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Artigo de método

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

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DOI:

10.3791/57661

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1 de julho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.

Resumo

Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.

Introdução

Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da célula através de de orientação contato7 e induz a reorganização do citoesqueleto para mudar de forma, além de aderências focais e rigidez de células8.

Células progenitoras endoteliais humanas (hEPCs) no corpo interagem estreitamente com o microambiente do ECM circundante9. Isso indica que o estado físico de ECM atua como um parâmetro importante para a formação de complexos adesão célula-matriz específica como tensão de cisalhamento derivado de fluxo de sangue10. É relatado que nanotopography superfície aumenta a formação de redes de tubo capilar extensa de hEPCs11 em vitro e que um fator solúvel ECM/bio combinado sistema permite hEPCs reconhecer substratos disfuncionais e promove ferida cura12,13. No entanto, a relação entre ECM e hEPCs não é claramente entendida.

Embora muitos pesquisadores tentaram esclarecer a relação entre as respostas de célula e sinais físicos de diferentes substratos14,15,16, estes estudos usado apenas o tamanho fixo de um nanostructure ou nanopatterns com arranjos irregulares que possuem uma limitação para elucidar a relação entre o tamanho do comportamento nanostructure e celular. O problema é a falta de instrumentos adequados para a seleção de respostas celulares que podem substituir as abordagens existentes tediosas e iterativas para encontrar o tamanho ideal do nanostructure. Portanto, uma técnica simples é necessária para reações de célula em estímulos físicos sem repetição de triagem.

Aqui, descrevemos um método usado em nossos anteriores relatórios17,18,19 , para produzir um gradiente nanopattern em que o diâmetro da nanopillars arranjado aumenta gradualmente. Além disso, também descrevemos como cultivar e analisar o comportamento de hECFCs em placas de gradiente nanopattern para determinar o efeito de estímulos físicos sobre as células. Um suave anodização, gravura gradual e método de revestimento de camada decolagem foram usados para fabricar o molde AAO gradiente. Adotando uma térmica impressão técnica de litografia, nanopatterns gradientes poliestireno idênticos foram produzidas de forma econômica e fácil. Usando gradiente nanopatterns, é possível determinar qual o tamanho de nanostructure tem um grande efeito sobre o comportamento da célula em um conjunto de experiência. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil na compreensão dos mecanismos de interação entre hECFC derivados de sangue ou outras células e vários tamanhos de nanoestruturas.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional Hospital Coreia universitário Anam (IRB no. ED170495). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a declaração de Helsinki e suas alterações posteriores.

1. preparação do substrato de alumínio (Al) por polimento electrolítico

Atenção: Solução de polimento electrolítico é corrosivo e tóxico. Use equipamento de proteção pessoal, incluindo luvas de nitrila, óculos e jaleco. Execute esta etapa em uma coifa.

  1. Preparar a solução de polimento electrolítico através da mistura de etil álcool (C2H5OH, 99,9%) e ácido perclórico (HClO4, 60%) num copo de revestimento duplo de 1L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Conectar o copo duplo revestimento para um circulador e definir a temperatura a 7 ° C. Colocar o copo duplo revestimento em um agitador magnético. Deixar a solução sob agitação durante pelo menos 30 minutos até que a temperatura cai para 7 ° C.
  3. Mergulhe a placa Al ultrapura (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) e eletrodo contador de carbono para a solução de polimento electrolítico usando clipes de crocodilo e fio de cobre. Ajuste a posição da placa do Al e o elétrodo contrário de carbono que nos enfrentar.
    Nota: É necessário instalar os clipes com cuidado para não tocar a solução. Quando em contato com a solução, fluindo de clips de impurezas podem contaminar a placa de Al.
  4. Conecte a placa de Al para o terminal positivo e o eletrodo contador de carbono para o terminal negativo, de uma corrente contínua (DC) fonte de alimentação.
  5. Desligue o agitador magnético e aplicar uma tensão de 20 V. manter esse estado por 4 min.
  6. Ligue o agitador magnético e permitir que a corrente flua por mais 6 minutos.
    Nota: A condição estática remove a maioria das impurezas e rugosidade da chapa de Al, e a condição dinâmica melhora a qualidade final do polimento electrolítico.
  7. Desligue a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Rigorosamente, lave a placa de Al com água desionizada para remover todos os restante da solução.
  8. Seque a placa de Al com nitrogênio e loja sob gás inerte. Conduza este processo de secagem no final de todas as experiências na etapa 1 e 2.
    Nota: Ao injetar ar comprimido, certifique-se de fluxo de ar da parte polida para o lado oposto. No caso contrário, impurezas podem escapar da parte não-polido e contaminar a placa de Al.

