Method Article

Antimicrobiana caracterização de materiais avançados para aplicações de bioengenharia

DOI:

10.3791/57710

⸱

August 4th, 2018

 ,  , 
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo para a caracterização antimicrobiana de materiais avançados. Aqui, a atividade antimicrobiana em superfícies do materiais é medida por dois métodos que se complementam: uma baseia-se no teste de difusão de disco de ágar-ágar, e o outro é um procedimento padrão com base na norma ISO 22196:2007.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento de novos materiais avançados com propriedades de reforçadas está se tornando cada vez mais importante em uma ampla gama de aplicações de bioengenharia. Assim, muitos novos biomateriais estão sendo projetados para imitar ambientes específicos necessários para aplicações biomédicas, tais como a engenharia de tecidos e administração de medicamentos controlados. O desenvolvimento de materiais com propriedades melhoradas para a imobilização de células ou enzimas também é um tópico de pesquisa atual em engenharia de Bioprocessos. No entanto, uma das propriedades mais desejáveis de um material nestas aplicações é a capacidade antimicrobiana para evitar quaisquer infecções indesejáveis. Por isso, apresentamos fácil de seguir protocolos para caracterização de materiais com base em (i) o teste de difusão de disco de ágar (método de difusão) e (ii) a norma de 22196:2007 ISO para medir a atividade antimicrobiana em superfícies materiais (contato antimicrobiana método). Este protocolo deve ser executado usando bactérias gram-positivas e Gram-negativas e leveduras para cobrir uma ampla gama de microorganismos. Por exemplo, 4 materiais com diferentes naturezas químicas são testados seguindo este protocolo contra Candida albicans, Escherichia colie Staphylococcus aureus. Os resultados destes testes apresentam atividade antimicrobiana-não para o primeiro material e aumento da atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas para os outros 3 materiais. No entanto, nenhum dos 4 materiais são capazes de inibir o crescimento de Candida albicans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Falha de implante é uma consequência de infecções microbianas que ocorrem apesar da profilaxia antimicrobiana e condições de trabalho asséptico. Esse problema está causando muito elevados custos de saúde e é angustiante entre pacientes1. Importante bactérias como Staphylococcus aureus são atualmente consideradas muito perigosos patógenos em infecções nosocomiais associadas a cateteres e outros implantes médicos e são os principais contaminantes de instrumentos médicos,2. Portanto, o desenvolvimento de estratégias de antimicrobianos romance é urgentemente necessária para utilizações diárias e médicas.

Agentes antimicrobianos incluem antibióticos3, compostos de amónio quaternário4, íons/óxidos de metal5e peptídeos antimicrobianos (AMPs)6. Os antibióticos estão tornando-se gradualmente menos eficientes devido à resistência bacteriana7, que está a aumentar devido ao uso excessivo de antibiótico8. Quaternários de amônio são apenas muito eficientes para um uso a curto prazo por causa da resistência microbiana9. Íons/óxidos de metal muito tempo têm sido utilizados como agentes antimicrobianos muito eficazes e são usados em muitos produtos comerciais comuns, incluindo ligaduras, filtros de água, tintas, etc.10,11,12. No entanto, foi demonstrado que estes tipos de compostos podem ser tóxicos para alguns tipos de células de mamíferos,13.

Ampères mostram excelente antimicrobiano e imunomodulador propriedades14,15, e bactérias parecem achar muito difícil desenvolver uma resistência contra os16. No entanto, o processo para produzir puros AMPs é caro; Portanto, uma produção em grande escala não é viável. Assim, estratégias para combater os problemas na produção de amplificadores têm sido desenvolveram (por exemplo, pequenas peptoid antibacteriana molecular imita17, peptoids18, α-peptídeos19 e peptídeos β20). Polypeptoids e metacrilato-terminou polipeptídeos foram sintetizados para revestimentos de antimicrobianos e anti-incrustantes21.

O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos, tais como materiais avançados em puro ou de forma híbrida, capaz de prevenir e tratar infecções multirresistentes, é cada vez mais necessária. Uma ampla gama de novos materiais avançados para muitos campos da bioengenharia como tecido e engenharia de Bioprocessos foram desenvolvidos com propriedades físicas e químicas melhoradas nas últimas décadas através de vários métodos: plasma-polimerização de enxerto para um substrato hidrofóbico22,23,24, alfaiataria de reticulação densidade25,26, polimerização em solução27,28,29 , 30,31,de dissolução porogen32e pela incorporação de nanomateriais como grafeno óxido (GO)33,34,35,36 e carbono de nanofibras (CNFs)37.

