Artigo de método

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

DOI:

10.3791/57684

⸱

1 de setembro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diferenciação das células do estroma endometriais humanas (HESC) da aparência de um fibroblasto em secretora decidua é uma transformação necessária para a implantação do embrião no revestimento do útero do ventre materno. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e subsequente aborto precoce do embrião. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso melhorar a taxa de nascimentos bem sucedidos. In vivo com base em estudos de decidualization artificial estão limitando muitas vezes devido a dilemas éticos associadas à investigação humana, bem como complicações translacionais em modelos animais. Como resultado, em vitro ensaios através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de HESC e subsequente decidualization artificial através da suplementação de hormônios para o meio de cultivo. Ainda mais, este estudo fornece um método bem projetado para nocaute qualquer gene de interesse utilizando transfections de siRNA baseadas em lipídios. Este protocolo permite a otimização da pureza da cultura, bem como rendimento de produto, maximizando assim a capacidade de utilizar este modelo como um método confiável para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à decidualization e a posterior quantificação dos agentes secretados pelas células do estroma endometriais decidualized.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação1 ,2. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina1. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)3,4,5. No âmbito da fase proliferativa (ou folicular), os níveis de estrogênio preovulatory aumento, iniciando o espessamento do endométrio. Após a ovulação, a fase secretora (ou lútea) promove um aumento significativo nas concentrações de P4, induzindo a transformação morfológica das células do estroma endometriais (ESC) da aparência de fibroblasto arredondados, células epiteliais-decidual em um processo conhecido como decidualization4,6. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para o fracasso do implante e posterior início embrião aborto espontâneo de4,de7,8. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso para o diagnóstico e o tratamento de perda de gravidez precoce.

Atualmente, várias metodologias são utilizadas para explorar os efeitos subjacentes de decidualization em células do estroma endometriais. In vivo, o útero de rato pode ser induzida artificialmente para decidualization através de estimulação mecânica (i.e.,coçar) ou injeção em um útero hormonalmente condicionadas9de óleo. Distintos dos humanos, esta estimulação sintética promove a diferenciação do lúmen uterino, fornecendo a aparência da presença de blastocisto, um passo que é necessário para a iniciação de decidualization em roedores10,11. Nesse sentido, devido as complicações translacionais associadas com modelos animais e os dilemas éticos que cercam na vivo com base em estudos em seres humanos, modelos de decidualization com base são estudados com mais êxito in vitro.

Neste estudo, os sujeitos são recrutados através da colocação de anúncios em dois jornais locais, inglês e espanhol. Indivíduos identificados como candidatos adequados para este estudo são trazidos para se reunir com o coordenador da pesquisa, em que uma divulgação completa dos riscos potenciais são discutidos. Após a confirmação de uma compreensão completa dos riscos potenciais envolvidos, consentimento dos sujeitos é atingido nas formas verbais e escritas. Consentimento do sujeito inclui permissão para (1) submetido a armazenagem (2) a longo prazo de flebotomia de seus tecidos para fins de pesquisa futura e (3) concordar com a criação de culturas primárias de amostras de tecido coletadas. Após consentimento, indivíduos recebem um formulário para preencher no qual auto-identificação permitida de raça/etnia e/ou o direito de não-divulgação. Uma visita subsequente é programada para atingir a biópsia de endométrio com base no ciclo menstrual do sujeito. Voluntários recrutados para este estudo, refletem a demografia étnica e racial da região metropolitana de St. Louis, como documentado pelo censo de 2012 e que não envolvem a participação de qualquer população vulnerável, incluindo mulheres grávidas, fetos, embriões, crianças menores de 18 anos de idade, ou de outros grupos vulneráveis. Requisitos de elegibilidade para participação na coleção de amostra de biópsia incluem (1) estar entre as idades de 18-45 anos (2) ter ciclos menstruais regulares (25-32 dias) (3) não ter nenhuma gravidez atual ou uso de dispositivo intra-uterino hormonal/contraceptivos por 30 dias antes da inscrição (4) sem qualquer infecção vaginal atual ou doenças sexualmente transmissíveis (5) tendo nenhum atuais tratamentos com antibióticos e (6) não tendo nenhum atual de Papanicolau anormais.

