Summary
本文介绍了阿霉素快速球注射 129S1/SvImJ 小鼠实验性肾病综合征的诱导作用。我们还治疗肾病小鼠的缓释丸含有抑肽酶, 以抑制尿丝氨酸蛋白酶活性和防止钠保留。
Abstract
肾病综合征是蛋白尿肾病最极端的表现, 其特点是重蛋白尿, hypoalbuminemia, 水肿, 由于钠保留和高脂血症。为了研究这一综合症的病理生理学, 在注射了阿霉素等有毒物质造成足细胞损伤的基础上开发了啮齿动物模型。在小鼠中, 只有很少的菌株容易受到这种模型的影响。在 wildtype 129S1/SvImJ 小鼠中, 阿霉素通过快速静脉注射到球窦, 可诱发实验性肾病综合征, 包括钠保留和水肿在内的所有人类疾病症状。蛋白尿后, 小鼠的尿丝氨酸蛋白酶活性增加, 导致上皮钠通道 (ENaC) 的活化和钠的保留。缓释抑肽酶对尿丝氨酸蛋白酶的药理抑制作用废除 ENaC 活化, 防止钠的滞留。该模型是研究 proteasuria 的病理生理学的理想方法, i. e., 活性丝氨酸蛋白酶的排泄, 导致 ENaC 活化由其γ亚基的水解。这可以看作是蛋白尿肾脏疾病中 ENaC 活化和钠保留的主要机制。
Introduction
肾病综合征以重度蛋白尿、hypoalbuminemia、水肿、高脂血症为特征, 可视为蛋白尿肾病最极端的表现。在啮齿类动物中, 实验性肾病综合征可由单一注射 anthracyclines 或嘌呤霉素引起足细胞损伤, 类似于人的最小变化疾病和局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 1。在它的第一个描述以后在1955年由胡里奥·弗兰克et al。 2, 大鼠嘌呤霉素核苷肾病 (PAN) 已成为研究肾病综合征病理生理学的标准模型, 在许多研究中,3, 4, 5, 6.在小鼠中, 相应的模型可以由蒽阿霉素7诱导。然而, 有一个强大的应变依赖性, 是由至少两个遗传基因位点8决定的。此外, 肾病综合征的蛋白尿反应和病程有差异 9, 10.使用 129S1/SvImJ 小鼠和快速静脉注射阿霉素通过球窦, 蛋白尿反应达到的价值足以诱发肾病综合征的典型特点, 特别是体积保留特点腹水和几乎无钠尿7。实验性肾病综合征的钠保留被认为是在远端小管的上皮钠通道 (ENaC) 活化的结果, aberrantly 过滤丝氨酸蛋白酶, 如纤溶酶导致其γ亚单位的蛋白质降解4 ,11,12。最近, 这一概念被证明在肾病小鼠, 这是防止蛋白水解 ENaC 活化和钠保留的治疗与丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶, 同样有效的 ENaC 阻滞剂阿米洛利13。为了确保持续交付到远端小管, 抑肽酶是通过皮下植入缓释丸。未来的研究需要确定的丝氨酸蛋白酶, 负责蛋白水解 ENaC 活化的肾病综合征, 这被认为是平行的人的情况。为此, 阿霉素诱发的肾病综合征是一个有价值的模型, 可用于野生型小鼠或扩展到基因工程小鼠。其优点包括药物成本低、管理复杂性低、重现性好14。
本文通过快速静脉注射阿霉素对球窦的诱导和抑制尿丝氨酸蛋白酶的缓释微丸的植入, 证明了实验性肾病综合征用显色法测定的活动。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有的方法都是按照国家卫生研究院的指导, 对实验动物的护理和使用以及德国的动物福利法进行的, 并得到地方当局 (Regierungspräsidium Tübingen) 的批准。
1. 阿霉素注射液球窦诱导实验性肾病综合征
- 通过标记活塞的停止位置, 准备一个装有30G 套管的0.5 毫升注射器。