O estudo da capacidade antimicrobiana destes novos materiais poderia aumentar exponencialmente a sua aplicabilidade potencial de bioengenharia e, portanto, tornou-se essencial. Apresentamos um protocolo fácil de seguir para quantificar a atividade antimicrobiana de tais novos materiais avançados. Aqui, após a preparação da amostra, dois métodos complementares são seguidos: o primeiro baseia-se o ágar disco difusão teste38 (método de difusão) e o segundo é baseado na ISO 22196:2007 norma39 para medir a atividade antimicrobiana em superfícies de material (método de contato).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação da amostra

  1. Corte as amostras de material em discos de diâmetro de 10 mm com um diâmetro de 10 mm soco cilíndrico.
    Nota: Materiais frágeis podem ser amaciados em solventes estéreis adequados para 1 h e corte em discos. Por exemplo, materiais hidrofílicos como alginato de zinco foram testados seguindo este protocolo e foram umedecidos em água esterilizada antes de cortá-los para evitar a ruptura da amostra. No entanto, outros materiais hidrofóbicos, como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) não é necessário qualquer tipo de inchaço anterior a fim de ser devidamente cortado.
  2. Os discos de material de amostra a 60 ° C em um forno de vácuo a seco (< 10-2 Torr) por 24 h.
    Nota: Alguns materiais podem ser necessário uma alta temperatura de secagem. No entanto, é importante para não chegar a uma temperatura que termicamente pode degradar o material.
  3. Medir as espessuras de película de material com um paquímetro digital.
    Nota: Este protocolo recomenda a utilização de materiais filmes com espessuras constantes e semelhantes ao comparar a atividade antimicrobiana de diferentes materiais.
  4. Esterilize a cada amostra por imersão em etanol 70% por 10 min e subsequente radiação ultravioleta (UV) por 1h por cada lado.
    Nota: A radiação UV pode ser realizada colocando cada amostra em uma placa de Petri estéril dentro de uma capa de fluxo laminar com uma lâmpada W 12.0 da radiação UV-C.
    Atenção: Os pesquisadores não devem expor se à radiação UV, porque é mutagênico.
  5. Execute as etapas 1.1, 1.2, 1.3 e 1.4. com os discos de material de controle.
    Nota: Polietileno tereftalato (PET) ou materiais alternativos não-antimicrobiano podem ser usados como discos de controle no método de difusão e de contato. Além disso, quando caracterizar materiais tratados ou nanocompósitos, a matéria-prima deve ser usada como material de controlo.

2. recomendados microorganismos

Nota: Recomendamos o uso de 3 diferentes microorganismos para estudar a capacidade antimicrobiana do material testado contra uma ampla gama de microorganismos.

  1. Uso de culturas puras de 3 microorganismos: as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus, a bactéria Gram-negativa Escherichia colie a levedura Candida albicans.
    Nota: Outras espécies de microorganismos também podem ser testadas com este protocolo, modificando as condições de incubação, se necessário.
    Atenção: As medidas de biossegurança necessárias devem ser seguidas de acordo com o tipo de microorganismo empregado no presente protocolo.
  2. Trabalhar com material esterilizado ou pre-estéril e usar um queimador de Bunsen durante todo o processo de manipulação microbiana ou um gabinete de segurança biológica (se necessário) para assegurar condições assépticas.
    Nota: Autoclave recomendados são condições 121 ° C durante 15 min para meios de cultura e a 121 ° C durante 20 min. para o material de trabalho e resíduos biológicos.

3. teste de difusão de disco ágar (método de difusão)

Nota: Quando uma difusão líquida de compostos antimicrobianos pode ser o principal mecanismo antimicrobiano de materiais avançados, o método de difusão pode fornecer informações muito úteis sobre a capacidade antimicrobiana desses materiais. O material disco localizado no centro da placa de ágar-ágar pode formar uma zona transparente anel (halo) onde uma inibição do crescimento de microorganismos ocorre após 24 h da cultura (ver Figura 1).