Dentro deste estudo, células do estroma endometriais humanas (HESC) são cultivadas e induzidas artificialmente a submeter-se decidualization em vitro através da suplementação de hormônios (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) e adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) ao meio. Neste método, o grau de decidualization é alterado com base no número total de dias de tratamento hormonal. Em conjunto com o rearranjo do citoesqueleto, suplementação hormonal induz adaptações bioquímicas em que as células decidual experimentam de qualidades secretoras2,4. A expressão de genes de marca, tais como a prolactina (PRL) e proteína fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFBP1), pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de HESC decidualization5,12, 13 , 14. importante, a viabilidade do presente protocolo realizar knockdown específicos do gene também é demonstrada.

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Protocolo

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Todas as biópsias de endométrio humano coletadas para este estudo foram alcançadas na Universidade de Washington em St. Louis, departamento de obstetrícia e Ginecologia usando um institucional Review Board (IRB) aprovou o formulário de consentimento por escrito.

1. preparação

  1. Prepare 500 mL de 1 x do Hank equilibrado sal solução (HBSS) adicionando 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL para o frasco contendo mídia (mais referenciado como meio HBSS +).
  2. Preparar 500 mL de meio de águia de Dulbecco modificado: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e 15mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) adicionando 1% solução de antibiótico antimicótico (a concentração final é de 0,25 µ g/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 100 U/mL penicilina Fungizone) para a mídia contendo o frasco (ainda mais referenciado como meios de isolamento HESC).
  3. Preparar 500 mL de DMEM/F12 com vermelho de fenol, L-glutamina e 15 mM HEPES, adicionando 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 x at2HCO3e 1% penicilina (10.000 U/mL) e estreptomicina (10.000 µ g/mL) (caneta Strep) à mídia contendo frasco (mais referenciado como HESC Media).
  4. Preparar 500 mL de meio de soro reduzido com L-glutamina, bicarbonato de sódio 2,4 g/L e HEPES com 2% carvão despojado Fetal soro bovino (csFBS) e 1% Strep caneta à mídia contendo frasco (mais referenciado como Decidualization Media).
  5. Prepare 500 mL de vermelho de fenol livre DMEM/F12, adicionando 2% carvão despojado de soro fetal bovino (csFBS) na mídia contendo frasco (mais referenciado como mídia de mudança).
  6. Prepare-se 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona 1 µM (MPA) e 50 µM adenosina monofosfato cíclica (cAMP) em um tubo cónico polipropileno de 15 mL e adicionar a 2 mL por alíquota bem de mídia previamente preparado decidualization para in vitro ensaio de decidualization (mais referenciado como EPC Media).
  7. Prepare 50 mL de congelação mídia com 90% FBS e 10% dimetilsulfóxido (DMSO) 50 mL polipropileno cónica (mais referenciada como meios de congelamento).
  8. Pre-pesar 25 mg de colagenase e 5 mg de DNase I em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e loja a-20 ° C.

2. aquisição de biópsia de endométrio humana

  1. Obter amostras de biópsia de endométrio humano coletadas na fase proliferativa (dia 9 - dia 12) do ciclo menstrual da clínica em HBSS IRB aprovado.
  2. Lavar as amostras de biópsia com 1 mL de escaldadas 37 ° C HBSS + médio e agite suavemente para remover o excesso de sangue e muco.

3. isolamento de células do estroma Endometrial humanas (HESC)

Nota: Este procedimento de isolamento é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.