2. fabricação do molde de gradiente AAO com o eletrólito de ácido fosfórico

Atenção: Álcool metílico e seus fumos são tóxicos ocular. Contínua exposição ao crómio pode levar a intoxicação por cromo grave. Execute esta etapa em uma coifa.

  1. Anodização primária
    1. Para preparar 1 L de eletrólito de ácido fosfórico, carrega 590 mL de água destilada em uma garrafa de vidro.
    2. Adicione 400 mL de álcool metílico (CH3OH, 99%) e 10 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) para o frasco de vidro. Misture a solução bem agitando manualmente ou com agitação magnética.
    3. Despeje num copo de revestimento duplo de 1L 500ml do eletrólito. Imergir o polido Al prato e carbono elétrodo contrário a solução com clipes de crocodilo e fio de cobre.
    4. Despeje o eletrólito adicional para localizar o limite de polimento electrolítico 2-3 mm acima da superfície da solução.
      Nota: Se anodização é efectuada com o limite de polimento electrolítico tocar a solução, a placa de Al tende a queimar durante a anodização.
    5. Instale um eixo vertical em um pedestal em forma de U. Anexe um agitador sobrecarga e impulsor usando grampos de metal. Posição da hélice do rotor perto da extremidade inferior de ambos os eletrodos. Defina a velocidade de rotação do agitador sobrecarga entre 200 e 300 rpm.
    6. Conectar o copo duplo revestimento para um circulador e seleccionar a temperatura de-10 ° c. Deixe o sistema pelo menos 1 h, sob agitação até a temperatura desce a-10 ° C.
      Nota: Não use água como líquido de arrefecimento. Porque a água congela em baixas temperaturas, a circulação não funcionará normalmente. Recomenda-se usar uma mistura de água e álcool etílico na proporção de 1:1 como o líquido de arrefecimento.
    7. Aplica uma tensão de 195 V sob agitação por 16 h.
      Nota: Se a corrente sobe mais de 50 mA dentro de 2 ou 3 h após a aplicação da tensão, que queima irá ocorrer a probabilidade é muito alta. Imediatamente parar o processo e substituir a placa de Al com um novo. Se esse problema ocorrer repetidamente, verificar que não há nenhuma anormalidade no controle de temperatura do circulador. Se não há nenhuma anormalidade, mude o eletrólito.
    8. Parar a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Lave a placa de Al anodizada com água desionizada para remover todos os restante da solução.
  2. Gravura da alumina
    1. Prepare o ácido crômico, ácido solução dissolvendo 9,0 g de óxido de cromo (CrO3) e 20,3 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) em 500 mL de água desionizada.
    2. Despeje a solução de condicionamento para o copo de jaqueta dupla 1 L. Seleccionar a temperatura de 65 ° c.
    3. Mergulhe a placa Al anodizada na solução de condicionamento pelo menos 10 h, sob agitação. Sele o topo do copo com folha de alumínio.
    4. Lave a placa Al gravada várias vezes com água desionizada.
  3. Anodização secundária
    1. Defina as mesmas condições experimentais como passo 2.1.1 para 2.1.7.
    2. Carregar a placa de Al gravada para o ânodo do sistema e aplicar uma tensão de 195 V para 6 h. Em seguida, desligue a alimentação e separar manualmente a placa de Al do clip. Lave imediatamente a placa Al anodizada com água desionizada.
      Nota: Quando o tempo de lavagem é atrasado, o tamanho dos poros da AAO involuntariamente aumenta devido o ácido fosfórico residual.
  4. Alargamento dos poros gradiente
    1. Prepare uma solução de alargamento dos poros, dissolvendo 5,765 g de ácido fosfórico em 500 mL de água desionizada. Despeje a solução num copo de revestimento duplo de 1 L.
    2. Conectar o copo duplo revestimento para o circulador e definir a temperatura a 30 ° C. Um palco em movimento linear verticalmente ao lado o copo de lugar. Fixe um suporte para a parte móvel da fase linear.
    3. Defina a parte móvel da fase linear para a posição inicial. Prender o clipe para o suporte e carregar a placa de Al anodizada.
    4. Manipule a posição da placa de Al manualmente para que a placa de Al virá bem acima da superfície da solução.
      Nota: Nesta etapa, a placa de Al não deve tocar a solução. O poro alargamento processo começa assim que a placa de Al atinge a solução.
    5. Mergulhar a placa Al gradualmente a solução a uma velocidade de 4,86 µm/s para 120 min fazer um molde AAO de 35 milímetros com um tamanho de gradiente de 120 nm a 200 nm (GP 120/200). Inicie um cronômetro no momento que a placa Al toca a superfície da solução.
    6. Para fazer moldes de GP 200/280 e GP 280/360, mergulhe toda a área do molde de GP 120/200 nos poros alargamento solução para 2 ou 4 h, respectivamente.
    7. Lave a placa Al gradiente várias vezes com água desionizada.

