O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo para a criação de um fantasma gordo-água prático que pode ser personalizado para produzir espectros com diferentes porcentagens de gordura e volumes.
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Artigo de método
Phantoms de gordura-água para validação de ressonância magnética: um protocolo flexível e escalável
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como novas técnicas são desenvolvidas para o tecido adiposo de imagem, métodos para validar tais protocolos estão se tornando cada vez mais importantes. Fantasmas, réplicas experimentais de um tecido ou órgão de interesse, fornecem uma solução de baixo custo, flexível. No entanto, sem acesso a equipamento especializado e caro, construindo fantasmas estáveis com altas frações de gordura (EG., > níveis de gordura fração 50% como aqueles vistos em marrom tecido adiposo) pode ser difícil devido à natureza hidrofóbica de lipídios. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado, de baixo custo para a criação de fantasmas de 5 x 100 mL com gordura frações de 0%, 25%, 50%, 75% e 100% usando componentes facilmente acessíveis (água destilada, ágar, solúvel em água e suprimentos de laboratório básico (placa de aquecimento, copos, etc.) surfactante, benzoato de sódio, agente de contraste gadolínio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), óleo de amendoim e óleo solúvel surfactante). O protocolo foi projetado para ser flexível; Ele pode ser usado para criar espectros com diferentes frações de gordura e uma grande variedade de volumes. Fantasmas, criadas com essa técnica foram avaliadas no estudo de viabilidade que comparou os valores de fração de gordura do gordo-água ressonância magnética para os valores-alvo nos phantoms construídos. Este estudo resultou em um coeficiente de correlação de concordância de 0.998 (intervalo de confiança de 95%: 0.972-1,00). Em resumo, estes estudos demonstram a utilidade da gordura fantasmas para validar as técnicas de imagem através de uma gama de tecidos clinicamente relevantes e órgãos de tecido adiposo.
Introdução
Interesse em quantificar o tecido adiposo e conteúdo de triglicérides usando modalidades de imagem, como ressonância magnética (MRI), se estende em muitos campos. Áreas de investigação incluem a investigação de depósitos de tecido adiposo de branco e marrom e gravidez ectópica armazenamento de lipídio em órgãos e tecidos como o fígado1, pâncreas2e músculo esquelético3. Como essas novas técnicas de quantificação adiposa são desenvolvidas, métodos são necessários para confirmar que imagens parâmetros são válidos para pesquisa e aplicações clínicas.
Fantasmas, réplicas experimentais de um tecido ou órgão, fornecer uma ferramenta de baixo custo, flexível e controlado para desenvolver e validar imagem técnicas4. Especificamente, os fantasmas podem ser construídas para consistem de gordura e água em uma proporção ou gordura fração de volume (FF) comparável do tecido de interesse clínico. Clinicamente, os valores de FF em tecidos e órgãos podem variar amplamente: FF em marrom tecido adiposo cai entre 29,7% e 93,9%5; o fígado médio FF em pacientes de esteatose é 18,1 ± 9,0%6; o FF do pâncreas em adultos em risco para intervalos de diabetes tipo 2 entre 1,6% e 22,2%7; e em alguns casos de doença avançada, pacientes com distrofia muscular de Duchenne podem ter valores de FF de quase 90% em alguns músculos8.
Porque moléculas não polares tais como lipídios não se dissolvem bem em soluções compostas por moléculas polares tais como a água, criar fantasmas estáveis com um alvo de alto FF permanece desafiador. Para FF até 50%, muitos métodos existentes podem ser usados para criar gordura água fantasmas9,10,11,12. Outros métodos que atingir maiores FFs normalmente exigem equipamentos caros como um homogeneizador ou uma célula ultra-sônico disruptor13,14. Embora essas técnicas fornecem um roteiro para altas fantasmas de FF, restrições de equipamentos e quantidades variadas de detalhes experimentais limitam os esforços para criar fantasmas água gordura robusto e reprodutível.