  1. Transferir a biópsia com Pinças esterilizadas em um tubo de centrifuga conico de polipropileno de 50 mL contendo 10 mL HBSS fresco.
  2. Centrifugue a biópsia à temperatura ambiente a 500 x g, durante 90 s.
    1. Se as rupturas de pellet celular, re-spin a biópsia a 2.000 x g, durante 90 s.
  3. Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e lavar com 10 mL de 37 ° C pré-aquecido HESC isolamento Media seguido por centrifugação a 500 x g durante 90 s.
  4. Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e vigorosamente, adicionar 3 mL de mídia de isolamento HESC fresco para desalojar a biópsia.
  5. Decante a biópsia para uma placa de Petri contendo 5 mL de HESC isolamento Media.
  6. Picar a biópsia em como pequenas peças possível usando #5 pinças e tesouras de costura reta bem por cerca de 20 minutos.
  7. Preparar a DNase I e enzimas colagenase, adicionando 10 mL de HESC isolamento Media para pré-pesados DNase I (0,5 mg/mL) e colagenase (2,5 mg/mL). Misture com pipeta.
  8. Pipeta de corta amostras de tecido usando uma pipeta de 1 mL para um tubo de polipropileno cônico de novo 50 mL. Lavar com 7 mL de meios de isolamento HESC e adicionar ao tubo de polipropileno para adquirir a amostra completa.
  9. Centrifugar a amostra à temperatura ambiente a 800 x g por 2 min. Retire com cuidado o sobrenadante com uma pipeta.
  10. Filtre o DNase I e solução de colagenase através de filtro de 0,2 µm anexados a seringa de 10 mL diretamente na pelota.
  11. Vórtice de 10 s para resuspenda o pellet.
  12. Digest em banho de água a 37 ° C por 1,5 h, num Vortex para 10 s minuciosamente cada 10 min, até tecido é digerido.
  13. Filtre a amostra através de um filtro de célula 40 µm empilhados sobre um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para remover as células epiteliais e restos de tecido.
    Nota: As células estromais são no tubo de polipropileno cônico de 50 mL.
  14. Centrifugar o tubo polipropileno cônico de 50 mL a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
  15. Resuspenda o pellet em 10 mL de HESC isolamento Media.
  16. Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e depois Ressuspender as células em 6 mL de mídia HESC e pipeta para diante e reversa para misturar.
  17. Lentamente a camada em 3 mL de mídia gradiente de densidade para as células ressuspensa separar restantes células do sangue das células do estroma, tomando cuidado para não misturar as camadas.
  18. Centrifugar o tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
  19. Coletar 5 mL do sobrenadante em um novo tubo de polipropileno de 50 mL e adicionar um adicionais 5 mL HESC mídia para Ressuspender as células.
  20. Centrifugar a 800 x g durante 2,5 min à temperatura ambiente, seguida pela remoção do líquido sobrenadante e adição de 6 mL HESC Media. Vórtice da amostra durante 10 segundos e mistura pipetando para a frente e reverter 5 vezes.
  21. Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para contagem de células.
  22. Adicione 10 µ l de 0,4% de azul de Trypan manchar a alíquota de pilha e misture com pipeta. Carregar 10 µ l da alíquota e contar as células usando um hemocytometer.
  23. As células em um frasco apropriado dependente contagem celular total em 15 mL HESC Media da placa.
    1. Se o número total de células é menor que 1 milhão, placa todas as células em balão de 25 cm com 6 mL de HESC Media. Se o número total de células é mais de 1 milhão, placa todas as células de 75cm frasco com 15 mL de HESC Media.
  24. Cultura de células em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C por um período mínimo de 6 h para assegurar a aderência de célula apropriada e alterar os meios de comunicação para mídia HESC.
  25. Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.
  26. Alterar HESC Media em dois dias.
    1. Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
    2. Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
    3. Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.
  27. Uma vez HESC se tornar confluente de 80-90%, as células de transferência de 25 cm para balão de 75 cm ou de um balão de 75 cm para três frascos de 75 cm.
    Nota: HESC pode ser congelado e armazenado para uso posterior neste momento para experiências futuras.