  1. Procedimento de teste de difusão
    1. Preparar e autoclave tryptic soy agar (TSA), seguindo as instruções do fabricante.
    2. Despeje o TSA em placas de Petri estéreis sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar.
      Nota: As placas TSA devem ser de 4 – 6 mm de espessura.
    3. Cultura de microorganismos diferentes a ser testado por via aeróbia para 18-24 h nos pratos de Petri com TSA em uma incubadora a 37 ° C.
    4. Preparar e autoclave tryptic soy caldo (TSB), seguindo as instruções do fabricante.
    5. Despeje o TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50 mL com uma pipeta sorológica pré-esterilizados sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar.
    6. Resuspenda algumas colónias de passo 3.1.3 em 25 mL de TSB contido num tubo de centrífuga estéril usando um cotonete estéril e vórtice por 1 min obter uma mistura uniforme.
    7. Ajustar a absorbância (a 540 nm) da cultura com um espectrofotômetro para o número apropriado de formadoras de unidades (UFC) por mL: aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL para bactérias e de 1 x 106 a 5 x 106 UFC/mL para o fermento.
      Nota: Os volumes de cultura e cubeta para medir a absorvância devem ser selecionados de acordo com o tipo de espectrofotômetro utilizado.
    8. O caldo microbiano durante 5 segundos para melhorar a dispersão de microorganismos e, brevemente, mergulhe um cotonete estéril na suspensão microbiana de vórtice. Remova o excesso de líquido da zaragatoa, pressionando-o contra a parede do tubo contendo a cultura.
    9. Uniformente marcam a suspensão microbiana caldo com o cotonete estéril para a superfície das placas TSA 3 aviões para cobrir toda a sua superfície com o microorganismo e deixe secar por 5 min após a inoculação.
      Nota: Para remover toda a umidade, as placas TSA devem ser colocadas abertas em posição invertida a 37 ° C por 10 a 15 min antes da inoculação.
    10. É necessário esterilize um par de pinças imergindo-os num copo de precipitação com etanol 96% e em seguida em chamas-lhes com um bico de Bunsen ou lamparina.
    11. Coloque os discos de amostra para serem testadas e controlar o disco no centro das placas TSA usando o par de pinças estéreis.
    12. Por via aeróbia, Incube as placas TSA em posição invertida a 37 ° C por 24 h.
      Nota: Para evitar qualquer risco de contaminação, é recomendável para incubar as placas TSA em posição invertida. No entanto, se o disco de amostra separa as placas TSA, não execute esta etapa em posição invertida. Nesse caso, recomenda-se secar as placas do capuz de fluxo laminar. Este teste antimicrobiano deve ser realizada pelo menos em quadriplicate em dias diferentes, para garantir a reprodutibilidade.
  2. Verificação de pureza e concentração de suspensão microbiana
    Nota: As seguintes etapas são necessárias para verificar a concentração microbiana, determinada com o espectrofotómetro na etapa 3.1.7 correcta e certifique-se de que não havia nenhuma contaminação microbiana ambiental. Uma contaminação microbiana ambiental pode ser facilmente detectada pelo aparecimento de vários tipos de colónias microbianas após 24h de cultura. Além disso, não há contaminação microbiana do meio TSB durante sua manipulação nas diluições decimais seriais deve ser assegurada com uma placa de controle negativa TSB.
    1. Dispense o TSB estéril (preparado no passo 3.1.4) em tubos estéreis microcentrifuga utilizando uma micropipeta com pontas autoclavadas adequadas em condições assépticas. Um deles será utilizado como um controle negativo de TSB.
    2. Realize diluições decimais seriais com a suspensão microbiana caldo utilizada na etapa 3.1.9 nos tubos microcentrifuga estéril contendo TSB.
    3. Espalhou-se 100 µ l de cada diluição em placas TSA, usando uma espátula de Drigalski pré-esterilizados ou um instrumento alternativo. Também propagar-se 100 μL de meio TSB sem microorganismo (preparado na etapa 3.2.1) numa placa de TSA como uma placa de controle negativa TSB.
    4. Por via aeróbia, Incube as placas TSA aeróbia em 37 ° C por 24 h.
    5. Conte o número de colônias para verificar que o UFC/mL são semelhantes ao determinado na etapa 3.1.7.
    6. Verificar que não há nenhuma contaminação microbiana ambiental nas placas TSA com apenas um tipo de colônias.
    7. Verificar que não há nenhuma contaminação microbiana na placa de controle negativo TSB mostrando sem colônias

4. medida da atividade antimicrobiana em superfícies Material (método de contato)


Nota: Quando o contato de superfície pode ser o principal mecanismo antimicrobiano de alguns materiais avançados, o método de contato pode fornecer informações muito úteis sobre a capacidade antimicrobiana desses materiais. Neste método, os microrganismos são colocados diretamente sobre a superfície do material e sua inibição de crescimento pode ser determinada após um determinado período de tempo.