Baseando-se estas técnicas anteriores, desenvolvemos um método para construir os phantoms água gordura rentável e estável em um valores de intervalo personalizável de FF. Este protocolo detalha os passos necessários para completar 5 x 100 mL de gordura fantasmas com valores de FF de 0%, 25%, 50%, 75% e 100% usando uma única placa de aquecimento. Pode ser facilmente ajustada para criar vários volumes (10 a 200 mL) e percentagens de gordura (% de 0 a 100). A eficácia da técnica fantasma foi avaliada a viabilidade estudo comparando gordo-água MRI FF valores para os valores-alvo FF nos phantoms construídos.
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Protocolo
1. preparar a estação de trabalho e materiais
- Cumpra todas as regras de segurança de laboratório. Use luvas e óculos de proteção. Leia a folha de dados material de segurança para cada um dos reagentes utilizados e tomar as devidas precauções. Revise os materiais e lista de equipamentos, procedimentos de manipulação de produtos químicos e produtos vidreiros precauções.
Atenção: Este protocolo requer o uso de uma placa de aquecimento em altas temperaturas. Use cautela e use luvas resistentes ao calor quando interagindo com hot recipientes e não toque na superfície da chapa. - Limpar o espaço de trabalho e limpe as superfícies com desinfetante. Lave as mãos e colocar luvas.
- Esterilize todos os instrumentos e o interior de todos os frascos de vidro para reduzir o risco potencial de contaminação e aumentar a longevidade do fantasma.
Nota: Se o fantasma será usado para mais de um par de dias, Limpe periodicamente a superfície do fantasma concluído com etanol para impedir o crescimento bacteriano.
2. preparar a solução de água
- Prepare o espaço de trabalho para a solução de água. Posicione os seguintes materiais e equipamentos no banco: cilindro, copo de 400 mL, barra de agitação, escala, 2 barcos de pesar x, espátula, 2 x 1.0 mL seringas com agulha, água destilada, agente de contraste gadolínio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), formou-se catiônico solúvel em água, ágar e benzoato de sódio.
Nota: Seringas podem ser usadas com ou sem agulhas. No entanto, usar agulhas irá melhorar a precisão da medição e evitar respingos quando o conteúdo está sendo adicionado às soluções de água ou óleo. - Coloque uma barra de agitação em um copo de 400 mL. Use um cilindro de 100 ou 200 mL graduada para medir 300 mL de água destilada e despeje a água no copo. Colocar o copo na placa de aquecimento e definir a 90 ° C, com uma taxa de agitação de 100 rpm.
Nota: Altas temperaturas são usadas neste protocolo para obter resultados rápidos. Porque as soluções não são deixadas na placa de aquecimento por longos períodos de tempo, a temperatura de set-point para a chapa não reflete a temperatura da solução. - Use uma escala calibrada para medir 0,30 g de benzoato de sódio em um barco de pesar. Adicione o benzoato de sódio para a solução de água.
- Use uma seringa para medir 0,6 mL do tensoactivo solúvel em água. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar. Segure a agulha alguns milímetros sobre o centro da solução e libere lentamente o surfactante solúvel em água para evitar respingos nas paredes do copo.
- Utilizando uma seringa limpa, medida 0,24 mL do agente de contraste de gadolínio-DTPA. Adicioná-lo para o copo, usando a mesma técnica como na etapa 2.4.
Nota: O gadolínio-DTPA é usada para ajustar propriedades de relaxamento de MRI do fantasma para coincidir com as do tecido de interesse. O leitor pode ajustar o volume do gadolínio-DTPA adicionado para melhor coincidir com as propriedades de relaxamento do tecido de interesse. - Medida 9,0 g de ágar-ágar em um barco de pesar. Lentamente, colher o ágar com uma espátula para o copo com água.
- Uma vez que tudo foi adicionado à solução de água, aumentar a temperatura da placa de aquecimento a 350 ° C e agitar barra velocidade de 1100 rpm durante 5-10 min derreter o ágar.
- Para verificar se o ágar é derretido, brevemente remover a solução da água da placa de aquecimento, pare de mexer e ver a cor da solução. Ágar-ágar derretido deve ser limpo (sem enfeites ou aglomerados) e amarelo ou laranja na cor.
- Uma vez que o agar é totalmente derretido, use uma seringa ou despeje cerca de 3,5 mL de solução de água em um pequeno frasco. Se a solução de teste não define ou separa após 5-10 min, o ágar não é derretido. Aumentar a temperatura da placa de aquecimento volta a 350 ° C e continuar a solução de aquecimento.