4. congelamento e descongelamento HESCs

  1. Mídia de balão de 75 cm, Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina.
  2. Incube numa incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C até que as células desalojar do recipiente.
  3. Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.
  4. Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min e aspirar o sobrenadante.
  5. Etiqueta congelamento tubos com linha celular, data e número de passagem.
  6. Ressuspender o centrifugado em 5 mL de congelamento de mídia.
  7. Alíquotas de 1ml da HESC re-suspenso a cada tubo e transferência tubos de freezer-80 ° C.
  8. Transferi os tubos para nitrogênio líquido dentro de 24 horas.
    Nota: Se pretende descongelar células no futuro imediato, armazene células congeladas em-80 ° C durante um mês.
  9. Para descongelar os HESCs pré-aquecer HESC Media por 20 min.
  10. Adicione 8 mL de pré-aquecido HESC Media 25cm balão.
  11. Recuperar o tubo congelante do tanque de nitrogênio líquido ou -80 ° C e mergulhe o tubo em banho de água a 37 ° C durante 1-2 minutos descongelar as células.
  12. Transferir HESC descongelado para um balão de 25 cm com HESC mídia e incubá-los numa incubadora 5% CO2 durante a noite a 37 ° C.
  13. No dia seguinte, mudar a mídia HESC e esperar 2-3 dias até HESC se tornar confluente e transferir células para balão de 75 cm, conforme detalhado abaixo no protocolo 5.
    1. Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
    2. Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
    3. Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.

5. cultivo de células do estroma Endometrial humanas (HESC)

Nota: Este procedimento de Culturing é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.

  1. Pré-aquece o HESC Media a 37 ° C em banho-maria por 20-30 min.
  2. Aspirar a mídia do recipiente e adicionar o ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do tripsina 0,25% (1 mL para o frasco de 25 cm ou 2 mL para o frasco de 75 cm).
  3. Incube em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.
  4. Bata levemente as paredes de balão para desalojar as células restantes. Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.
  5. Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente.
  6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Media HESC.
    1. Adicione 15 mL para o frasco de 25 cm ou 45mL para o frasco de 75 cm (15 mL cada).
  7. Adicione 5 mL ou 15 mL de suspensão de células para cada balão de 25 cm ou 75 cm, respectivamente.
  8. Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.
  9. Alterar HESC Media em dois dias.
    1. Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.
    2. Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).
    3. Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.

6. humano chapeamento de célula (HESC) do estroma Endometrial e siRNA Transfection

Nota: Este procedimento de transfeccao é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.

  1. Aspire HESC Media de balão de 75 cm e adicionar 2 mL de solução de EDTA-tripsina 0,25%.
  2. Incube em 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.
  3. Uma vez que as células são desalojadas do recipiente, adicionar 7 mL de mídia HESC e misture suavemente pipetando para diante e reversa 5 vezes.
  4. Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de HESC Media.
    Nota: Se chapear pilhas de mais de um balão, simplesmente aumente o volume de mídia HESC.
  5. Contar as células usando um Hemocytometer.
    1. Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    2. Adicione 10 µ l de 0,4% azul Trypan manchar a célula alíquota e misturar pipetando para frente e reversa.
  6. Placa de 0,8 x 105 células por poço em placas 6-boas. Depois de dois dias, as células devem ser 60-70% de confluencia para transfeccao ideal.
  7. Para cada amostra de transfeccao siRNA, prepare complexos usando siRNA (60 nanomoles) de reagente de transfeccao.
  8. Diluir 5 µ l de reagente de Transfeccao de 150 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.
  9. Diluir 60 nanomoles de siRNA em 100 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.
  10. Após 5 minutos, combinar siRNA diluído com solução de reagente de transfeccao diluídos e misture suavemente pipetando para a frente e reverter 5 vezes.
    Nota: Se transfecting um ou mais siRNA em vários poços, mestre mix em 10 mL prepare tubos de poliestireno.
  11. Incube a complexos de reagente de transfeccao siRNA por 5 min à temperatura ambiente.
  12. Durante esta incubação, adicione 1 mL de meios de comunicação de mudança a cada poço.
  13. Depois de 5 min. de incubação, centrifuga tubos a 500 x g por 2 min coletar a solução e adicionar a 250 µ l de complexos de reagente de transfeccao siRNA a bem, contendo células e mídia.
  14. Misture suavemente agite e incube as celulas a 37° C numa incubadora 5% CO2 por 5 h.
  15. Após 5h, mude os meios de comunicação de mídia HESC.
  16. Incube as células a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 2 dias em preparação para um ensaio de decidualization em vitro .