- 计算男性阿霉素的注射量 (7.25 µL/克体重 (体重) 等于14.5 µg/克阿霉素) 和雌性小鼠 (6.9 µL/克体重等于13.8 µg/克阿霉素) 根据从早上的体重。
注: 给定剂量适用于肾病综合征的诱导。剂量的细微变化导致了一个关键的不同病程的肾病从轻度慢性肾脏疾病, 只有小的变化, 肾小球滤过率 (12.6 µg/克阿霉素) 急性肾衰竭 (15.4 µg/g 生物武器阿霉素)7, 15。 - 在37摄氏度温暖的房间里加热计算出的阿霉素溶液 (2 µg/µL) 的数量。
注意: 阿霉素是有害的, 如果吞咽和可能导致癌症。如果与阿霉素合作, 避免皮肤接触, 一定要戴上手套。 - 预先填充与阿霉素溶液的注射器, 直到标记点, 并设置平衡为零。用注射量填充注射器, 通过称量注射器检查体积。
- Narcotize 用5体积% 异氟醚与2升/分钟的气化器和氧气流进行深度的小鼠。
- 注射前不要用眼膏。操作者需要清楚地看到轨道腔, 以执行安全和成功的球注射。
- 在开始注射前, 通过踏板反射评估麻醉的水平并调整麻醉分娩。
- 将鼠标放在右侧侧卧床, 其背部面向操作员的身体, 其头部面向操作员的注射手。
注: 该程序被描述为一个右手的人, 为左手的人执行注射与左手, 它是更容易做的位置和注射反向右向左。 - 通过对皮肤, 背部和腹侧的眼睛, 小心地将鼠标左眼球从眼窝上伸出。
- 穿刺左球窦从内眼角度 (内侧眼睑合生面)。避免与 mouse´s 眼球接触。
- 稍微倾斜注射器和注入整个体积一去。确保注入的体积没有任何阻力, 没有任何渗出迹象, 如 exopthalmus 或渗漏从注射现场。
- 由于阿霉素是一种剧毒物质, 每天至少检查一次, 使用一个评分表根据莫顿和格里菲斯et等。16 , 并特别注意注入站点。如果任何迹象如 exopthalmus, 眼睑关闭或任何坏死迹象如肿胀或皮肤病变发生注射后或在接下来的日子里, 老鼠应该被安乐死。
2. 含有抑肽酶的缓释微丸的植入
- 用每天需要的剂量和提前释放时间来订购颗粒。在抑肽酶的情况下, 选择每天1毫克的剂量, 在10天内释放。
注: 在本研究中, 抑肽酶颗粒含有10毫克的剂量。- 在干燥的条件下储存小球, 避免接触湿气。
- 为手术准备必需的物品, 包括一把剪刀, 一双皮肤准备剪刀, 一把手术刀, 手术镊子, 两对组织镊子, 一针支架, 和15厘米 monofile 缝合不可吸收。
- 使用热灭菌器对仪器进行消毒, 温度为240摄氏度5分钟。在使用仪器之前, 等待5分钟直到达到室温。
- 避免任何接触的消毒仪器提示菌表面。
- 用热器具避免皮肤灼伤。
- 使用热灭菌器对仪器进行消毒, 温度为240摄氏度5分钟。在使用仪器之前, 等待5分钟直到达到室温。
- Narcotize 小鼠与异氟醚5体积% 后跟1.5 体积% 使用蒸发器和氧气流量2升/分。
- 将鼠标放在一层纱布覆盖的升温装置上, 避免对鼠标造成热损伤。表面温度约为37摄氏度。
- 用药膏保护眼睛。
- 将中间背部的头发移开大约0.5 厘米2的区域, 使用剪刀或理发器, 并用适合皮肤消毒的消毒剂对无毛皮肤进行消毒。去除尽可能少的头发, 所以它保持更困难的鼠标到达伤口和线程结束后, 保持体温。
- 用手术刀在颅尾骶部切开无毛的皮肤, 长度约为5毫米. 用钝制剂制备皮下结缔组织约1厘米深的左侧侧囊。
- 通过踏板反射评估麻醉的水平, 并在必要的手术前调整麻醉分娩。
- 用无菌组织镊子将一个10天的释放小球插入准备好的左外侧囊中。把小球放在袋子底部的平面位置。
- 避免任何接触的颗粒到流体和湿度, 直到放置在准备袋。
- 用2-3 缝线缝合皮肤。只留下非常短的螺纹末端使它更加困难为老鼠切开缝合通过啃。