  1. Procedimento inicial
    1. Preparar e autoclave TSB seguindo as instruções do fabricante.
    2. Despeje o TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50 mL com uma pipeta sorológica pré-esterilizados sob condições assépticas, utilizando um bico de Bunsen ou um capuz de fluxo laminar.
    3. Cultura de microorganismos diferentes para serem testadas por via aeróbia pernoite no tubo com TSB em um agitador orbital (140 rpm) a 37 ° C.
    4. Diluir a cultura durante a noite em 20 mL de TSB num tubo de centrífuga pré-esterilizados 50ml a uma concentração de aproximadamente 106 UFC/mL (determinado com um espectrofotômetro a 540 nm).
      Nota: Os volumes de cultura e cubeta para medir a absorvância devem ser selecionados de acordo com o tipo de espectrofotômetro utilizado.
    5. Realize diluições em série decimais dessa cultura em tubos estéreis microcentrifuga contendo TSB. Espalhe a 100 µ l de cultura em placas TSA e incubá-lo por via aeróbia a 37 ° C por 24 h.
    6. Contar o número de colônias para garantir uma concentração inicial de célula de aproximadamente 1 x 106 UFC/mL
    7. Coloque 4 discos de controlo para a contagem microbiana após 24 h e 4 discos de amostra de cada tipo dos materiais testados para a contagem microbiana após 24h em separa poços de uma placa estéril de 48.
    8. Pipete 150 µ l da suspensão microbiana para cada superfície de disco.
  2. Microbiana, contando com o controle e materiais testados (após 24h)
    1. Após a etapa 4.1.6, incube por via aeróbia os 4 discos de amostra restante na placa de 48 a 37 ° C por 24 h.
      Nota: Este tempo de incubação 24 h pode ser modificado a fim de estudar a inibição de crescimento em momentos mais curtos ou mais longos.
    2. Após 24h de incubação, pipete 850 µ l de PBS estéril para a superfície os 4 discos de amostra e misturá-lo com a 150 µ l da suspensão microbiana.
    3. Recolher a mistura de suspensão microbiana/PBS e cada disco da placa de 48 e transfira para um tubo de 10 mL pré-esterilizados.
    4. Vórtice a mistura de suspensão microbiana/PBS e cada disco por 1 min, proceda à sonicação é a 50 Hz durante 5 min e vórtice novamente por 1 min assegurar que não há microorganismos viáveis se aderiu à superfície material.
    5. Realizar diluições decimais de série de cada cultura lisada em tubos estéreis microcentrifuga contendo TSB e espalhar 100 µ l de cultura em placas TSA e incubá-lo por via aeróbia a 37 ° C por 24 h.
    6. Conte o número de colônias, que são o número de microorganismos viáveis em cada amostra e controle de superfície de disco. Expresse este número de células viáveis em (UFC/mL).
    7. Tire uma foto da cultura microbiana final para os discos de amostra e controle.

5. análise de resultados antimicrobiano

figure-protocol-1
Figura 1: as medições para a largura normalizada do antimicrobiano "halo". Este painel mostra o diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Análise de resultados de método de difusão
    1. Medir o diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d) (ver Figura 1) com um paquímetro digital.
      Nota: A inibição zona ou antimicrobiano "halo" é formada como consequência da inibição do crescimento microbiano produzida pelo disco material antimicrobiano (ver Figura 1). É possível observar que existe uma zona de anel transparente perto da amostra em comparação com o resto da placa, onde os microorganismos têm crescido corretamente (zona opaca).
    2. Determine a largura normalizada do antimicrobiano "halo" (nwauréola) de cada disco, aplicando a equação (1).
      (1)figure-protocol-2
    3. Determine a média e o desvio-padrão da largura normalizada dos antimicrobianos "halo" com os 4 determinado nwhalo valores de cada amostra.
    4. Tire uma foto da cultura microbiana final com o disco do material.
      Nota: O diâmetro da zona de inibição (diz) e o diâmetro do disco (d) podem também ser medidos a partir da fotografia tirada na etapa 5.1.4 usando uma software de processamento de imagem apropriada.
  2. Análise de resultados do método de contato
    1. Determine o número de microorganismos viáveis, recuperado de acordo com a equação (2).
      (2)figure-protocol-3
      Nota: Aqui, N é o número de microorganismos viáveis recuperado por cm2 por provete; C é a contagem de placa; D é o factor de diluição; A é a área da superfície da amostra em cm2 determinada com o diâmetro do disco de amostra.
    2. Determine a perda de viabilidade (LV) para refletir a inibição do crescimento celular, aplicando a equação (3).
      (3)figure-protocol-4
      Nota: Aqui, C é o número médio de microorganismos viáveis (N) em CFU/mL•cm2, recuperadas as amostras de controle após 24 h; S é o número de microorganismos viáveis (N) em CFU/mL•cm2, recuperadas os provetes após 24 h.
    3. Determine a média e o desvio-padrão da perda de viabilidade com 4 valores LV(%) determinados de cada amostra.