- Repita a etapa 2.8 até a solução de água em conjuntos de frasco de teste corretamente.
- Deixe a solução de água na placa de aquecimento a 50 ° C e 100 rpm. Limpar o espaço de trabalho e preparar a solução de óleo.
- Remover os seguintes materiais de banco: escala, 2 x pesar barcos, espátula, 2 x 1.0 mL seringas com agulha (usado), água destilada, agente de contraste gadolínio-DTPA, catiônico solúvel em água, ágar e benzoato de sódio.
- Posicione os seguintes materiais e equipamentos no banco: copo de 400 mL (limpo), agitar bar (limpo), seringa de 2,0 mL com agulha, óleo de amendoim e óleo solúvel surfactante.
3. solução de óleo
- Coloca uma nova barra de agitação em um copo limpo 400 mL. Use um cilindro graduado para medir 300 mL de óleo de amendoim e despeje o copo. Retirar o copo que contém a solução de água e colocar o copo de solução de óleo na placa de aquecimento. Conjunto para 90 ° C, com uma taxa de agitação de 100 rpm durante 1 min.
Nota: o óleo de amendoim é usado porque tem um espectro de ressonância magnética nuclear similar em comparação com triglicérides no tecido adiposo humano15.- Não deixe o óleo na placa de aquecimento sem vigilância. Se o óleo fica muito quente e começa a fumar, remova-o da placa de aquecimento e reduzir a temperatura antes de retornar o óleo para a chapa.
- Medida de 3,0 mL do tensoactivo solúveis no óleo com uma seringa limpa. Usando a mesma técnica descrita na etapa 2.4, adicione o óleo solúvel surfactante para o copo. Defina a placa de aquecimento a 150 ° C e 1100 rpm por 5 min misturar totalmente a solução de óleo.
- Levar a solução de óleo fora a chapa e limpar o espaço de trabalho em preparação para a criação do fantasma.
- Remover os seguintes materiais de banco: seringa de 2,0 mL com agulha (usado), óleo de amendoim e óleo solúvel surfactante.
- Posicione os seguintes materiais e equipamentos no banco: 250 mL frasco de Erlenmeyer, agite bar (limpo), pipetas volumétricas, titular da pipeta volumétrica e frascos de vidro de 5 x 120 mL.
4. criar fantasma emulsão
- Prepare-se para as soluções de água e óleo pipetas volumétricas. Pipetas só devem ser usadas com suas respectivas soluções para evitar a contaminação cruzada.
- Corresponde ao tamanho da pipeta para o volume que está sendo usado no protocolo. Por exemplo, use pipetas volumétricas de 2 x 50 mL (50 mL de solução de água + 50 mL de solução de óleo) para criar um 100ml fantasma com um alvo FF de 50% de gordura.
- A solução de água na placa de aquecimento e a placa de aquecimento a 300 ° C e 1100 rpm. Depois de 4-5 min, desliga o misturador.
- Usando uma pipeta volumétrica, verificar se a solução de água está pronta para extração parcialmente encher a pipeta com uma pequena quantidade (5-10 mL) da solução e soltando volta para o copo. Se a solução de água pode ser facilmente removida e lançada sem excessivas remanescentes na pipeta, avançar para o próximo passo, caso contrário, deixá-lo na placa de aquecimento e verifique novamente em 2-3 min.
Nota: Os componentes da solução de água são mais suscetíveis à configuração e separando, por isso é melhor manter a solução de água, agitação e/ou quente tão frequentemente quanto possível. Se a solução de água não é aquecida e mexida antes de ser transferido, será muito difícil medir volumes precisos devido à tendência de ágar a se congelar quando resfriado. - Cuidadosamente, adicione uma barra de agitação limpa para um Erlenmeyer de 250 mL. Levar a solução de água fora da chapa, medir o volume adequado (tabela 2) e transferir para o Erlenmeyer.
- A solução de óleo na placa de aquecimento e a 90 ° C e 1100 rpm para garantir que a solução é homogênea. Após 1-2 min, remover a solução de óleo da placa de aquecimento e substituí-lo com o balão de Erlenmeyer.