- 单独放置小鼠以减少术后窘迫, 防止伤口裂开。保持鼠标的视线, 直到它恢复了足够的意识后麻醉。
注意: 没有必要的术后疼痛管理, 因为这种干预是良好的耐受性, 没有任何迹象的不适或疼痛。另外, 我们建议外用止痛药, 如在关闭前一滴布比卡因, 这将提供多达8小时的镇痛。
3. 评估模型归纳、肾病综合征和福祉的迹象
- 每天从注射日起, 通过按摩膀胱来收集晨尿 (上午08:00) 到反应杯 (1.5 毫升)。
- 采用布拉德福德蛋白测定法测定蛋白尿, 并规范化为肌酐。
注: 对于肾病综合征的诱导, 蛋白尿应达到120毫克/毫克肌酐的阈值在7天和10后的阿霉素注射液。
- 采用布拉德福德蛋白测定法测定蛋白尿, 并规范化为肌酐。
- 寻找腹水的发展。检查腹部周长或悬垂侧面的增加。
- 每天早上 (上午08:00) 称鼠标、食物颗粒和饮水瓶。
- 根据莫顿和格里菲思et, 每天至少检查一次, 使用评分表。16
4. 显色法测定尿丝氨酸蛋白酶
- 通过将15毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 加入25毫克的 lyophilised 显色基质 S-2251, 制备基板工作溶液, 产生浓度为2毫米。在 PBS 中溶解抑肽酶以获得2毫克/毫升浓度的抑肽酶溶液。
- 存储准备好的解决方案在-20 摄氏度。这大大减慢了 S-2251 的自动降解速度。不要使用带有强烈黄色阴影的旧解决方案。
- 使用新鲜准备或解冻的基板工作解决方案, 并在37摄氏度热室加热。
- 在室温下解冻尿样。
- 避免重复解冻和冷冻, 防止蛋白酶的降解。将尿样贮存在摄氏-20 摄氏度。
- 使用 96 microwell 板, 适用于光度测量。在两个井中添加3µL 的未稀释尿液, 并添加50µL 的基板工作溶液, 3 µL 的 PBS 或抑肽酶溶液的水井。用钢板封口机盖上盘子。
- 在37摄氏度热室中孵化覆盖的 microwell 板60分钟。
- 使用微板块读取器测量每一个井的光学密度, 在 450 nm。
- 取无抑肽酶的 OD 与抑肽酶作为尿抑肽酶敏感的丝氨酸蛋白酶活性的差异。
注: 对具有和不带抑肽酶的配对样品的测量增加了测定的特异性, 因为基体也可以被其他不起病理生理作用的蛋白酶所切割。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在异氟醚麻醉诱导后, 阿霉素通过左球窦快速注射。整个体积的7.25 µL/克体重注射没有任何阻力和渗出证明正确的静脉插管位置。老鼠从麻醉迅速地恢复了, 并且没有损伤在那天和尔后。特别是, 左眼没有损伤的迹象。在阿霉素注射液后, 由于阿霉素的一般毒性作用和此后恢复 (图 1a), 食物和液体摄入量在头3天下降。在注射后的头3天内, 由于不振 (图 1b), 鼠标失去了3.4% 的体重。从 5th天开始, 鼠标开发了标记的蛋白尿 (图 1c), 随后出现大量的尿钠排泄, 尽管有足够的食物摄入量 (图 1a, b)。这种钠的保留导致体重从3天到10天的巨大增加 22.2%, 并伴有腹水。由于蛋白尿, 鼠标开发了 hypoalbuminemia (图 1c)。在10天服用的血浆样本中, 高脂血症是可见的。这些数据表明, 阿霉素给球窦迅速和令人印象深刻的诱导一个全面的肾病综合征 wildtype 129S1/SvImJ 小鼠。