3. deposição de camada de decolagem no molde de gradiente AAO com self-Assembled Monolayer

Nota: Execute etapas 3.2.1 para 3.3.3 em uma caixa de luva. Conecte uma bomba de vácuo e injector de gás nitrogênio seco para o porta-luvas. Coloque todas as amostras, reagentes e aparelhos no porta luvas antes do processo de desumidificação. Repita o ciclo de injeção de gás de evacuação e nitrogênio mais de três vezes para remover a umidade adequada de luvas. Deixe o nitrogênio seco flua através do experimento.

  1. Modificação de hidroxila de molde AAO com tratamento de Piranha
    1. Despeje 140 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 95%) num copo de politetrafluoretileno (PTFE). Adicione 60 mL de gota a gota de peróxido de hidrogênio (H2O2, 30%). Deixe por 30 min até arrefecer a solução.
      Atenção: Tenha muito cuidado ao fazer solução de Piranha. Desde o momento da adição de peróxido de hidrogênio, a solução vigorosamente ferve e gera altas temperaturas. Realizar o experimento em uma coifa.
    2. Mergulhe o molde AAO na solução por 30 s usando uma pinça não metálica.
    3. Lave o molde AAO várias vezes com água desionizada. Mergulhe o molde em água desionizada para 30 min e colocá-lo em álcool metílico por mais 30 minutos.
      Atenção: Quando se desfizer da solução Piranha, dilua a solução com uma quantidade abundante de água da torneira.
    4. Seque completamente o molde AAO sob vácuo para 3h.
  2. Preparação da solução estoque de HDFS × 20
    Nota: HDFS é uma abreviação de (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silano
    1. Encha um terço de uma garrafa de n-hexano 1L com peneiras moleculares. Tapar o frasco com a película de parafina e armazená-lo sob nitrogênio seco por 24 h.
    2. Filtre os 200 mL de n-hexano utilizando uma seringa de vidro e filtro de seringa 0,2 µm PTFE.
    3. Despeje a 80 mL de n-hexano filtrado em um frasco de vidro de 100 mL. Adicione 2 mL de HDFS.
  3. Deposição de monocamadas auto montado
    1. Carrega 57 mL de n-hexano filtrada em um copo de 100 mL. Mergulhe o molde AAO o solvente.
    2. Adicione 3 mL de solução-mãe HDFS para o n-hexano para fazer 2,9 mM HDFS solução. Espere 10 min para a reação prosseguir.
    3. Transfira o molde da AAO para fresco n-hexano. Fechar e selar todos os frascos de reagente. Feche a válvula de nitrogênio e, em seguida, puxe para fora as amostras da caixa de luva.
      Nota: HDFS é extremamente sensível à umidade. Armazene todos os reagentes que contenham HDFS num exsicador.
    4. Mergulhe o molde AAO em 60 mL de methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Proceder a limpeza do molde AAO num copo para 10 s por um tempo para remover fisicamente adsorvida moléculas HDFS. Repita o procedimento de limpeza 10 vezes.
      Nota: Expondo o molde da AAO de ultra-som por um longo tempo sem intervalos irá danificar a camada de óxido.
    5. Seque completamente o molde AAO sob vácuo durante 24 h.
      Nota: Uma camada de decolagem com sucesso depositada é estável por meses quando armazenado num exsicador e super repelente de água. O protocolo pode ser pausado aqui.

