Artigo de método

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

DOI:

10.3791/57640

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16 de setembro de 2018

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1Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Medical College, Fudan University, 2Department of Medical Biotechnology, Yeungnam University, 3Department of Chemistry, Pukyong National University, 4Marine-integrated Bionics Research Center, Pukyong National University, 5Department of Biochemistry, Chungbuk National University, 6Department of Biomedical Sciences, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Resumo

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Para a avaliação de um novo agente terapêutico para imunoterapia ou vacinação, análise de ativação de células imunes nos tecidos linfáticos é essencial. Aqui, nós investigamos os efeitos imunológicos de um imunoestimulante romance lipídios-DNA em forma de nanopartículas de rotas diferentes de administração no mouse: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa. Essas injeções influenciará diretamente a resposta imune e colheita de tecidos linfáticos e análise de ativação de células dendríticas (DC) nos tecidos são partes cruciais dessas avaliações. A extração dos linfonodos mediastinais (mLNs) é importante mas bastante complexo devido ao tamanho e localização deste órgão. É descrito um procedimento gradual para colheita do baço, mLN e linfonodo inguinal (iLN) e análise de ativação de DC por citometria de fluxo.

Introdução

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Avanços em imunologia e nanomateriais têm levado a uma abundância de potenciais novas estratégias terapêuticas para aplicações em biomedicina, incluindo imunoestimulação e entrega da droga. Otimização da rota de administração é um aspecto vital que afectam a eficácia dos agentes immunostimulatory. Uma nanopartícula immunostimulatory (INP) que consiste de DNA é um adjuvante de nano-imune recém-desenvolvido Self montado por microfases separação devido à estrutura anfifílica de lipídios-DNA1. Portanto, os protocolos para INP envolvendo a administração do material1 no vivo através de diferentes rotas e três procedimentos para colheita de tecidos apropriados como o linfonodo inguinal (iLN), mediastinal LN (mLN) e baço, são descrito. Finalmente, estes tecidos foram analisados para a ativação de células dendríticas (DC), as células apresentadoras mais poderosas no sistema imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a avaliação de antígenos, anticorpos ou outro adjuvantes imunes2.

Nós testamos a formulação do INP, porque é um agente que tem mostrado grande promessa. INP é um receptor Toll-like 9 (TLR9) material adjuvante que contém ácidos nucleicos, para qual avaliação de imunoestimulação eficácia é necessária para teste de injeção diferentes métodos3. Neste contexto, a estimulação de DCs é um ponto de extremidade potente para avaliação na vivo . Depois de moléculas do antígeno ou immunostimulatory são fagocitadas por DCs no sangue ou tecidos periféricos, essas células migram para órgãos linfoides como o baço e o LNs4,5. Assim, ativação de DC foi analisada no baço, mLN dos animais injetados e iLN. Corretamente colheita desses tecidos, portanto, é também crucial para avaliar a resposta imune para um romance de adjuvante ou patógenos5. Essa colheita de tecido também é importante para o desenvolvimento de uma metodologia imunológica romance como uma terapia de câncer. Além disso, este protocolo pode ser usado para verificar a eficiência de outras drogas, tais como vírus de imunodeficiência humana terapêutica6.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais, incluindo o isolamento de manipulação, sacrifício e órgãos animal foram realizados em estrita conformidade com as regras do Comité de uso no centro clínico de saúde pública de Shanghai e Asan Medical Center e cuidado do Animal Internacional. O protocolo de estudo foi aprovado pelas respectivas comissões sobre a ética de experimentos Animal no centro clínico de saúde pública de Shanghai (Mouse protocolo número: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).

1. preparação do Material

Nota: Um nano-adjuvante, INP, composto por uma transportadora de lipídios-DNA Self montado, ou seja U4T, e contendo oligonucleotide de CpG-motivo, eCpG, foi empregado no atual estudo para testar a rota de injeção apropriado para vacinação e imunoterapia em camundongos2 . Importante, outras moléculas terapêuticas potenciais como antígenos, anticorpos e agentes adjuvante podem ser substituídas pelo INP e testaram utilizando a mesma metodologia descrita abaixo.

