Este protocolo descreve o vestibulotóxicos cirúrgico de um rato, que é um método útil para o estudo do sistema vestibular.
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Artigo de método
Vestibulotóxicos cirúrgico do rato para estudar o sistema Vestibular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para estudar o sistema vestibular ou o processo de compensação vestibular, vários métodos foram desenvolvidos para causar dano vestibular, incluindo vestibulotóxicos cirúrgicos ou químicos e neurectomia vestibular. Vestibulotóxicos cirúrgico é um método relativamente simples, confiável e rápido. Aqui, descrevemos a técnica cirúrgica para rato vestibulotóxicos. Uma incisão postauricular é feita sob anestesia geral para expor o canal auditivo externo e a membrana timpânica, após o qual a membrana timpânica e ossículos são removidos sem estribo. A artéria do estribo, que está localizada entre o estribo e a janela oval, é uma estrutura vulnerável e deve ser preservada para obter um campo cirúrgico limpo. Um buraco para fenestrado o vestíbulo feito com uma broca de 2,1 mm de broca superior com o estribo. Então, 100% de etanol é injetado através deste buraco e aspirada várias vezes. Minuciosa dissecação sob um microscópio e cuidadoso controle de sangramento são essenciais para obter resultados fiáveis. Sintomas de perda vestibular, como nistagmo, inclinação de cabeça e um movimento de rolamento, são vistos imediatamente após a cirurgia. O teste de cadeira rotarod ou rotação pode ser usado para objetivamente e quantitativamente avaliar a função vestibular.
Introdução
O órgão vestibular é essencial para o controle de equilíbrio e olho. Uma função vestibular normal depende de sinais aferentes simétricos de órgãos vestibulares nos dois ouvidos interno. Hipofunção vestibular ou perda induz tonturas, nistagmo e desequilíbrio postural. Depois de danos agudos, a função vestibular recupera espontaneamente dentro de alguns dias, um processo conhecido como compensação vestibular1,2. A compensação vestibular dos défices estáticos é um processo de recuperação relacionado com o desequilíbrio da atividade espontânea de descanso entre os núcleos vestibulares ipsilaterais e contralaterais. A compensação vestibular dos défices dinâmicos é conseguida principalmente através de substituições sensoriais e comportamentais (usando entradas visuais ou somatossensorial)3. Estes processos são atraentes para a plasticidade neuronal estudos4,5.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar o sistema vestibular e os mecanismos subjacentes a plasticidade neuronal durante a compensação vestibular, tais como químicos e cirúrgicos vestibulotóxicos e neurectomia vestibular5,6 ,7,8. Neurectomia vestibular é uma certa maneira de induzir a perda completa do vestibular, mas é um procedimento mais difícil e invasivo e pode induzir dano cerebral8,9. Este método requer maior habilidade cirúrgica e leva mais tempo do que vestibulotóxicos. Vestibulotóxicos químico incluindo gentamicina, arsenilato e Tetracaína, é mais fácil e podem produzir resultados fiáveis10,11,12. No entanto, a cóclea, também pode ser danificada e perda vestibular pode desenvolver ao longo do tempo11. Além disso, os efeitos das substâncias químicas no cérebro, que deve ser preservado para avaliação exata, não são claras. Vestibulotóxicos cirúrgico foi introduzido pela primeira vez em estudos com animais em 184215 e foi primeiramente relatado em ratos em 193616. Esta técnica tem sido usada, desde que, em muitos animais estuda5,17,18,19. Vestibulotóxicos cirúrgico é um método confiável e relativamente simples de específicos. 13 , 14 além disso, os sintomas de dano vestibular são vistos imediatamente após a cirurgia. Aqui, descrevemos nossa técnica cirúrgica para rato vestibulotóxicos.
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Protocolo
Este estudo foi realizado em conformidade com o cuidado de Animal institucional e uso Comitê de Seul nacional Hospital Universitário (14-0148-C1A1), que é credenciado pela Associação para a avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório Internacional.
Nota: Os experimentos foram realizados em ratos machos Sprague-Dawley (SD) de 7-8 semanas de idade (200/250 g). Cada animal foi aclimatado para as condições de laboratório por 1 semana antes do início do experimento. Os animais foram alojados em uma sala de controle de temperatura e umidade com uma constante 12-h:12-h luz: escuro ciclo com livre acesso à comida e água.
1. vestibulotóxicos
- Cobrir os instrumentais cirúrgicos esterilizados em autoclave com uma almofada de estéril. Desinfete a área de atuação com 70% de etanol. Use um pano estéril e manter condições estéreis durante a cirurgia.
- Vestir a toga, máscara (para cobrir nariz e boca), PAC (para cobrir a cabeça) e um par de luvas estéreis. Os instrumentos cirúrgicos só devem entrar em contato com superfícies estéreis.
- Injetar o anestésico tiletamina-eficiente (40 mg/kg de peso corporal) por via intramuscular na coxa medial ou intraperitonealmente e xilazina (10mg/kg de peso corporal) por via intramuscular ou intraperitonealmente.
Nota: Outros modos de anestesia geral, incluindo a inalação de isoflurano, também podem ser usados. - Coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento (inicialmente definida a 42 ° C). Aplica a pomada lubrificante para ambos os olhos do rato para evitar ressecamento do olho enquanto sob anestesia.
- Coloque o rato do seu lado direito. Raspe a pele na área cirúrgica com máquina de cortar cabelo. Desinfecte o local com etanol a 70%.
- Injete cloridrato de lidocaína a 1% por via subcutânea em região retroauricular esquerda.