4. fabricação de placas de gradiente Nanopattern pela impressão térmica

Nota: Execute etapas 4.2 para 4,7 em uma sala limpa.

  1. Corte uma folha de isopor grossa 1,1 mm para um tamanho de 2,9 mm de largura por 3,7 mm de comprimento, usando um cortador de placa (PCB) de circuito impresso.
  2. Corte o molde da AAO 35mm do fundo usando uma pinça. Marca o nome de amostra e data de fabrico no verso.
  3. Limpe uma bolacha 8.0" com uma pequena dose de álcool etílico. Coloque as folhas de poliestireno sobre a bolacha e, em seguida, monte o molde da AAO.
  4. Colocar o filme de fundo na gaveta de uma impressora térmica. Anexe o filme top para a junta.
  5. Colocar a bolacha sobre o filme de fundo. Coloque a junta sobre a bolacha. Certifique-se de que não há nenhuma poeira sobre a bolacha.
  6. Feche a gaveta da impressora térmica. Aplicar a 165 ° C de calor e 620.52 kPa de pressão para 100 s.
  7. Refrigerar a amostra à temperatura ambiente. Torça delicadamente a folha de isopor para liberar o molde AAO.

5. esterilização e hidrofílica modificação do gradiente Nanopattern placas

  1. Coloca as placas de nanopattern em um prato quadrado. Despeje 100 mL de álcool etílico a 70% e expor à luz ultravioleta por 30 min.
  2. Seca as placas de nanopattern com nitrogênio. Transferi as placas de nanopattern para um gerador de plasma de oxigênio.
  3. Evacuar a câmara até atingir 1.33 PA. Em seguida, injetar o oxigênio a uma taxa de 30 cm3/min. aplicam-se uma potência de rádio frequência de 60 w. manter o plasma de oxigênio para 90 s.
    Nota: Recomenda-se usar placas nanopattern tratados com plasma dentro de 14 dias.
  4. Fixe a placa de nanopattern no fundo de um prato de cultura de células usando uma gota de tolueno.
  5. Selar as amostras em uma bolsa e esterilizar com esterilizador de plasma de baixa temperatura.

6. cultivo de hECFCs

Nota: Realizar todos os procedimentos de centrifugação a 4 ° C a menos que indicado o contrário.

  1. Antes de isolar o sangue periférico (PBMC), de células mononucleares incubar numa placa de cultura de 12-poços de colágeno-revestido a 37 ° C por 1h.
  2. Lave o prato de cultura 12-poços utilizando 1 × de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
  3. Colete 50 mL de sangue humano, usando um tubo de inibidor de heparina.
  4. Colocar um tubo de 15 mL 6 mL de solução de polissacarídeo hidrófilo e adicionar 8 mL de sangue para a solução de polissacarídeo hidrófilo.
    Nota: Lentamente, pipete o sangue para a solução de polissacarídeo hidrófilo.
  5. Centrifugar o tubo a 1020 x g por 20 min para as células de Pelotas.
  6. Colha a camada de células opaco e transferir para um novo tubo de 15 mL.
  7. Adicionar 10% de soro fetal bovino (FBS)-contida PBS e centrifugar o tubo a 1020 x g durante 10 minutos para as células de Pelotas.
  8. Remover o sobrenadante e adicionar tampão de lise celular-vermelho-sangue. Manter-se no gelo por 5 min.
  9. Adicionar 10% FBS-contido PBS e centrifugar o tubo a 1020 x g por 5 min para as células de Pelotas.
  10. Remover o sobrenadante e adicionar 10% FBS-contido PBS. Centrifugar o tubo a 1020 x g por 5 min para as células de Pelotas.
  11. Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio de expansão de células endoteliais suplementado com 10% FBS. Sementes de 8,0 × 106 células por poço para cada prato de colágeno-revestido.
  12. Altere o meio de cultura todos os dias durante 1 semana. Em seguida, altere o meio de cultura em 2 dias.
    Nota: hECFCs pode ser encontrado após cultura dia 10-14. hECFCs mostrar morfologia típica, como paralelepípedos e formam uma colônia que pode ser observada em microscopia de contraste de fase. Mancha da imunofluorescência de caderina endotelial vascular (CD144) e fator de von Willebrand (vWF) pode ser realizado também para a caracterização do hECFCs após a expansão celular.
  13. Cultivar a hECFCs, use suplementado com 5% FBS e penicilina/streptavidin a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% CO2expansão endothelial da pilha. Substitua o meio uma vez por dia.
  14. Após a indução de hECFC, crescem as células de passagem 7 para novas experiências.