Results

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Este protocolo foi utilizado, por exemplo testar a capacidade antimicrobiana de 4 materiais com diferentes naturezas químicas contra os 3 recomendado microorganismos: Escherichia coli, Staphylococcus aureuse Candida albicans . Os resultados dos testes de difusão de disco de ágar (método de difusão) exibiram atividade antimicrobiana-não para o primeiro material (M1), como ocorreu no disco de controle (C, a imagem não é mostrada) e aumento da atividade antibacteriana contra Gram-positivas e Gram-negativas bactérias para os outros 3 materiais M2, M3 e M4 (ver Figura 2).

figure-results-1
Figura 2: resultados do método de difusão antimicrobiana. Este painel mostra o método de difusão antimicrobiana para os material (M1, M2, M3 e M4) 4 discos (diâmetro 10 mm x 1 mm de espessura) contra s. aureus e e. coli após 24 h de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra as diferentes larguras normalizadas do antimicrobiano "halo" (nwhalo) para os exemplo diferentes materiais M1, M2, M3 e M4 contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas calculado com a equação (1). No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento da levedura Candida albicans (imagens não mostradas).

figure-results-2
Figura 3: resultados de difusão antimicrobiana "halo". Este painel mostra o normalizado "halo" (nwhalo) para cada material (M1, M2, M3 e M4) disco (diâmetro 10 mm x 1 mm de espessura) contra s. aureus e e. coli após 24 h de incubação. As diferenças são estatisticamente significativas (p < 0,01). No entanto, a amostra M1 não exibiu nenhuma atividade antimicrobiana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados do método contato também exibiram atividade antimicrobiana-não para o primeiro material (M1), como ocorreu no disco de controle (C) e crescente atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas para os outros 3 materiais (ver e serem A Figura 4).

figure-results-3
Figura 4: antimicrobianos entre em contato com os resultados do método. Este painel mostra as placas respectivas 90mm do 4 material (M1, M2, M3 e M4) superfície atividade antimicrobiana ensaio de acordo com a ISO 22196:2007 após 24 h de incubação para S. aureus e Escherichia coli (factor de diluição de 10-4). C é a bactéria viável recuperada o disco de controle após 24 h de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A perda de viabilidade (%) foi determinada pela equação (2) e (3), conforme indicado no presente protocolo (ver Figura 5).

figure-results-4
Figura 5: perda de viabilidade pelo método de contato. Este painel mostra a perda de viabilidade (%) de M1, M2, M3 e M4 contra S. aureus e e. coli na superfície do material. Amostra M1 não exibiu nenhuma atividade antimicrobiana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento da levedura Candida albicans pelo método de contato de qualquer (imagens não mostradas). Portanto, 3 destes 4 materiais avançados mostrou resultados positivos antimicrobianos contra bactérias gram-positivas e Gram-negativas e, portanto, pode ser muito útil para muitas aplicações de bioengenharia com requisitos de alta atividade antibacteriana. No entanto, nenhum dos 4 materiais foram capazes de inibir o crescimento de levedura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A atividade antimicrobiana dos novos materiais avançados pode ser analisada pelo presente protocolo fácil de seguir, consistindo de 2 procedimentos complementares com base em 2 métodos existentes: a difusão do disco de ágar teste38 e a atividade antimicrobiana medido na superfícies de materiais de acordo com a ISO 22196:2007 norma39.