- Usando uma lâmina de bisturi 15 #, faça uma incisão de retroauricular ~5.0 cm. Separe o músculo e a fáscia para expor o canal auditivo externo com tesoura Iris (figura 1A). Abra ligeiramente o canal auditivo externo usando a lâmina #15 ou a tesoura de Iris (figura 1B). Expor amplamente a membrana timpânica (Figura 2A).
- Sob um microscópio (7,5 X ou 12,5 X), remova a membrana timpânica e ossículos com excepção do estribo, usando a pinça. Desanexe os músculos no cume lambdoidal com a lâmina #15 ou a tesoura de Iris (Figura 2B).
- Usando uma broca em baixa velocidade (< 3000rpm) com uma broca de diamante (2.1 ou 1,4 mm), perfurar o osso timpânica em torno do ponto de saída do nervo facial (Figura 3A). Identifica a artéria estapédica. Tome cuidado para não danificar a artéria estapédica durante o processo de perfuração.
- Continuar a perfuração do vestíbulo superior à artéria estapédica e expor a janela redonda e o ósseo canal semicircular lateral. Abra o canal semicircular lateral sua ampola. Continuar a perfuração no plano do canal semicircular lateral e broca da ampola do canal semicircular superior.
- Aspire o conteúdo do vestíbulo usando uma agulha de 18 G ou 22-G. Injetar e Aspire 1 cm3 de etanol 100% 3 x.
- Feche os músculos e a pele em duas camadas com suturas interrompidas simples.
- Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Aquece o rato até que ele desperta usando uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada de calor. Após o despertar, mova o rato para uma gaiola individual em uma sala com as condições ambientais normais.
- Administração de antibióticos (por exemplo, cefazolina 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamida 100 µ l por via subcutânea, ou penicilina 300.000 UI) conforme necessário no dia 1; um analgésico (não um opioide; por exemplo, Metacam, carprofeno a 2 mg/kg 5 mg/kg por via subcutânea) também pode ser dada.
2. sham cirurgia
- Para a cirurgia de Souza como um controle, executar os mesmos procedimentos cirúrgicos e pós-cirúrgicos (acordo com o ponto 1), incluindo a exposição do canal auditivo externo e a membrana timpânica (etapa 1.7), a remoção da membrana timpânica e ossículos e o desprendimento dos músculos sobre o lambdoidal ridge (passo 1.8), mas não abra o canal semicircular ou injetar o etanol.
3. Verifique a perda da função Vestibular
Nota: A perda da função vestibular pode ser avaliada usando testes de qualquer função comportamental ou vestibular. 13 , 17 , 18 testes comportamentais incluem a avaliação da assimetria postural e nistagmo.
- Identifica a assimetria postural que inclui espontânea ou evocado barril-rolamento, caindo para o lado esquerdo, ou se movendo enquanto inclinando-se para o lado lesado18. Veja o vídeo 1.
- Identifica o nistagmo por uma inspeção visual do movimento ocular voluntária. Quando o nistagmo espontâneo está ausente no estado de repouso, soprar ar suavemente sobre a cabeça do animal18. Veja o vídeo 2.
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Resultados
O sucesso da cirurgia foi validado por testes comportamentais. Todos os animais exibiram o comportamento típico de uma perda unilateral da função vestibular. Barril-rolamento espontâneo era evidente imediatamente após a cirurgia, sendo evocada por um sopro de ar sobre a cabeça ou um leve toque no corpo, na fase inicial de recuperação (vídeo 1). 3-d após a cirurgia, os animais movimentados mais inclinado para o lado lesado com ocasionais cai para o lado esquerdo. Nistagmo ...
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Discussão
Esta técnica é um método útil para a criação de perda súbita, permanente e completa função vestibular. Isso poderia ser usado para estudar patologias vestibulares, como neurite vestibular, um tumor acústico e a doença de Meniere. Muitos estudos têm usado essa técnica para estudar a plasticidade neuronal dos núcleos vestibulares ou o processo central relacionado5,17,18,19.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI15C2651).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ASPIRADOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | de aspirador médico |
| : # 15 | Fine Science Tools | # 10015-00 | Lâminas para # 7 Cabos de bisturi, # 15 |
| Rebarbas de aço carbono | Ferramentas de ciências finas | # 19007-05 | Diâmetro do eixo: 2,3 mm, comprimento: 44 mm, pacote de 10 rebarbas |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | # 6627100863 | Microscópio cirúrgico |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Ponta padrão 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrilhado 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: reto | Fine Science Tools | #14084-08 | Tesoura de íris, mais adequada para microdissecação sob alta ampliação |
| Tesoura de íris fina: reta | Fine Science Ferramentas | #14094-11 | Feito de aço inoxidável martensítico, combinado com molibdênio e vanádio |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Fornece estabilidade e controle para pesquisadores que usam o sistema de numeração |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 Largura da | ponta: 1 cm, serrilhada, 10 cm |
| Cabo de bisturi curto #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 curto, 12 cm |
| Cauterizador de Vasos Pequenos | Fine Science Tools | #18000-03 | Ponta de substituição, faca reta, mantém o sangramento ao mínimo e, portanto, proporciona um campo cirúrgico livre de grampos e hemostáticos |
| Forte 207S | SAESHIN | 207S | Torque potente em baixa velocidade, disponível com controlador de pé de velocidade ou on/off |
| Tubos de sucção | JEUNGDO B& P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Sutura cirúrgica estéril absorvível sintética |
| ciência fina | Weitlaner-Locktite | 17012-13 | Propagação máxima: 4,5 cm, 2 x 3 dentes rombos, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, França | Tiletamina-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofeno | |
| Septra | Pfizer | Trimetoprim-sulfonamida |
Referências
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Reimpressões e permissões