7. propagação de pilha e cultura com as placas do gradiente Nanopattern

Nota: Passo 7 descreve a cultura de hECFCs na placa de gradiente nanopattern, mas outras fontes de células também podem ser usados.

  1. Revesti as placas de gradiente nanopattern com 1 mL da solução de revestimento de proteína de 0,1% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
    Nota: O revestimento de proteína 0,1% não abrange as características de nanopillar.
  2. Faça uma suspensão de hECFCs do prato de cultura por um método de divisão de célula padrão usando a tripsina.
  3. Dilua a suspensão de células para alcançar a desejado confluência. Semente do hECFCs para o gradiente nanopattern placas e controle plana (por exemplo, 1,0 × 104 células/cm2).
    Nota: Quando hECFCs são semeados de 1,0 × 104 células/cm2 em placas nanopattern gradiente, a confluência de célula geralmente atinge a 70-80% depois de 2 dias.
  4. Cultura de células em placas planas ou gradiente nanopattern por 2 dias na incubadora.

8. observação e análise

  1. Imagem de microscópio eletrônico de varredura (MEV)
    1. Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com glutaraldeído 2,5% a 4 ° C para a noite.
    2. Trate o tetróxido de ósmio 1% por 1h à temperatura ambiente. Lave as amostras com PBS.
    3. Desidrata-se amostras com álcool etílico de baixa a alta concentração (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) por 10 min por cada passo.
    4. Trate hexamethyldisilazane (HMDS) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lavar as amostras com HMDS fresco e deixar amostras sob a coifa pelo menos 1 dia até o HMDS residual se evapore completamente.
    5. Revestir as amostras com platina sputter coater por 5 min e examinar as amostras com um SEM.
  2. Imagem de microscópio eletrônico (TEM) de transmissão
    1. Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com 2% paraformaldeído e 2,5% glutaraldeído mistura em PBS a 4 ° C para a noite.
    2. Realizar pós-fixação usando o tetróxido de ósmio 1% e desidratar amostras usando o método em 8.1.3.
    3. Incorpore amostras em resina epóxi. Fazer 60 seções espessas de nm de blocos e coloque uma seção em uma grade de dez.
    4. Manche a seção com a mistura de acetato de uranilo 10 mg em 100 mL de álcool metílico e citrato de chumbo 0,1 mg em 100 mL de água destilada. Obter imagens com um TEM.
  3. Fluorescência de coloração
    1. Fix hECFCs cultivadas em placas planas ou gradiente nanopattern com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente por 15 min.
    2. Permeabilize e bloquear as amostras com 5% cabra soro e 0,1% Octilfenol etoxilato em PBS (PBST) à temperatura ambiente por 30 min.
    3. Incube as amostras com anticorpo anti-humano vinculina primário (1: 500 em PBST) à temperatura para amostras de 2 h. lavar três vezes com PBST.
    4. Incube as amostras com fluorescência-conjugados faloidina (1:1, 000 em PBST), conjugados a fluorescência anticorpo secundário (1:1, 000 em PBST) à temperatura ambiente para amostras de 2 h. lavar três vezes com PBST.
    5. Incube as amostras com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 em PBST) à temperatura ambiente por 5 min.
    6. Queda de 10 µ l de meio de montagem na superfície do gradiente nanopattern. Coloque uma lamela sobre o meio de montagem.
    7. Colocar a amostra de cabeça para baixo na fase de amostra e adquirir imagens usando o microscópio de fluorescência confocal.
  4. Análise de imagem
    1. Transferi imagens capturadas do hECFCs para um sistema de análise de imagem.
    2. Escolha o campo aleatório de faloidina, manchando a imagem. Ajustar o limite e criar uma imagem binária, na qual as células são distintas do fundo.
    3. Desenhe os contornos em torno de células para medir a área celular e perímetro e manualmente, contar o número de filopodia por célula.
    4. Escolha o campo aleatório da vinculina manchando a imagem. Ajustar o limite e criar uma imagem binária das áreas de adesão focal.
      Nota: Ajuste o limite de imagem adequadamente para evitar artificial over - ou under - filling das áreas de adesão focal.
    5. Conte o número de adesão focal de cada célula.