  1. INP formulação2,4,7
    1. Recoze a U4T (160 µM, transportadora) com eCpG (80 µM, contendo uma sequência de agonista TLR9) na presença de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e MgCl2 (2 mM). O volume padrão para recozimento é entre 50 e 110 µ l em um tubo PCR. Aquecer a mistura a 95 ° C por 10 min e em seguida, refresque lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C, usando um thermocycler. O protocolo de recozimento requer aproximadamente 2 h.
      Cuidado: O líquido contendo U4T é muito espumoso e deve ser manuseado com cuidado.
    2. Fazer 50 alíquotas µ l da preparação INP; Use 50 µ l do material para cada injeção.
      Nota: No caso de 100 µ l por injecção, repita a etapa 1.1 com cálculo adequado dos ingredientes.

2. general Animal procedimentos

Nota: Os métodos alternativos para lidar com os ratos podem ser usados dependendo dos requisitos de laboratório e protocolos aprovados animal8. O tipo de ratos usado é camundongos C57BL/6 e fêmeas de 6 semanas de idade.

  1. Lista de materiais
    1. Preparar o líquido anestésico (isoflurano), máquina anestésica, câmara de inalação de dióxido de carbono (CO2), gaze esterilizada, fórceps, retenção de rato, luvas, enganchado fórceps, tesoura de dissecação de 1 polegada, tesoura dissecação de 2 polegadas, álcool para esterilização e seringa de insulina.
  2. Anestesia inalantes
    Nota: A anestesia é obrigatória para intranasal, subcutânea, Whitney e injeções intravenosas de ratos9. Uma câmara de indução com um tanque de máquina e oxigênio vaporizador ligado é usada para este procedimento.
    1. Colocar o animal na câmara de indução e certifique-se de fechar bem a tampa.
    2. O oxigênio a 1 L/min de fluxo e definir a configuração de vaporizador com um nível de indução de 4% de isoflurano.
    3. Variar o tempo de exposição de animais na câmara, dependendo do peso do animal; no entanto, mais de 10 s de exposição e de acompanhamento a cada 5 min é necessário para anestesia10.
      Nota: Sem pedal reflexo indica sucesso anestesia.
    4. Desligue o indutor de isoflurano e fluxo de 1 L/min de oxigênio para evitar a exposição pessoal ao gás de isoflurano.
  3. Sacrifício
    1. Preparar uma câmara para CO2 inalação de sacrifício em conformidade com o NIH "orientações para a eutanásia de roedores usando dióxido de carbono"11.
  4. Resposta de mordaça de teste para confirmar que o animal é totalmente sacrificado.
    1. Verifique se que o mouse é sacrificado beliscando a ponta do seu pé e confirmando sem resposta de mordaça. Se houver uma resposta, repita o passo 2.2.
  5. Desinfecção
    1. Desinfecte todas as áreas de superfície usadas para injeções ou dissecções com spray de álcool e gaze esterilizada.
  6. Armazenamento de órgão
    1. Use a pinça para remover toda a gordura e sangue que rodeiam os órgãos. Guarde estes tecidos colhidos individualmente em uma placa de Petri preenchida com 3 mL de PBS. O recipiente e a mídia pode ser diferentes dependendo dos requisitos do procedimento subsequente.

3. injeção rotas

  1. Use os métodos de injeção de seis para investigar respostas imunes de injeção-dependente: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa8,12,13.

4. isolamento de linfonodos e baço

Nota: Usar ratos magros jovens e saudáveis (6 semanas de idade) para esses procedimentos, porque as gorduras que se acumulam tipicamente em torno de gânglios linfáticos em ratos mais velhos são difíceis de remover e pode impedir a visualização adequada do órgão.