Neste campo de pesquisa, muitos dos testes antimicrobianos relatados na literatura são altamente dependentes do ensaio. Portanto, é muito importante para ter detalhado e consistente protocolos no lugar através de laboratórios. Este artigo é um passo nessa direção. Além disso, pode ser muito útil para muitos pesquisadores que são menos experientes neste campo e requerem procedimentos em profundidade, passo a passo a seguir para obter resultados precisos.

Este protocolo pode ser usado com vários tipos de materiais cortados em formas de disco de 10 mm de diâmetro. Materiais frágeis podem estar inchados em um solvente adequado para 1h processar o processo de corte mais fácil. Assim, materiais hidrofílicos como alginatos podem ser hidratados em água destilada esterilizada. Outros solventes, como álcool, cetona e diclorometano, podem ser empregados para inchar materiais hidrofóbicos para 1h antes de cortá-los. No entanto, alguns materiais tais como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) não precisa ser inchado e podem ser cortados diretamente. Depois disso, é muito importante secar os discos de material de amostra em um forno a vácuo e esterilizar cada amostra com etanol e radiação UV por 1h para evitar qualquer risco de contaminação.

Este protocolo recomenda TSA e TSB como meios de cultura e o uso de culturas puras de 3 microorganismos para alcançar uma ampla gama de microorganismos: as bactérias gram-positivas Staphylococcus aureus, a bactéria Gram-negativa Escherichia coli, e a levedura Candida albicans. No entanto, meios de cultura alternativos e outros microorganismos que necessitam de condições de incubação diferentes também poderiam ser usados com este protocolo. Às vezes, apenas 1 microorganismo é testado para ter uma ideia inicial da atividade antimicrobiana de um novo material.

Os materiais mostrando forte atividade antimicrobiana contra o recomendado 3 diferentes tipos de microorganismos também devem ser testados contra patógenos resistentes aos antibióticos como resistente à meticilina Staphylococcus epidermidis (MRSE), que têm sido utilizados com sucesso com este protocolo. Outros importantes microorganismos resistentes aos medicamentos que estão causando muita preocupação são as Gram-positivas resistentes à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) e resistentes à vancomicina enterococos (VRE) e as Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa40,,41.

Inibição de biofilme e a atividade antimicrobiana dos materiais contra outros tipos de microorganismos como vírus e parasitas, não podem ser testados com este protocolo. No entanto, este protocolo fornece um ponto de partida muito útil para um estudo antimicrobiano de um novo material avançado.

No teste de difusão de ágar antimicrobiana disco, uma etapa crítica ocorre quando o disco de amostra tem que ser colocado no centro da placa, porque alguns materiais dobram tão logo eles entrar em contato com a mídia de ágar. Neste caso, é recomendável usar um estéril par de pinças para desdobre cuidadosamente a amostra. Por outro lado, o método de contato, é fundamental para o controle de lavar e discos de amostra muito bem com PBS pipetando-los quatro vezes seguido por um vigoroso num Vortex e sonication para garantir que não há microorganismos viáveis permanecem aderidos ao material superfície.

Este protocolo de vídeo pode ser utilizado em muitas aplicações de bioengenharia, tais como engenharia de Bioprocessos, engenharia de tecidos, administração de medicamentos controlados, materiais de embalagem, tratamento de águas residuais e agricultura, que use biomateriais com um altamente desejável capacidade antimicrobiana.

Os resultados obtidos com este protocolo são qualitativos (as imagens) e quantitativo (a largura normalizada do antibacteriano "halo" e a perda de viabilidade) com uma boa análise da sua reprodutibilidade (média ± desvio-padrão). Ao comparar diferentes materiais, estes valores médios obtidos com a análise de resultados de método de difusão e de contato devem ser analisados por ANOVA One-Way, seguido de análise post hoc da Turquia, a fim de estudar se eles são, estatisticamente, significativamente diferentes (p < 0,01).