实验性肾病综合征的钠保留与 ENaC 的活化有关, 如纤溶酶11, 12.如果这一概念成立, 那么抑肽酶对尿丝氨酸蛋白酶的抑制作用应能防止 ENaC 活化和钠保留。为了研究抑肽酶对 ENaC 活化的影响, 我们用抑肽酶治疗肾病小鼠。由于抑肽酶快速清除肾小球过滤, 我们选择药物管理使用缓释丸, 以确保持续提供的抑肽酶在远端小管超过10天。在阿霉素注射液后的第三天, 一只老鼠被植入了一个含有抑肽酶的小球, 控制小鼠在异氟醚麻醉下接受了安慰剂颗粒。动物恢复迅速形成麻醉和伤口愈合没有任何问题。从5天起, 蛋白尿在两个小鼠中发展到类似的程度 (图 2a)。然而, 只有安慰剂治疗的肾病小鼠经验丰富的钠保留 (图 2b) 和体重增加 (图 2c) 表明 ENaC 激活。相比之下, 抑肽酶处理的小鼠被保护不受钠保留和体重增加 (图 2b, c)。这清楚地表明, 尿丝氨酸蛋白酶活性是导致钠保留的肾病综合征。
用 ELISA 法测定尿液和血浆中的抑肽酶浓度。如图 3a所示, 尿抑肽酶浓度在植入后不久就会达到峰值, 此后就会恒定。平均尿抑肽酶浓度为 207, 29 µg (32, 4 µM), 而血浆抑肽酶浓度10天后的治疗是13µg/毫升 (2 µM), 这是可比的血浆浓度达到了抑肽酶治疗的患者17。利用实验性肾病综合征的尿样显色法测定抑肽酶对尿丝氨酸蛋白酶活性的影响。这种测定是基于在释放对硝基苯胺的基质中的肽键的水解, 可以很容易地通过光度法检测 450 nm。如图 3b所示, 由安慰剂治疗的肾病小鼠与蛋白尿的发生平行, 丝氨酸蛋白酶活性迅速增加。相比之下, 在图 2b、c中, 抑肽酶治疗的肾病小鼠的尿丝氨酸蛋白酶活性完全受到抑制, 与预防 ENaC 活化和钠保留相吻合。
图 1: 实验性肾病综合征诱导前后的食物和液体摄取过程 (a)、尿钠排泄和体重 (b)、蛋白尿和血浆白蛋白浓度 (c).在阿霉素后的头三天食物和液体摄取量下降后, 老鼠的摄入量几乎是恒定的。五天后, 蛋白尿的发展开始和达到7天至10之间的肾病阈值, 导致全发性肾病综合征, 水肿形成, 钠保留和 hypoalbuminemia。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 蛋白尿 (a) 的病程, 尿钠排泄 (b) 和体重 (c) 在一只老鼠治疗后, 在3天服用抑肽酶或安慰剂丸后, 阿霉素注射液.尽管蛋白尿的发展在相似的程度上抑肽酶保护抗钠保留和水肿形成由 ENaC 活化在肾病综合征期间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在注入抑肽酶血浆浓度后, 尿抑肽酶浓度的变化过程.用步骤4中描述的显色测定法测定尿丝氨酸蛋白酶活性的过程。尿抑肽酶浓度在植入后很快就会达到峰值, 此后是恒定的。在肾病综合征中, 丝氨酸蛋白酶活性在尿液中迅速增加, 与蛋白尿的发生平行。抑肽酶体内防止尿丝氨酸蛋白酶活性增加。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里, 我们证明阿霉素注射液通过球窦注射诱发实验性肾病综合征的 129S1/SvImJ 小鼠蛋白尿, 钠保留, hypoalbumenia 和高脂血症。但是, 在使用此模型时, 必须考虑到两个关键问题。首先, 模型的诱导是严格的剂量依赖性和偏差的阿霉素剂量为0.3 µg/克影响的响应小鼠15。当注射低剂量, 如14µg/克或以下, 阿霉素只导致非肾病蛋白尿, 不与显性钠保留, 腹水和高脂血症。相反, 注射更高剂量会导致急性肾衰竭和高急性死亡率。根据小鼠的剂量和反应, 阿霉素引起一门类似人急性肾损伤 (G1-3)、肾小球滤过率 (CKD 期的慢性肾病) 或渐进性慢性肾脏疾病的病程, 减少肾小球滤过率 (CKD G4-5) 导致尿毒症7,15。
其次, 该模型仅限于某些小鼠菌株, 广泛使用的 C57Bl/6 菌株抗性为8。此外, 在回交期间可能存在的遗传学污染可能会导致显著降低反应速度。这可以通过增加阿霉素剂量来避免在一定程度上。但是, 用于模型诱导的阿霉素剂量 (14.5 µg/克) 已经接近于15-17 µg/克的生物武器在这个应变7,18之间的描述的 LD50。