  1. Etapas pré-colheita
    Nota: Esta seção descreve a pós-injeção de colheita do iLN, baço e mLN de ratos para a análise de estimulação imune. Consulte os passos de 2.3-2.5 para sacrifício, amordaçar a resposta e métodos de desinfecção.
    1. PIN dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e esterilizar o lado ventral do mouse com etanol a 70%.
    2. Escolha um local 2 cm acima da área genital e uso viciado fórceps para puxar para cima a tampa exterior da pele, como uma tenda. Fazer um corte de aproximadamente 1 cm neste local e deslize a tesoura (2 polegadas) debaixo da pele, tornando ainda mais cortes de dissecação.
    3. Para o tegumento, corte verticalmente através da pele exterior com ambos os braços da tesoura (2 polegadas). Expor os órgãos internos cobertos com peritônio.
    4. Pino, a camada exterior da pele.
  2. Isolamento do linfonodo inguinal (iLN)
    1. Localize a iLN no lado esquerdo da perna seguindo a conjunção da embarcação de sangue descendo a perna esquerda, que aparece como uma letra inclinada 'Y'.
      Nota: Para os ratos injetados por via subcutânea, escolha uma iLN do mesmo lado do local da injeção.
    2. Descobri a camada com duas pinças para arrancar a camada lipídica coberto e colher a iLN amarela pálida (forma de feijão, 2 mm). Para posterior tratamento e armazenamento do tecido, consulte Etapa 2.6.
  3. Isolamento do baço 14
    1. Faça uma tenda no centro do peritônio, usando viciado fórceps em uma mão e usar pequenas fina tesoura (1 polegada) na outra mão para cortar o peritônio.
    2. Pinça de uso viciado na mão esquerda para agarrar o intestino e vire-a para localizar o baço como feijão vermelho (comprimento de cerca de 14 mm) anexado ao lado superior esquerdo do abdômen do mouse.
    3. Puxe delicadamente o baço com outro conjunto de pinça na mão direita enquanto desanexando outros órgãos com a pinça de viciado. Siga o passo 2.6 para armazenar o baço.
      Nota: Cuidado é necessário ao colher o baço, como é um órgão macio facilmente danificado.
  4. Isolamento do linfonodo mediastinal (mLN)
    Nota: O mLN está localizado a aproximadamente 1 cm abaixo das costelas e é coberto por outros órgãos como o coração e os pulmões. Devido à sua localização e tamanho pequeno, é importante expor cuidadosamente a área circundante, usando pinças e tesouras (1 polegada).
    1. Corte o diafragma e destacá-lo partir as costelas. Segure o corpo das costelas com fórceps e em seguida, corte o lado esquerdo e direito das costelas com tesouras (1 polegada). Coloque as costelas corte por cima do ombro do rato o direito de expor o coração e os pulmões.
      Nota: tenha cuidado para não cortar qualquer um dos vasos sanguíneos ao redor do coração e pulmões, como vazando sangue torna difícil localizar o minúsculo mLN translúcido. Se qualquer os vasos sanguíneos são cortados, suavemente, absorva o sangue na área com gaze.
    2. Usando fórceps viciado na mão direita, vire o coração e os pulmões suavemente para a direita até a espinha dorsal é exposta. Use um par de pinças regulares na mão esquerda para remover a iLN com a pinça viciada na mão direita para ajudar com esta colheita.
    3. Pegue os pulmões e lançá-los até a espinha dorsal é amplamente exposta. O mLN (uma translúcido em forma de feijão estrutura de aproximadamente 2 mm em tamanho) está localizado entre os pulmões e a coluna vertebral.
    4. Utilize o fórceps enganchadas para expor a área em torno do mLN e a outra pinça para extrair o tecido.
      Nota: O mLN está rodeado por inúmeros outros tecidos que devem ser cuidadosamente removidos com pinça antes da colheita.
    5. Consulte a etapa 2.7 para instruções em armazenar o mLN colhido.

5. preparação das amostras para citometria de fluxo

Nota: Para ensaiar a ativação das DCs no iLN colhida e baço, mLN, suspensões de célula única desses tecidos estão manchadas com anticorpos conjugados a fluorescência como DC específicos marcadores moléculas coestimulatórias e histocompatibilidade complexas moléculas e analisadas por citometria de fluxo.

