Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

Resumo

Apresentamos um método automatizado para reconstrução tridimensional do germline Caenorhabditis elegans . Nosso método determina o número e a posição de cada núcleo dentro da linha germinativa e distribuição de proteína germline análises e estrutura do citoesqueleto.

Resumo

O germline Caenorhabditis elegans (c. elegans) é usada para estudar vários processos biologicamente importantes, incluindo a dinâmica de desenvolvimento, apoptose e cromossomo de células-tronco. Enquanto o germline é um excelente modelo, a análise é frequentemente duas dimensões devido ao tempo e o trabalho necessário para análise tridimensional. Grandes leituras em tais estudos são a posição/número de núcleos e distribuição da proteína dentro da linha germinativa. Aqui, apresentamos um método para executar a análise automatizada do germline usando microscopia confocal e abordagens computacionais para determinar o número e posição dos núcleos em cada região do germline. Nosso método também analisa a distribuição de proteína germline que permite o exame tridimensional da expressão da proteína em diferentes origens genéticas. Além disso, nosso estudo mostra variações na arquitetura do citoesqueleto em distintas regiões do germline que podem acomodar requisitos específicos de desenvolvimento espaciais. Finalmente, nosso método permite que a contagem automatizada do esperma na espermateca de cada linha germinativa. Tomados em conjunto, nosso método permite a análise fenotípica rápida e reprodutível do germline c. elegans .

Introdução

A conservação de sinalização com mamíferos vias faz c. elegans , um excelente modelo para o estudo de vários processos biológicos^1,2. Em nosso laboratório, usamos o c. elegans germline para estudar o desenvolvimento de células-tronco, apoptose e expressão gênica. Enquanto o germline é uma estrutura tridimensional, muitos estudos são duas dimensões devido à natureza demorada e trabalhosa de análise tridimensional. É altamente provável que a análise bidimensional pode deturpar na vivo eventos no germline. O hermafrodita de adultos de c. elegans tem dois braços da linha germina....

Protocolo

1. preparação e criação de minhoca

Nota: Consulte a Tabela de materiais para todas as informações do produto.

1. Cultura de Escherichia coli OP50: cultura OP50 bactérias em caldo lisogenia (LB) (triptona 1%, 0,5% de fermento, 0,5% de NaCl, pH 7.0) durante a noite a 37 ° C, sem antibióticos.
2. Semente 400 µ l de bactérias OP50 para placas de mídia (NGM) de crescimento de nematoides (1,5 g de NaCl, 8,5 g de ágar-ágar, 1,25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO₄ e 25 mL de tampão de₄ de KPO 1 M) e o ar seco as bactérias p....

Resultados

Figura 1 indica o tempo necessário para análise tridimensional da linha germinal. Hermafroditas L4 incubadas a 20 ° C foram dissecadas para isolar germlines e coradas com DAPI, faloidina e anticorpos contra as proteínas da linha germinal. Germlines são fotografadas usando microscopia confocal. Microscopia confocal e coloração requer aproximadamente 24 h. análise computacional para o germline completa exige 10-15 min para contar o número e a posição dos núcleo.......

Discussão

O objetivo do presente protocolo é melhorar a precisão e reduzir o tempo necessário para a análise da linha germinal. Após preparação padrão de germlines dissecado, um modelo tridimensional do germline núcleos é preparado por processamento computacional. Permitindo a observação da distribuição de núcleos germline no espaço, renderização tridimensional calcula o número de núcleos em regiões específicas da da linha germinal. O aspecto crítico do nosso método é uma definição precisa dos parâmetros de tamanho e forma dos núc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C. elegans cepas: tipo selvagem (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bactérias	Placas caseiras
meios de crescimento de nematóides (NGM)
anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 anticorpo conjugado criado em cabra	Thermofisher Scientific	A-21236
Corante citoesquelético faloidina	Thermofisher Scientific	A-12380
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P5899
Tetramisol	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4	Sigma Aldrich	G0887
10X PBS pH 7.4	Thermofisher Scientific	AM9625
Tween-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Solução de paraformaldeído a 37%	Merck Millipore	1040031000
Soro de cabra normal	Sigma Aldrich	G9023
	Sigma Aldrich	F6182
Etanol	Millipore
Metanol	Sigma Aldrich	34860
20° C & 25° CIncubadora	Qualquer marca
Microscópio de luz	Qualquer marca
Microscópio confocal	Qualquer marca (Leica, Zeiss)
Computador equipado com Imaris suit 8.4.1 ou versão posterior, licença completa para usar o software e o software Matlab.	Bitplane
Phospho tamponado com solução salina, pH 7.4	Lâminas de microscópio Teflon caseiras
	Tekdon	Telefone: 941-322-8288