使用这个老鼠模型打开了研究不同的高度创新的问题关于肾病综合征的可能性, 从蛋白尿和水肿形成到内分泌 dysregulations 和肾脏贫血15。从这个意义上说, 阿霉素诱发的肾病覆盖广泛的人类 CKD, 是一个很好的替代目前的模式在肾脏病研究, 如5/6 肾切除19,20或单侧输尿管结扎21。此外, 还可以将该模型应用于基因工程小鼠, 研究某种感兴趣基因在模型过程中的作用, 如缺乏血清和糖皮质激素激酶 1 (SGK1)7或其他许多。
所提出的模型的一个特殊特征是 proteasuria 的发生, i. e., 活性丝氨酸蛋白酶的排泄, 通过其γ亚基的水解而导致 ENaC 活化。这导致了几乎无钠尿的排泄和容量保留特征以快速的体重增长和腹水的发展在 proteasuria 的发病以后。然而, 这种现象是短暂的, 15 天后, 小鼠自发松动腹水和体重, 虽然蛋白尿仍然存在。然而, 原因仍然难以捉摸。在肾病大鼠的研究中也发现了这种自相矛盾的行为4 , 似乎是啮齿动物实验性肾病综合征的一个基本特征。
用一种简便、快速的显色法测定尿丝氨酸蛋白酶活性。它是基于对氨基硝基苯胺键的水解, 链接到4氨基酸长度的肽, 可由不同的蛋白酶劈裂。一般而言, 显色基质不是特定的蛋白酶, 并有大量的重叠的蛋白酶, 切割特定的基质。这里使用的基质是一个首选的基质的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶, 如纤溶酶或血浆激肽酶22。为了增加特异性, 蛋白酶的活动应始终由配对的样本, 并没有抑制剂23,24。本研究应用抑肽酶对胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性进行了定义。通过从差异中计算抑肽酶敏感活性, 其他蛋白酶的活性被取消。用抑肽酶在体内治疗肾病小鼠, 尿丝氨酸蛋白酶活性没有增加, 最重要的是与废除钠保留相吻合。因此, 尿丝氨酸蛋白酶活性不仅是肾病综合征钠保留的原因, 而且还可作为预测肾病综合征中丝氨酸蛋白酶抑制剂疗效的生物标志物, 这可能成为一种新的治疗方法, 在肾病综合征的治疗。在研究中由 Bohnert et al。13, 丝氨酸蛋白酶抑制剂 camostat 和纤溶酶缓蚀剂氨甲环酸在防止钠潴留的同时, 不符合规范化尿丝氨酸蛋白酶活性的作用。
虽然阿霉素是一种剧毒物质, 但球注射液是安全的, 与损害动物福祉的任何伤害无关。有人可能会说, 尾静脉注射将是一个更合适的方法, 以减少动物的痛苦。在比较研究中, 我们发现, 通过尾静脉注射阿霉素是低于球路线, 由于更高的率小鼠没有发展肾病综合征 (34% 非应答者) 相比, 由球的路线诱导 (0-15% 个非响应方)。此外, 尾静脉注射蛋白尿降低了钠的保留率。这可能是由药代动力学的差异和高浓度的阿霉素在快速球注射后取得的, 这对于模型诱导的足细胞损伤是必不可少的。然而, 必须强调的是, 球注射需要一个高技能和经验丰富的操作员, 以避免并发症与渗出甚至分钟的阿霉素。
总之, 阿霉素实验性肾病综合征是 129S1/SvImJ 小鼠蛋白尿肾脏疾病的一个多才多艺的模型, 允许调查高度当前的科学问题, 最重要的是 proteasuria。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了德国研究基金会 (DFG, AR 1092/2-1) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