  1. Preparação de suspensões de célula única: baço
    1. Adicionar 5 mL de meio de cultura fresco (CM) num prato de 6mm cultura e colocar as amostras no gelo.
    2. Remover os tecidos circundantes, sangue e gordura e coloque o tecido na tampa do prato a cultura.
    3. Corte os tecidos em pequenos fragmentos (< 1 mm) com uma tesoura curva. Suspender os fragmentos em PBS, seguido por girando para baixo o tecido usando uma centrífuga a 646 × g por 5 min e retirar o sobrenadante.
    4. Suspender as amostras novamente em 3 mL de CM e digerir os fragmentos com 200 µ l de solução de 2% fetal de soro bovino (FBS) suplementado com colagenase IV por 20 min.
    5. Homogeneizar e incubar a amostra a 37 ° C por 1 h. filtrar os tecidos digeridos através de malha de nylon (100 nm) e girá-los para baixo. Lavar as células únicas em 5 mL de PBS e remover o sobrenadante por centrifugação.
    6. Ressuspender as células em 5 mL de solução de isolamento de célula. Carrega novamente outra camada de 5 mL da solução de isolamento de células claras para formar uma pilha de camada por camada aquosa.
    7. Centrifugue a preparação da célula em 2012 × g por 10 min. obter o sobrenadante, que é a fração de densidade mais leve (< 1,077 g/cm3), para análise de citometria de fluxo subsequente.
    8. Conte o número de células com um hemocytometer.
  2. Preparação de suspensões de célula única: linfonodo
    1. Siga o passo 5.1.1-5.1.2.
    2. Adicione 5 mL de CM, usando uma pipeta de 10 mL para suspender as células pipetando 3 - 4 vezes. Após a suspensão completamente as células, usar o engranzamento de nylon estéril para filtrar as células para coleção em um tubo cônico de 15 mL.
    3. Girar as células para baixo a 646 ×g por 7 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
    4. Adicione um adicional 5 mL de CM em pipeta de 10 mL para melhor suspender as células pipetando.
    5. Lave com PBS e contar o número de células.
  3. Análise de citometria de fluxo
    1. Alíquota de 0.5-1 × 106 células para cada célula de fluorescência-ativado classificação tubo (FACS).
    2. Centrifugar a 646 × g a 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
    3. Adicione 5 µ l de cada diluição fluorescência-conjugado anticorpo preparação para as células para re-suspender o centrifugado e vortex.
      Nota: É importante proteger o centrifugado de exposição à luz, tanto quanto possível, porque os anticorpos fluorescente etiquetados são sensíveis à luz. Gerar uma mistura de mestre do anticorpo e sempre adicionar bloco Fc.
    4. Prepare o buffer de FACS usando 100 µ l de PBS, 1% de FBS regular inactivadas pelo calor e 0,1% de azida de sódio.
    5. Coloque a amostra no tubo a 4 ° C por 30 min. enxaguar as células com 2-4 mL de FACS buffer e centrifugar a amostra a 1700 rpm para 7 min a 4 ° C.
    6. Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de FACS no escuro. Analise as células por citometria de fluxo.

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Resultados

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Para avaliar rotas de injeção apropriado do INP para ativação de tecido linfático DC, a população de DC como linhagem foi definida como –CD11c+ células no baço, iLN e mLN e analisados os níveis de expressão de moléculas coestimulatórias. Tratamento de INP por subcutânea (s.c.) e injeção intravenosa (i.v.) promoveu um aumento substancial na expressão CD40, CD80 e CD86 no baço e iLN DCs (Figura 2B e 2C). ...

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Discussão

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Muitos avanços em nanotecnologia e Imunologia foram obtidos através de pesquisas terapêuticas de entrega da droga e imunoestimulação. A seleção cuidadosa do método de injeção é conhecida por ser importante para imunoestimulação, que foi o foco do presente estudo.

Rotas de injeção diferentes foram avaliadas para um naturalmente atóxico e biodegradável baseado em DNA material, INP (immunostimulatory nanopartículas), para determinar qual rota rendeu o melhor resultado. Essa abordagem também é rel...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de descoberta de materiais criativo através da nacional pesquisa Fundação da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e futuro planejamento (NRF-2017M3D1A1039421) e pelo programa de biotecnologia Marinha financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, República da Coreia e uma concessão (20150220).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
tampão fosfato solução salinaCorning21-040-CVRÓrgãos de lavagem
(PBS, pH 7.4)
solução de isoflurano Aesica Queenborough limited26675-46-7Processo de anestesia
Tuberculina seringa 1mL -JunglimN/AInjeção
50 mL tubo cônico Processo de anestesiaS.P.L50050
1mL Seringa de insulina (BD Ultra-FineTM­II)_short agulha324826Injeção Intramuscular
DMEM Hiclona de Alta GlicoseSH30081.01Armazenamento de órgãos
Histopaco  Análise FACS Sigma-Aldrich10771
Álcool etílico anidro 99,5 % Daejung4022-4110Desinfetante
Equipamentos
FineCycler C100 (Termociclador)Ssufine-Anealing
CentrífugaCentrífuga
FACS tubo Análise FALCON2052FACS
Citômetro de fluxo automatizado de alto desempenhoBD (EUA), análise FACSVerse-FACS

Referências

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