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Resultados


A Figura 1 mostra SEM imagens dos moldes AAO gradientes fabricados de acordo com seu tipo e posição. A Figura 2 mostra SEM imagens das placas de gradiente nanopattern com nanopillars regular-arredondado, e a Figura 3 é dados de quantificação do diâmetro nanopillar. A tabela 1 lista as características da nanopillars fabricados.

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Discussão

Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do eletrólito como...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido perclórico 60%Daejung Chemicals & Metais6512-4100
Álcool etílico, absoluto 99,9%Daejung Chemicals & Metais4118-4100
Ácido fosfórico 85%Daejung Chemicals & Metais6532-4400
Álcool metílico 99,5%Daejung Produtos químicos & Metais5558-4400
Óxido de cromo (VI)Daejung Chemicals & Metais2558-4400
Ácido sulfúrico 95%Daejung Chemicals & Metais7781-4100
Peróxido de hidrogênio 30%Daejung Chemicals & Metais4104-4400
n-hexano 95%Daejung Chemicals & Metais4081-4400
Tolueno 99,5%Daejung Produtos Químicos & Metais8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecil) dimetilclorosilanoGelestSIH5840.4Umidade sensível
Methoxynonafluorobutane 99%Sigma aldrich464309
Solução de colágenoStemcell#4902
GelatinaSigma aldrichG1890Solução
de revestimento de proteínaFicoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Solução de polissacarídeo hidrofílico
EGM-2MVLonzaCC-3202Meio de expansão de células endoteliais
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Solução salina tamponada com fosfatoGibco10010031
Soro bovino fetalGibco12483-020
ParaformaldeídoSigma aldrichP6148
GlutaraldeídoSigma aldrichG5882-100ML
Tetróxido de ósmioSigma aldrich201030-1G
HexametildisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctilfenol etoxilato 
Soro de cabraGibco26050-088
anticorpo primário anti-vinculina humana Sonda F-actin Sigmaaldrich V9131
Sondas MolecularesA12379Faloidina conjugada com fluorescência
Alexa Fluor 488-conjugada anti-mouse  Anticorpo IgGMolecular ProbesA11001Anticorpo secundário conjugado com fluorescência 
4',6-diamidino-2-fenilindol Sigma aldrichD9542
Meio de montagemDAKOS3023
Anticorpo primário anti-vWF humano DAKOA0082
Anti-humano  Anticorpo primário CD144BD Biosciences#555661
Eponate 12™ Kit de incorporação, com BDMATed Pella18012Resina epóxi
Acetato de uranila, 25gTed Pella19481
Citrato de chumbo, trihidratado, 10gTed Pella19312
Placa de alumínio ultra puroGoodfellow26050-088
Folha de poliestirenoGoodfellowST313120
8.0" wafer de silícioSiltron29-01024-03Lado único polido, 725 µ m de espessura
Dessecador a vácuo, 4,4 LKartellKA.230
Bomba de vácuoVacuumerV3. VOP100
Fonte de alimentaçãoUnicorntechUDP-3003
Agitador magnéticoDaihan scientificSL.
Agitador suspensoDaihan scientificHT120DX
CirculadorDaihan scientificWCR-P12
Mesa de mudança linearZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Suporte angular, 90 grausZaberAB90MAcessório da pinça PMP de platina móvel linear
, 145 mmVitlab67995Pinça não metálica
Béquer PTFE, 250 mLCowieCW007.25
Limpador ultrassônicoBransonB2510MTH
cortador de PCBHozan Tool IndustrialK-110
Dispositivo de nanoimpressãoNanonexNX-2000
Gerador de plasma de oxigênioFemto ScienceCUTE
Esterilizador de baixa temperaturalowtem50
CO2PanasonicMCO-18AC
Microscópio de varredura a laser ConfoalCarl ZeissLSM700
Microscópio eletrônico de varreduraJEOLJSM6701
Microscópio eletrônico de transmissãoHitachiH-7500
SMS03022 Incubadora de cristal

Referências

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