Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Summary

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Abstract

A barreira hemato - encefálica (BBB) é um tecido dinâmico barreira que responde a vários estímulos fisiopatológicos e farmacológicos. Tais alterações resultantes destes estímulos podem grandemente modulam a entrega da droga para o cérebro e, por extensão, causam consideráveis desafios no tratamento do sistema nervoso central (CNS) doenças. Muitas mudanças BBB que afetam a farmacoterapia, envolvem as proteínas que são localizadas e expresso a nível das células endoteliais. Com efeito, tal conhecimento sobre fisiologia do BBB na saúde e na doença gerou considerável interesse no estudo destas proteínas de membrana. Do ponto de vista de pesquisa de ciência básica, isto implica uma exigência para um método simples mas robusto e reprodutível para isolamento de microvessels de tecido cerebral, colhido em animais experimentais. Para preparar amostras de membrana de microvessels recentemente isolada, é essencial que os preparativos da amostra ser enriquecidos em células endoteliais mas limitados na presença de outros tipos de células da unidade neurovascular (i.e., astrócitos, micróglia, neurônios, pericitos). Um benefício adicional é a capacidade para preparar amostras de animais individuais, a fim de capturar a verdadeira variabilidade da expressão da proteína em uma população experimental. Neste manuscrito, detalhes a respeito de um método que é utilizado para isolamento de microvessels de cérebro de rato e preparação de amostras de membrana são fornecidos. Enriquecimento de Microvessel, de amostras derivadas, é conseguido usando quatro etapas de centrifugação onde dextrano é incluído no buffer de amostra. Este protocolo pode facilmente ser adaptado por outros laboratórios para suas próprias aplicações específicas. Amostras geradas a partir deste protocolo foram mostradas para produzir robustos dados experimentais de experimentos de análise de proteína que podem ajudar muito a compreensão das respostas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos.

Introduction

A barreira hemato - encefálica (BBB) existe na interface entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulação sistêmica e desempenha um papel essencial na manutenção da homeostase do cérebro. Especificamente, as funções BBB para precisamente controle soluto concentrações no fluido extracelular de cérebro e eficientemente fornecer os nutrientes necessários para atender as demandas metabólicas consideráveis do CNS¹pelo tecido cerebral. Essas funções implicam que o BBB, que existe principalmente no nível da célula endotelial microvascular, deve possuir mecanismos discretos que permitem que algumas substâncias acessar o parênquima cerebral, garanti....

Protocol

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados por um cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) e estar de acordo com o National Institutes of Health (NIH) e pesquisa Animal: Reporting In Vivo experimentos (chegada) orientações. O fluxo processual para o protocolo é descrito na Figura 1.

1. set-up para o procedimento

1. Prepare o buffer de microvessel do cérebro (BMB). Comece por pesagem 54,66 g D-manitol, 1,90 g EGTA e base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (ou seja, Tris) 1,46 g para um copo limpo. Adicione 1,0 L de água desionizada. Misture os compon....

Results

O fluxo experimental para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana de microvessel é mostrado na Figura 1. Usando o procedimento aqui apresentado, é demonstrado sucesso isolamento de microvessels intacto de cérebro de rato (Figura 2A). Estes navios foram obtidos após a conclusão de centrifugação com dextran e imediatamente antes de iniciar a ultracentrifugação para preparar amostras.......

Discussion

Neste artigo, é descrito um método simples e eficaz de preparação de amostras de proteínas de membrana de microvessels recentemente isolada do tecido de cérebro de rato. Várias abordagens para isolamento de microvessels de cérebro de rato e/ou geração de preparações de membrana da microvasculatura isolada têm sido relatadas na literatura^{13,20,21,22 , 24}. embor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coquetel de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	#P8340	Componente do tampão de microvasos cerebrais
D-manitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Componente do tampão de microvasos cerebrais
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Componente do tampão de microvasos cerebrais
Base Trizma	Sigma-Aldrich	#T1503	Componente do tampão de microvasos cerebrais
Dextrano (MW 75.000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextrano usado em etapas de centrifugação para separar microvasos do parênquima
cerebral Zetamina	MWI Animal Health	#501072	Anestésico geral
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	Anestésico geral
solução salina a 0,9%	Western Medical Supply	N/A	Anestésico geral diluente
Papel de filtro (12,5 cm de diâmetro)	VWR	#28320-100	Usado para remoção de meninges do tecido cerebral Tubos de
centrífuga	Sarstedt	#60.540.386	Tubos descartáveis usados para etapas de centrifugação de dextrano
Pierce™ Ensaio Coomassie Plus (Bradford)	ThermoFisher Scientific	#23236	Medição da concentração de proteína em preparações de membrana
Wheaton Overhead Power Homogeneizer	DWK Life Sciences	#903475	Necessário para homogeneização de amostras
10,0ml de almofariz de vidro e moedor de tecido de pilão	DWK Life Sciences	#358039	Necessário para homogeneização de amostras
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	#H1758	Necessário para ajuste de pH de tampões
Albumina de	ThermoFisher Scientific	#23210	Padrão de proteína para pinça padrão de ensaio de Bradford
	de ciência fina	#91100-12	Usado para dissecação de tecido cerebral Ferramentas de
ciência fina	Friedman-Pearson Rongeurs	#16020-14	Usado para abrir o crânio para isolar o cérebro
Tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	ThermoFisher Scientific	#352070	Usado para coleta de tecido cerebral após isolamento
Pipetas de vidro Pasteur	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Usado para aspiração de detritos celulares após spins de dextrano
Etanol, anidro	Sigma-Aldrich	#459836	Usado para limpeza de moedor de tecidos; diluído a 70% com água
destiladaTubos de ultracentrífuga	Beckman-Coulter	#41121703	Usado para ultracentrifugação de amostras