Method Article

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.

Ativar o 'perigo' sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .

Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.

Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.

Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.

1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs)

  1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
  2. Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Impostos especiais de consumo ossos tíbia-fíbula e fêmur usando uma tesoura cirúrgica e colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 10 cm.
  3. Use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o tecido fora tanto quanto possível na tampa do cm 10 cultura prato e isolar tíbias e fêmures de colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 6 cm.
  4. Use lâminas cirúrgicas para ambas as extremidades de tíbias e fêmures. Use 3 mL de PBS em seringa de 3 ml com agulha 23G para liberar o conteúdo da medula de uma extremidade dos ossos para um tubo cônico contendo 12 ml de PBS. Repita este passo 3 x para cada extremidade dos ossos.
  5. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise de 1ml ACK para 5 minutos para remover células vermelhas do sangue.
  7. Adicione 9 ml de PBS para diluir o tampão de Lise ACK e centrifugar 300 x g por 5 min.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender com 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% não-essenciais aminoácidos (x 100), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoetanol e 5% de penicilina/estreptomicina).
    Nota: O nível de endotoxinas tem que ser menos de 0.1 EU/ml no FBS.
  9. Passar a suspensão de células através de um filtro de célula 40 μm e levar 20 µ l de suspensão de células e misture com 80 µ l de trypan azul para contar o número de células vivas usando citômetro.
  10. Ajuste o número de células a 1 x 106 células/ml com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml.
  11. 3 ml de 1 x 106 células/ml em cada poço da placa de 6 a placa e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: As células da medula óssea de um rato é em torno de 3-5 x 107 células, indicando que pode ser colocada de 2 para 3 placas de 6 boas.
  12. No dia 3, remova todos os 3 ml de meio de cultura de cada poço, adicionar 2 ml PBS fresca em cada poço, e em seguida agite suavemente a placa para garantir a remoção de todas as células não-aderentes.
  13. Substitua 3 ml de meio de cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 em cada poço de 10 ng/ml. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
  14. No dia 5, diretamente Adicione outro 3 ml meio cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml em cada poço. Incube as celulas em 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: O volume total em cada poço agora é 6 ml.
  15. No dia 7, coloque o prato inteiro no gelo por 10 minutos. Pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar o frouxamente aderentes BMDCs como os iDCs em suspensão.
    Nota: Os macrófagos aderentes ainda estão conectados à placa. Procedimentos e suavemente a baixa temperatura são a chave para evitar a ativação de DC para afetar ainda mais experiências.
  16. Centrifugar a suspensão celular de 300 x g, durante 5 minutos e ressuspender com meio de cultura fresco para novas experiências.
    Nota: BMDCs podem ser identificadas com fluorescência-etiquetada CD11c anticorpo por citometria de fluxo e mostramos nossa estratégia associada de BMDCs para novas experiências na Figura 1.

2. caracterizar o Gene TolDC e perfil de proteína

  1. Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 .
    Nota: CDDO-DFPA, um sintético triterpenoides, é um fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 indutor de fator (Nrf2) e inibidor de fator nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a outros agentes para indução de TolDCs de iDCs, tais como IL-10, vitamina D3, dexametasona ou Baía 11-7085 e modificar esta etapa para uma condição ideal para cada agente.
  2. Adicione 10 ou 100 ng/ml de LPS pela incubação 4-24 hrs para induzir mDCs (tempo de incubação é diferente devido a medição do mRNA ou proteína).
  3. Delicadamente, pipetar o meio de cultura em cada poço e colher a suspensão de células usando uma pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g, durante 5 minutos para coletar as células e o sobrenadante, respectivamente.
  4. Analisar as superfície ligantes de Pelotas o celular por citometria de fluxo, tais como ligantes estimulatórios: CD40, CD80 e CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligantes inibitórios: PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
  5. Isolar o RNA de Pelotas a célula e analisar o RNA e o sobrenadante amostras para os níveis de citocinas perfil e gene e proteína por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e ELISA, respectivamente.
    Nota: por exemplo, citocinas inflamatórias: TNF-α, relato, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL-23 ou anti-inflamatórios citocinas: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.