- Medir a quantidade apropriada da solução de óleo (tabela 2) e adicionar lentamente a solução de água no Erlenmeyer.
- Uma vez que toda solução de óleo foi adicionada, aumentar a temperatura de 300 ° C e manter a agitação a 1100 rpm. Misture as soluções combinadas para 4-5 min (deve haver vórtice da barra de agitação). A emulsão deve ser branca, com uma textura cremosa.
- Use um retriever de barra de agitação magnética para remover a barra de agitação.
Nota: O recuperador de barra de agitação deve ser usado para remover as barras do rebuliço de todas as emulsões de futuros. Limpe-a completamente entre cada uso. - Use luvas resistentes ao calor para com cuidado, despeje a mistura no Erlenmeyer em um frasco de vidro limpo 120 mL. Lentamente, despeje a mistura em baixo do lado da jarra de vidro para evitar bolhas na mistura, enquanto esfria.
- Limpe o frasco Erlenmeyer e agitar bar e, em seguida, repita os passos 4.2-4.8, ajustando as quantidades das soluções de água e óleo, até que todos os fantasmas são criadas.
Nota: Certifique-se que o vidro é legal antes de limpar.
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Resultados
Se a solução de água foi preparada corretamente, uma pequena quantidade da solução deve congelar rapidamente em um frasco de teste (Figura 1, à esquerda). Se a solução separa (Figura 1, direita), a solução deve ser preparada novamente (conforme instruído na etapa 3.8 do protocolo). Se a emulsão separa (exemplos na Figura 2, esquerdo e direito), o fan...
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Discussão
Nós descrevemos um método robusto para criar fantasmas gordo de água adequado para validar as técnicas de imagem médicas usadas para quantificar o tecido adiposo e triglicérides conteúdo vivo em. Criando dois reservatórios (um para a solução de óleo) e outro para a solução de água, os phantoms estáveis com uma variedade de valores de FF, incluindo valores superiores a 50%, foram construídos sem a necessidade de equipamento caro. Fantasmas de FF altas (> 50%) fornecer o utilitário para assegurar-se de técnicas de...
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que poderia ser interpretada como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Apoio financeiro para esta pesquisa foi fornecida o National Institutes of Health (NIH) e Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças do rim (NIDDK) / NIH R01-DK-105371. Agradecemos a Dr. Houchun (Harry) Hu para conselhos e sugestões na criação fantasma gordo de água.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Água destilada | Amazon | B000P9BY38 | Base de solução aquosa |
| Ágar | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | Agente gelificante |
| Surfactante solúvel em água | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | Surfactante/agente emulsificante |
| Gadolínio-DTPA Agente de contraste | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | Ressonância magnética Agente de contraste. |
| Benzoato de Sódio | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | Conservante |
| Óleo de Amendoim | Amazon | 54782-LOU | Base de solução de óleo |
| Surfactante Solúvel em Óleo | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | Surfactante/agente emulsificante |
| Placa de aquecimento com agitador | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| Barras de agitação (em forma de ovo) | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| 400 mL Béquer | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| 250 mL Erlenmeyer Flask | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| 25 mL Pipeta Volumétrica de Vidro | Fisher Scientific | 13-650-2P | Quantidade = 2 |
| 50 mL Pipeta Volumétrica de Vidro | Fisher Scientific | 13-650-2S | Quantidade = 2 |
| Pipeta Volumétrica de Vidro de 75 mL | Fisher Scientific | 13-650-2T | Quantidade = 2 |
| Seringa de 3,0 mL | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| Seringa de 1,0 mL | Espátula Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| Escala Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | ||
| (Resolução de 100g X 0,01g) | Amazon | Barcos de Pesagem AWS-100-BLK | |
| Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | ||
| Frascos de Vidro de 120 mL | McMaster Carr Supply Co | 3801T73 | |
| Luvas Resistentes ao Calor (par) | Agulhas | Amazon B075GX43MN | |
| Barra de Agitação Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | ||
| 18" retriver | Fisher Frasco | 14-513-70 | |
| 1 Dram | Fisher Scientific | 03-339-25B |
Referências
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Reimpressões e permissões