7. ensaio de Decidualization in Vitro

Nota: Este ensaio é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.

  1. Preparar a mídia EPC antes de iniciar o tratamento decidualization em vitro , conforme descrito em Camden et al 3 (ver 1.6).
  2. Aspire a mídia da hora post-48 transfectada linha de HESC incubada da etapa 6.16.
  3. Adicione 2 mL de EPC Media em cada poço.
    Nota: como um controle, deixar um conjunto de células não tratado com Media de EPC. Em vez disso, adicione 2 mL de mídia HESC para os poços de controle.
  4. Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 6 dias.
    1. Altere a mídia de EPC em 48 horas.
      1. Aquecer e preparar a mídia de EPC em banho maria a 37 ° C por 15-20 min.
      2. Aspirar a mídia do poço e adicionar mídia fresco do EPC.
      3. Coloque a placa de volta para a 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
  5. Após o sexto dia, analise o grau de decidualization de células do estroma através de ELISA e qRT-PCR (conforme descrito abaixo).

8. validação de Decidualization In Vitro utilizando PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)

Nota: qRT-PCR é completada conforme descrito em Kommagani et al.10.

  1. Isole o RNA total de HESC utilizando o protocolo de um kit de isolamento de RNA comercialmente disponível.
    1. Analise a quantidade de RNA e pureza (um260/A280) usando um NanoDrop ou metodologia similar, conforme descrito em Garcia-Elias et al.15.
  2. Sintetiza o cDNA de 1 µ g de RNA total através de um protocolo do kit de transcrição reversa comercialmente disponível.
  3. Execute uma reação de qRT-PCR, conforme descrito em um protocolo do kit de qRT-PCR comercialmente disponível.
    1. Gene específico testes junto com controles do sistema interno (18s, PRLe IGFBP1) e realizar a reação usando uma mistura de mestre de PCR em tempo real disponível comercialmente.

9. validação de Decidualization In Vitro utilizando ELISA

  1. Quantificar os níveis de prolactina secretados dos meios de cultura de tecidos utilizando um kit de prolactina ELISA comercialmente disponível.

10. validação de Decidualization In Vitro utilizando faloidina coloração.

  1. Introduza cada poço de uma placa bem 12 lamínulas estéreis.
  2. Repita as etapas de 6.1-6.5.
  3. Placa de 0,8 x 105 células por poço de um prato bem 12.
  4. Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 2 dias.
  5. Aspire os meios de comunicação.
  6. Repita as etapas 7.3-7.4.
  7. Consertar as células em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) à temperatura ambiente por 30 min.
  8. Aspirar a solução de fixação e lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
  9. Adicione 0,1% de éter de fenil tensoativo não-iônico polietilenoglicol tert-octil em PBS por 5 min para as células fixas para aumentar a permeabilidade.
  10. Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
  11. Adicione 100 µ l de solução faloidina por lamela e incubar a temperatura ambiente por 90 min.
    1. Prepare a diluição de 1: 100 em PBS de usar uma solução estoque faloidina em 1 unidade por 5 µ l.
  12. Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.
  13. Monte as lâminas com meio de montagem contendo 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Observe as células utilizando um microscópio confocal.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decidualization em cultura HESC

Após isolamento, células do estroma endometriais humanas foram cultivadas a uma formação de monocamada com confluência de 80-90% e induzido para decidualization em vitro , tratando com 10 nM E2, 1 µM MPA e acampamento de 50 µM (EPC). Mudanças morfológicas associadas em vitro decidualization foram visualizadas na figura 1A. Sobre deci...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ciclo menstrual reprodutivo feminino é caracterizado por um aumento nos níveis de progesterona durante a fase lútea, induzindo assim a decidualization de ESC em redondo, epitelial, como as células secretoras de3,8. A iniciação de decidualization é dependente de espécies. Em humanos, decidualization ocorre espontaneamente sobre o aumento da concentração de progesterona, enquanto ratos requerem blastocisto presença10,

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado por financiamento de institutos nacionais de saúde (NIH) / Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) grant (R00 HD080742) e start-up Washington University School of Medicine fundos para R.K. Gostaríamos de agradecer a clínica de fertilidade de Universidade de Washington para fornecer as amostras de biópsia endometrial.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Opti-MEM I (1X) Meio de Soro ReduzidoGibco31985-070Para meios de decidualização
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Mancha Azul de Tripano (0,4%)Gibco15250-061Para contagem de células
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018APara Isolamento/Purificação de RNA
TaqMan 2X Universal PCR Master MixKit
Applied Biosystems4374967
endógeno eucariótico de 18S rRNALife Technologies4319413Epara controle interno de qPCR
Ensaio de expressão gênica de TaqMan Sonda de prolactina4331182aplicada de biossistemaspara controle interno de qPCR
Expressão gênica de TaqMan A ponta de prova IGFBP1 do ensaioaplicou 4331182 de Biosystemspara o reagente
Phalloidin-iFluor 488 do controle qPCR - CytoPainterAbcamab176753
Prolactina humana ELISA KitInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldeídoAlfa Aesar30525-89-4Fixador
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778150Reagente de transfecção
ProLong Gold reagente antidesbotamento com DAPIInvitrogenP36935Para montagem
de 0,25% de tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-122
Carvão vegetal despojado Soro fetal bovinoSigmaF6765-500ML
Bicarbonato de sódio (7,5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque MAIScientífica 45001749Fisher
do histolyticum de ClostridiumSigmaC0130-1G
Deoxyribonuclease mim do pâncreas bovinoSigmaDN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetatoSigmaM1629-1Gpara o meio Sigma
de Estradiol da MPEE1024-1Gpara mídia EPC
cAMPSigmaA6885-100MGpara mídia EPC
Tesoura de ponto reto finoFerramentas de ciência fina15396-00
TaqMan Ensaio de expressão gênica NCOA2 SondaApplied Biosystems4351372
Soro bovino fetal, inativado por calorGibco10-082-147
Thermo antibiótico Científico15240062
Hank' s Solução salina balanceadaCorning21-021-cv
50 mL polipropileno cônico Tubo FalconCorning352098
Dumont #5/45 FórcepsFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Placa de Petri de vidroVWR75845-546
Filtro de célula de 40 mícronsMidsci229481
Isotemp 215 Banho-mariaFisher ScientificFS-215
Centrífuga LSE Corning6755
SiRNA NCOA2 Humano DharmaconL-020159-00Sonda qPCR específica
do gene Incubadora de CO2 i160 de cicloThermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Para quantificação de RNA
Tamponado com Fosfato Salino Fisher Scientific50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture FlaskCorning430641U
6 poços Non-Pyrogenic Cell Culture PlateCorning3506
Pipet Controller UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture FlaskCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL cônico polipropileno Falcon tuboCorning352099
Seringa de 10 mLCapota de
1300 Série A2Thermo Scientific1377
accuspin Centrífuga Micro17Fisher Scientific13100675
7500 Fast sistema de PCR em tempo realApplied Biosystems3052632
EVOS FL Microscópio de imunofluorescênciaLife Technologies01414-155G-291
Leica Microscópio de luz invertidaLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Planilhas ExcelMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm óculos de coberturaNeuVitroGG-18
Reichert Hemacitômetro de Linha BrilhanteSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoetanolFisher BioreagentesBP176-100Para tampão de lise de RNA
1.2mL Frasco de Polipropileno Criogênico com Rosca ExternaCorning430658Para congelar células HESC 
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650-100mLpara meios de congelamento
de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade 4304437 Controle interno de colagenase de do reagente sanguíneo Segurança Biológica BD 302995

Referências

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