Microscopia de luz-folha para visualização tridimensional de células do sistema imunológico humanas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar as células imunes, incorporadas em uma matriz de colágeno (3D) tridimensionais usando microscopia de luz-folha. Este protocolo também elabora como controlar migração celular em 3D. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células na matriz 3D.

Abstract

In vivo, ativação, proliferação e função de todas as células do sistema imunológico ocorrem num ambiente tridimensional (3D), por exemplo, nos gânglios linfáticos ou tecidos. Até à data, a maioria em vitro sistemas depende de bidimensional (2D) as superfícies, tais como placas de cultura de células ou lamelas. Otimamente imitar condições fisiológicas em vitro, utilizamos uma matriz de colagénio 3D simples. Colágeno é um dos principais componentes da matriz extracelular (ECM) e tem sido amplamente utilizado para constituir as matrizes 3D. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único plano) é caracterizada com aquisição de alta velocidade, profundidade de grande penetração, branqueamento baixa e fotocitotoxicidade. Além disso, a microscopia de luz-folha é particularmente vantajosa para medição de longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo otimizado como configurar e manipular células do sistema imunológico humanas, por exemplo, primário humanos linfócitos T citotóxicos (CTL) e na matriz de colagénio 3D para uso com a microscopia de luz-folha para a imagem latente de célula viva células assassinas naturais (NK) e amostras fixas. O procedimento de aquisição de imagem e análise de migração celular são apresentados. Especial atenção é dada para destacar os passos críticos e factores para a preparação da amostra e análise de dados. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células em uma matriz de colagénio 3D e não está limitado às células do sistema imunológico.

Introduction

Mais conhecimento sobre a migração células vem de 2D experimentos^1,2,3, que normalmente são realizados em um vidro ou superfície plástica de uma cultura/imagem prato. No entanto, um cenário fisiológico requer, na maioria dos casos, um microambiente 3D, em que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel decisivo. ECM não só fornece a estrutura 3D essenciais para manter a morfologia celular adequada, mas também oferece sinais de sobrevivência ou pista fiável para um óptimo funcionamento de muitas células^4,5 . Portan....

Protocol

Pesquisa realizada para este estudo com o material humano (câmaras de sistema de redução de leucócitos de doadores de sangue humano) está autorizada pelo Comitê de ética local (declaração de 16.4.2015 (84/15; Prof Dr. Rettig-Stürmer)) e segue as diretrizes correspondentes.

1. preparação da solução neutralizada de colágeno (500 µ l)

1. Transferi 400 µ l de solução colágeno refrigerados (10,4 mg/mL) para um tubo estéril 1,5 mL sob o capô de cultura de células. Lentamente, adicione 50 µ l de refrigerados 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 µ l de solução-mãe de colágeno refrigerados. Misture a solução por telha suavemente o tubo.
   Nota: Todos....

Results

Formação de protrusão durante a migração de células T é um processo altamente dinâmico, que é dependente de actina. Para visualizar a formação de protrusão de CTL humana primária, nós transfectadas transitoriamente uma proteína mEGFP fundido para rotular o citoesqueleto de actina no CTL conforme descrito antes das¹¹. Um dia depois de transfeccao, as células foram incorporadas na matriz de colágeno. Pilhas de imagem foram adquiridas todos os 40 s com um tamanho de p.......

Discussion

A maioria em vitro ensaios é realizada em uma superfície 2D, por exemplo em placas de cultura de células, pratos de Petri ou em lamelas, Considerando que na vivo as células, especialmente células imunitárias, principalmente um microambiente 3D a experiência. Emergentes a evidência mostra que os padrões de migração das células imunitárias diferem entre 2D e 3D de cenários¹⁷. Além disso, os perfis de expressão de células tumorais também são diferentes em 2D e 3D-cultivadas tecidos<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, solução de colágeno bovino	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Matriz de colágeno
0.5 M Solução de NaOH	Merck	1091381000	para neutralizar solução Fibricol
Ácido de fusão ultra-baixo	Affymetrix	32821-10GM	Preparação de amostras em baixo c[Col]
Dynabeads Kit de Células T CD8 Humanas Intocadas	Thermo Fisher	11348D	Isolamento de células T CD8+ humanas primárias de PBMC
Dynabeads Ativador T humano CD3/CD28 para expansão e ativação de células T	Thermo Fisher	11132D	Ativação de populações CTL
Interleucina-2 recombinante humana	Thermo Fisher	PHC0023	Estimulação de CTL P3 cultivado
Kit de solução primária	Lonza	V4XP-30XX	Transfecção
α-PFN1 anticorpo, coelho, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Faloidina	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Mancha de membrana plasmática laranja	Thermo Fisher	C10045	Etiqueta celular fluorescente
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate tampolado com solução salina	Thermo Fisher	14190250	IF
Albumina de soro bovino	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Coelho 568, IgG, coelho	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Microscopia de folha de luz)	Zeiss	N.A.
Capuz de cultura de células	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Incubadora de cultura de células HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrífuga 5418 e 5452	Eppendorf	N.A.
Pontas Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
Tubos de 15 mL	Sarstedt	62.554.002
Capilares 50 µ L	VWR (Marca)	613-3373	Zeiss LSFM preparação de amostras
Êmbolo para capilares	VWR (Marca)	BRND701934	"Carimbos com ponta de Teflon" Preparação de amostras LSFM
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	para testar o pH de seringas Fibricol BD
Plastipak 1mL	BD	Z230723  ALDRICH	Preparação alternativa de amostras
Argila de modelar (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Conversor de arquivos Imaris	Bitplane	disponível em http://www.bitplane.com	Converta arquivos de imagem para o formato de arquivo Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	disponível em http://www.bitplane.com	Análise de dados de imagem 3D e 4D