3. avaliar a função de TolDCs In Vitro e In Vivo

  1. Ensaio de Syngeneic de proliferação de células T
    1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.
    2. Prepare o buffer de MACS usando 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA em 500 ml de PBS. Esterilize o buffer por filtragem através de um filtro de 0,2 µm.
      Nota: Mantenha o buffer no gelo durante o experimento a seguir.
    3. Para obter o CD4+ T células, eutanásia em ratos transgénicos do OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica.
    4. Colocar o baço com 2 ml de PBS em um prato de cultura de 6 cm e usar a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o baço, passando um filtro de célula 40 μm.
    5. Recolha a suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min.
    6. Ressuspender as células em 400 μl de tampão de MACS.
    7. Adicionar 100 μl de CD4+ T Cell biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 5 minutos.
      Nota: O anticorpo cocktail vincula em outros tipos de célula, exceto CD4+ T células, tais como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.
    8. Adicione 300 μl de tampão de MACS e 200 μl de antigrânulos biotina (Tabela de materiais) a 4° C por 10 minutos.
    9. Lugar da coluna composta de esferas ferromagnéticas (Tabela de materiais) e filtro de pré-separação juntos no magnético campo e enxaguá-lo com 3 ml de tampão de MACS.
    10. Adicione 9 ml de tampão de MACS nas células e centrifugar 300 x g por 5 min.
    11. Ressuspender as células em 3 ml de tampão de MACS e aplique na coluna. Coleta de passagem contendo CD4+ T células.
    12. Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS e também coletar o escoamento.
    13. Para obter o pan esplênica DCs, eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica. Coloque o baço em um prato de cultura de 6cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (colagenase 2 mg/ml D dissolvido em HBSS contendo cálcio, magnésio).
    14. Injecte 1 ml da solução de colagenase D o baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Corte o baço em pequenos pedaços com uma tesoura pequena.
    15. Agitar e incubar a temperatura ambiente por 25 minutos.
    16. Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M à temperatura ambiente por 5 minutos.
      Nota: Os passos de 3.1.13-3.1.14 são essenciais para aumentar o rendimento do DCs.
    17. Agora use a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o chorume do baço, passando um filtro de célula 40 μm e coletar a suspensão de células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos.
    18. Ressuspender as células em 350 μl de tampão MACS, 50 µ l de reagente de bloqueio de FcR e 100 μl de Pan células dendríticas biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 10 minutos.
      Nota: O anticorpo cocktail contra antígenos que não são expressas por DCs.
    19. Lave as células pela adição de 9 ml de tampão de MACS e centrifugar a 300 x g por 5 minutos.
    20. Ressuspender as células em 800 μl de tampão de MACS e adicionar 200 μl de antigrânulos biotina a 4 ° C por 10 minutos.
    21. Repita as etapas de 3.1.9-3.1.11 para coletar DCs.
    22. Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS duas vezes e também coletar o escoamento.
    23. Tratar a 2 x 105 DCs/ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C para 1 hr separadamente, rótulo o CD4+ T células (1 x 107/ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajustar o volume para obter a concentração final de 2 x 106 T células/ml.
    24. Em seguida, em uma placa de 96 poços, co cultura 100 μl de células dendríticas tratadas com o mesmo volume de CD4 CFSE-rotulado+ T cells, ambos colhidos os passos acima para obter 01:10 proporção. Agora adicione 100 ng/mL ovalbumina (OVA) peptídeo 323-329 por bem e medir a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação.
      Nota: O número de células e a relação de DCs e T células foram otimizadas de nossa anterior trabalho37.
  2. Induzir o passivo EAE injetando BMDCs pulsada com mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) (35-55)
    1. Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 hr.
    2. Adicionar 10 ng/ml de LPS para incubação 24 hrs.
    3. Adicionar 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubação 4 hrs.
    4. A suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min. da colheita.
    5. Ressuspender as células com PBS e contar as células.
    6. Por via subcutânea injete 200 μl de 2 x 106 células de camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas de idade (100 μl em cada pata traseira).
    7. No dia da injeção de BMDC e 48 hrs. mais tarde, injetar 200 ng de toxina pertussis (PTX) em cada rato.
    8. Repita etapas 3.2.6-3.2.7 uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
    9. Avalie os sintomas clínicos da EAE diariamente usando critérios padrão37 (0.5-manco cauda final, cauda 1-manco, fraqueza do membro posterior de 2-moderado, 3-grave membro posterior fraqueza, paralisia dos membros posteriores de 4-completo, estado 5-quadriplegia ou moribundo, morte-6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diferenciação e seleção de BMDCs:

Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de forma e também ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalmente, a f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsem síntese internaCultura
de células Mouse GM-CSFPeprotech Inc.315-03Diferenciação BMDC
Mouse IL-4Peprotech Inc.214-14diferenciação BMDC
(LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Cultura de células
β-mercaptoetanolSigma Aldrich Inc.516732Cultura de células
Toxina pertussis (PTX)R& D systems3097EAE indução
MOG (35– 55) peptídeo21stCentury Bioquímicosem síntese internaEAE indução
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Cultura de células
RPMI-1640 mais L-glutaminaThermoFisher Scientific11875-093Cultura de células
Aminoácido não essencial (100X)ThermoFisher Scientific11140050Cultura de células
HEPESThermoFisher Scientific15630080Cultura de células
penicilina/estreptomicinaThermoFisher Scientific15140122Cultura de células
40 μ filtro de células mCorning352340Isolamento celular
CD80 conjugado com PEBD Biosciences557227Citometria de fluxo
CD86 conjugado com PEBD Biosciences555665Citometria de fluxo
PD-L1 conjugada com PEBioLegend124307Citometria de fluxo
MHCII conjugada com APCMiltenyi Biotec Inc.130-112-388
Citometria de fluxo CD11c conjugado com APCBD Biosciences340544Citometria de fluxo
Isotipo correspondente PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Citometria de fluxo
Isotipo compatível com APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Citometria de fluxo
CFSEBioLegend423801Ensaio de proliferação de células T
Kit de isolamento de células dendríticas PanMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Ensaio de proliferação de células
T FcR bloqueando o reagenteMiltenyi Biotec Inc.130-100-875 Ensaio deproliferação de células T
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody CocktailMiltenyi Biotec Inc.130-100-875 Ensaio deproliferação de células T
Anti-Biotina MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875 Ensaio deproliferação de células
T CD4 + Kit de isolamento de células TMiltenyi Biotec Inc.130-104-454 Ensaio deproliferação de células T
CD4 + Célula T Biotina-Anticorpo CoquetelMiltenyi Biotec Inc.130-104-454 Ensaio deproliferação de células T
Anti-Biotina MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454 Ensaio deproliferação de células T
Tampão de lise ACKThermoFisher ScientificA1049201Diferenciação BMDC
Seringa de 1 mlBD BiosciencesEnsaio deproliferação de células T
Seringa de 3 mlBD Biosciences309588Diferenciação BMDC
Agulha 25GBD Biosciences309626Ensaio de proliferação de células T
Agulha 23GBD Biosciences309588diferenciação BMDC
BSASigma Aldrich Inc.Ensaio de proliferação de células TA2058
EDTAThermoFisher Scientific15575020Ensaio de proliferação de células T
LS ColumnMiltenyi Biotec Inc.130-042-401 Ensaio deproliferação de células T
Filtro de pré-separaçãoMiltenyi Biotec Inc.130-095-823 Ensaio deproliferação de células T
colagenase DSigma Aldrich Inc.Ensaio deproliferação de células T
HBSSThermoFisher Scientific14025076ensaio de proliferação de células T
ovalbumina (OVA) peptídeo 323- 329Sigma Aldrich Inc.Ensaio de proliferação de células TO1641
Camundongo IFN-&gama; Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Mouse IL-12a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISAR& D sistemasDY419-05ELISA
Mouse EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-α Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mouse TNF-α Kit ELISA QuantikineR& D systemsMTA00BELISA
IL-6 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISAR& Sistemas DDY1887-05ELISA
IL-4 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxigenase 1 anticorpoAbcamab13248Western blotting
Anti-β-actinaAbcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Sistema de detecção de PCR em tempo realBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell AnalyzerBD BiosciencesCitometria de fluxo
Lipopolissacarídeos de 30962611088858001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles