Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Resumo

Neste artigo, apresentamos um protocolo in vitro e in situ para reparar uma lacuna tendinosa de até 1,5 cm, preenchendo-a com enxerto de colágeno projetado. Isso foi realizado desenvolvendo uma técnica de sutura modificada para levar a carga mecânica até que o enxerto amadurecer no tecido hospedeiro.

Resumo

O manejo cirúrgico de grandes defeitos tendinosos com enxertos tendinosos é desafiador, pois há um número finito de locais onde os doadores podem ser facilmente identificados e usados. Atualmente, essa lacuna é preenchida com enxertos automáticos, alusões, xeno-, ou artificiais, mas os métodos clínicos para protegê-los não são necessariamente traduzíveis para os animais por causa da escala. Para avaliar novos biomateriais ou estudar um enxerto tendão composto por colágeno tipo 1, desenvolvemos uma técnica de sutura modificada para ajudar a manter o tendão projetado em alinhamento com as extremidades tendinosas. As propriedades mecânicas desses enxertos são inferiores ao tendão nativo. Para incorporar o tendão projetado em modelos clinicamente relevantes de reparo carregado, foi adotada uma estratégia para descarregar o enxerto tendão projetado por tecido e permitir a maturação e integração do tendão projetado in vivo até que um neocons tendão de som mecanicamente seja formado. Descrevemos esta técnica usando a incorporação do colágeno tipo 1 construção do tendão projetado por tecido.

Introdução

A ruptura do tendão pode ocorrer devido a fatores extrínsecos, como lacerações traumáticas ou carregamento excessivo do tendão. Devido às forças de tração externas colocadas em um reparo tendinoso, uma lacuna inevitavelmente se forma com a maioria das técnicas de reparação do tendão. Atualmente, os defeitos/lacunas do tendão são preenchidos com enxertos automáticos, alusões, xenose artificiais, mas sua disponibilidade é finita, e o site do doador é uma fonte de morbidade.

A abordagem projetada por tecidos para fabricar enxerto tendão a partir de um polímero natural, como o colágeno, tem a vantagem distinta de ser biocompatível e pode fornecer componentes vitais de matriz extracelular (ECM) que facilitam a integração celular. No entanto, devido à falta de alinhamento fibrilar, as propriedades mecânicas do tendão projetado (ET) são inferiores ao tendão nativo. Para aumentar as propriedades mecânicas do colágeno mais fraco, muitos métodos têm sido utilizados, como a ligação cruzada física sob vácuo, radiação UV e tratamentos dehidrotermais¹. Além disso, através da ligação química com riboflavina, métodos enzimáticos e não enzimáticos aumentaram a densidade de colágeno e o módulo do Jovem do colágeno in vitro^2,3. No entanto, adicionando agentes transversais, a biocompatibilidade do colágeno está comprometida, pois estudos mostraram uma alteração de 33% nas propriedades mecânicas e perda de 40% da viabilidade celular^3,4,5. O acúmulo gradual de alinhamento e força mecânica pode ser obtido através do carregamento cíclico⁶; no entanto, isso pode ser adquirido eficientementei n vivo⁷.

Para que o ET se integre in vivo e adquira força sem a necessidade de alteração química, uma abordagem seria usar uma técnica de sutura estabilizadora para manter a construção mais fraca no lugar. A maioria dos reparos tendinosos dependem do projeto da sutura para manter as extremidades do tendão juntas; portanto, a modificação dessas técnicas existentes poderia fornecer uma solução lógica^8,9.

Até a década de 1980, reparos de 2 fios eram amplamente utilizados, mas a literatura cirúrgica recente descreve o uso de 4 fios, 6 fios ou até mesmo 8 fios em reparo^10,11. Em 1985, Savage descreveu técnicas de sutura de 6 fios com 6 pontos de ancoragem, e foi significativamente mais forte que a técnica de sutura bunnell que usa 4 fios ¹². Além disso, os reparos de 8 fios são 43% mais fortes do que outros fios nos modelos cadáver e in situ, mas esses reparos não são amplamente praticados, pois torna-se tecnicamente difícil reproduzir os reparos com precisão^13,14,15,16. Portanto, um maior número de fios de sutura do núcleo refere-se a um aumento proporcional das propriedades biomecânicas do tendão reparado. No entanto, há perda de viabilidade celular em torno dos pontos de sutura, e o trauma da sutura excessiva pode ser em detrimento do tendão, o que pode comprometer a cicatrização do tendão¹⁷. As técnicas de sutura devem fornecer um forte reparo geométrico equilibrado e relativamente inelástico para minimizar o escancaramento dos tendões após o reparo. Além disso, a localização da sutura e seus nós devem ser estrategicamente colocados para que não interfiram no deslizamento, no suprimento sanguíneo e na cicatrização até que o acúmulo de força adequada tenha sido obtido^10,18.

Para estabelecer a viabilidade para garantir enxerto ET mais fraco ou outro material de enxerto entre o tendão rompido, desenvolvemos uma nova técnica de sutura que pode descarregar o enxerto para que ele possa amadurecer e gradualmente se integrar ao tecido hospedeiro in vivo.

Protocolo

NOTA: O desenho do experimento e a aprovação ética foram obtidos do Conselho de Revisão Institucional da UCL (IRB). Todos os experimentos foram realizados conforme regulamentação do Home Office e diretrizes da Lei de Animais (procedimento científico) de 1986 com legislação revisada da Diretiva Europeia 2010/63/UE (2013). Os coelhos foram inspecionados por um cirurgião veterinário nomeado (NVS) periodicamente e duas vezes por dia por um oficial de assistência e bem-estar animal nomeado (NACWO) (Conforme diretrizes e regulamentos do Home office). Eles não mostraram nenhum sinal de dor até serem eutanásiados.

1. Preparação do enxerto do tendão do tendão de tecido (ET)

1. Para fabricar o hidrogel de colágeno, adicione 4 mL de solução de colágeno de cauda de rato tipo 1 (2,15 mg/mL em ácido acético de 0,6% com 0,2% w/v de proteína total) e 500 μL de 10x Minimal Essential Medium. Neutralize isso titulando contra hidróxido de sódio de 5 M e 1 M e adicione 500 μL do DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco.
2. Despeje 5 mL desta solução em um molde metálico retangular construído sob medida (33 mm × 22 mm × 10 mm, 120 g de peso)(Figura 1). Mantenha o molde em uma incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% de CO₂ por 15 minutos para permitir a montagem da matriz¹⁹.

2. Fabricação do Enxerto

1. Após a polimerização, remova o hidrogel de colágeno do molde e coloque em um conjunto de compressão plástica padrão(Figura 2A)¹⁹.
2. Coloque o hidrogel de colágeno entre duas folhas de malha de nylon de 50 μm e aplique uma carga estática de 120 g (área total de superfície 7,4 cm², que é uma pressão equivalente a 1,6 kPa) durante 5 minutos para remover o fluido intersticial do hidrogel(Figura 2A). Use quatro camadas de papel filtro para absorver o fluido descarregado de hidrogéis.
3. Use quatro camadas de géis comprimidos enrolados em cima um do outro (Figura 2B) e corte em segmentos de 15 mm(Figura 2C) para fabricar o ET.
   NOTA: Novos coelhos brancos da Zelândia de 16 a 25 semanas foram usados nos experimentos.
4. Seda animais com uma dose intramuscular (i.m.) de Hipnorm (0,3 mg/mL) e eutanásia administrando uma overdose de pentobarbitona.
5. Imediatamente após a eutanásia, corte o cabelo em ambas as patas traseiras. Em seguida, com uma lâmina cirúrgica tamanho 20, faça uma incisão de 9 cm ao redor da área tibiofibular inferior para expor o tendão tibialis posterior (TP).
6. Com a mesma lâmina cirúrgica de tamanho, extirpa os tendões de lapina TP com um comprimento médio de 70 mm e mantenha-se úmido em PBS durante o processo experimental para evitar a secagem.

3. Desenvolveu técnica de tenorrhaphy

NOTA: As suturas (ver Tabela de Materiais) são inconfundíveis e feitas a partir de um esteremos estereomer cristalino isotítico de polipropileno, que é um poliolefina linear sintético. As suturas de intertravamento do núcleo consistiam principalmente de 3-0 e as suturas periféricas eram 6-0. Estas foram as duas principais suturas usadas em todos os experimentos.

1. Com uma lâmina cirúrgica, corte o tendão TP no ponto médio. Extire um segmento de 15 mm do tendão a partir do meio do tendão e substitua-o pelo enxerto de colágeno ET(Figura 2D). Entrelaça a sutura 3-0 proximally longe das extremidades do tendão nativo(Figura 3A).
2. Passe as suturas do núcleo 3-0 acima de toda a extensão do enxerto e entrelaçadamente longe da extremidade do corte.
3. Segure as duas extremidades do ET ao tendão nativo com 6-0 e suturas contínuas em torno da periferia, acoplando duas extremidades tendinosas(Figura 3B). Isso é feito para que o enxerto possa ser movido facilmente na sutura, colocando tensão no tendão nativo²⁰.
4. Depois de fixar a sutura como descrito acima, certifique-se manualmente de que a tensão nas suturas é apropriada e que não há flacidez na totalidade da sutura.

Resultados

Usamos enxertos de colágeno fabricados a partir do colágeno tipo I, pois esta é a proteína predominante encontrada no tendão. Constitui quase 95% do colágeno total no tendão; portanto, o colágeno expôs todas as propriedades ideais para imitar o tendão in vivo^21,22.

Neste estudo, o colágeno tipo I utilizado foi extraído do tendão da cauda de rato e dissolvido no ...

Discussão

Neste estudo, os enxertos de colágeno tipo I de engenharia de tecido foram escolhidos como enxerto tendinoso porque o colágeno é um polímero natural e usado como biomaterial para várias aplicações de engenharia de tecidos^27,28_. Além disso, o colágeno constitui 60% da massa seca do tendão, dos quais 95% é colágeno tipo 1 ^{21,29,30,31...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cauda de rato tipo 1 Colágeno	First Link, Birmingham, Reino Unido	60-30-810
suturas de prolene 6-0	Ethicon Ltd, Edimburgo, Reino Unido
suturas de prolene 3-0	Ethicon Ltd, Edimburgo, Reino Unido	D8911
Papel de filtro Whatman	SIGMA-ALDRICH
Gibco  DMEM, glicose alta	Thermo Fisher Scientific
Malha de nylon	Plastok (Malhas e Filtração) Ltda.	NA

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