser medidas ao longo do tempo. Esta técnica permitirá que o estudo da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão. Aqui, descrevemos o seu aplicativo para medir as forças cêntrica geradas por podosomes formado por macrófagos humanos.

Introduction

As células animais interagirem fisicamente com a matriz e as outras células que constituem o seu ambiente¹. Isso é necessário para que eles migram, internalizar os corpos, adquirir informações externas ou diferenciar. Em tais processos, a célula deve gerar forças mecânicas e, como numerosos estudos têm demonstrado ao longo dos últimos anos, a capacidade de uma célula para gerar forças e sonda ambiente influencia seu comportamento biológico, dirigindo por exemplo proliferação ou diferenciação de^2,3. Por sua vez, a medição de forças celulares é uma grande ajuda para estudar o Regulamento ....

Protocol

1. preparação de grades Formvar-revestido

1. Limpar grelhas de microscopia eletrônica com acetona pura e secá-las com papel de filtro. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio com etanol puro, limpe com um papel de lente e retire a poeira com um ventilador.
2. Coloque uma lâmina de vidro limpa de etanol verticalmente no funil de um dispositivo de fundição de filme contendo uma solução de Formvar na parte inferior. Cubra a parte superior do funil.
3. Bomba de 100 mL de solução de Formvar (0,5% de dicloreto de etileno) com o bulbo atomizador até o nível atingir dois terços do slide.
4. Manter a corrediça na solução por 1 min.
5. Abr....

Results

O protocolo acima descreve como preparar a instalação experimental para quantificar as forças de protrusão aplicadas pelos macrófagos podosomes sobre um substrato de Formvar. Isto é conseguido usando AFM e é ilustrado na Figura 1.

Ao analisar uma imagem topográfica de protuberâncias abaixo podosomes usando o software de processamento de dados JPK, um polinômio de terceiro grau se encaixam convém sub.......

Discussion

Propriedades do material

A escolha do material para a membrana deformável, no nosso caso Formvar, precisa cumprir alguns requisitos. O material deve ser transparente à luz visível e apresentam fluorescência auto limitada para permitir as observações em campo claro e microscopia de fluorescência. A rugosidade do filme fino deve estar abaixo de 10 nm para evitar qualquer efeito topográfico na adesão celular e para permitir a observação clara das saliências induzida por célula po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grades de níquel de malha 200	Papel	1001-055
			de
microscópio	Fisher Scientific	10235612
Adesivos brancos 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
com válvula em sua saída	Microscopia Eletrônica Sciences	71305-01
Razorblades	Microscopia Eletrônica Sciences	72000
Etanol	VWR	1.08543.0250
Acetona	VWR	20066.321
Formvar Solução a 0,5% em dicloreto de etileno	Microscopia Eletrônica Sciences	15820
12 mm lamínulas	VWR	631-0666
Microscópio invertido	Carl Zeiss	Axiovert 200
	JPK Instruments	NanoWizard III
Suporte de amostra controlado por temperatura	JPK Instruments	BioCell
Cantilever de nitreto de silício com uma constante nominal de mola de 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Fita adesiva dupla face	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm	WPI	FD35-100