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de reconhecer a Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir para o apoio financeiro para este trabalho através da 001UCV-231-2017 e 2018-231-001UCV concede.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Punção cilíndricade 10 mm de diâmetro
soria genlabP10190 mm de diâmetro, ágar
de soja tríptico estéril (TSA)Liofilchem610052Meio desidratado 500 g (pó)
Caldo de soja tríptico (TSB)Liofilchem610053Meio desidratado 500 g (pó)
Cotonete estérilEUTOTUBO300200
Centrífuga tubosVIDRA FOC, SA42990050 mL, estéril
EtanolVWR83813360Etanol absoluto
Placa estéril de 48 poçosCOSTAR3548Fundo plano com tampa, tratamento para cultura de tecidos, não pirogénico, poliestireno
Um par de pinçasBRAUN24612036Toothless
Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).VWRE404-100TAPBS
Forno a vácuo com bomba de vácuo conectadaJP Selecta, SA5900620
Cobertura de fluxo laminarTELSTAR Technologies, SLTELSTAR AH-100Lâmpada de 12,0 W de radiação UV-C
Classe II Cabine de segurança biológicaLABOGENEMARS 1200
IncubadoraASTEC CO, LTDSCA-165DR
Misturador de vórticeEspectrofotômetro BiosanV-1 Plus
Macherey-Nagel, AlemanhaNanocolor UV/VIS II
Queimador de BunsenJP Selecta, SA7001539
Queimador de álcoolVIDRA FOC, SA1658/20Caso seja necessária a esterilização dentro da cabine de segurança biológica classe II
Agitador orbitalsartorius stedim8864845
SonicatorSELECTA300061750/60 Hz
Paquímetro digitalACHA17-2600-150 mm
Pipeta sorológicaFisherbrand13-678-1125 mL, pipeta
sorológicaVWR612-49505 mL,
pipeta sorológicaVWR612-554110 mL, estéril
MicropipetaGILSONFA10005PPipetman L P200L, plástico 20-200 µ
L MicropipetaGILSONF123602Pipetman P1000, 200-1000 µ L
Micropipeta GILSONFA10016Pipetman L P12X300L, 20-300 µ L
Ponteiras de micropipetaLABBOXTIBP-200-9602-200 µ L
Ponteiras de micropipetaLABBOXTIBP-1K0-480100-1000 µ L
Tubo pré-esterilizado INSULAB30140210 mL 
Câmera fotográficaCanon EOS 5DQualquer câmera com alta resolução também pode ser utilizada
Bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus  cepa V329Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888– 2896 (2001)
Bactérias Gram-negativas Escherichia coliColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECT CECT101
Levedura Candida albicansColecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECT CECT1394
Tubos de microcentrífuga DASLAB175508Autoclave 1,5 mL
JP Selecta, SA4002136
Espectrofotômetro-cubetasUVAT Bio CBF-0902-024,5 mL
Espátula DrigalskiLABBOXSPRP-L05-1K0Estéril, descartável 
esferas de vidro (2 mm de diâmetro)Hecht Karl1401/2Autoclavável, dispositivo alternativo à espátula Drigalski
Sacos de autoclaveDELTALAB200318Para esterilizar resíduos microbiológicos ou material contaminado
Dispositivo electrónico de enchimento de pipetasJetPipJET BIOFIL
Frasco de laboratório com rosca ISO, graduado, borossilicato 3.3LABBOXSBG3-100-010100 mL, para meios de cultura em autoclavagem
Frasco de laboratório com rosca ISO, graduado, borossilicato 3.3LABBOXSBG3-250-010250 mL, para meios de cultura em autoclave
Frasco de laboratório com rosca ISO, graduado, borossilicato 3.3LABBOXSBG3-500-010500 mL, para meios de cultura em autoclavagem
Frasco de laboratório com rosca ISO, graduado, borossilicato 3.3LABBOXSBG3-1K0-0101000 mL, para meios de cultura autoclaváveis
Luvas de látexDENIA2278000000
Fita indicadora para esterilizaçãoLABBOXSTAP-A55-001Fita auto-adesiva com papel impregnado que se torna colorido quando exposto ao processo de esterilização.
Suporte universal para tubos de ensaioLABBOXMTSP-001-001Para segurar tubos de centrífuga Suporte
para tubos de microcentrífugaVWR211-0210Para segurar tubos de microcentrífuga
Loop estérilACEFE S.A.10014005510 µ L de capacidade para cultura microbiana 
Material M1Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Tipo de material 1 
Material M2Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Tipo de material 2
Material M3Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Tipo de material3
Material M4Universidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Tipo de material 4 
Material CUniversidad Cató lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)Material de controle
Placas de Petri estéril estéril

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).">Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668(2016).">Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668(2016).
  3. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104(2011).">Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104(2011).
  4. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).">Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).">Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).">Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).">Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).">Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).">Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).">Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).">Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).">Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).">Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).">Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).">McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).">Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).">Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).">Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).">Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565(2000).">Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565(2000).
  21. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).">Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).">Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).">Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).">Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).">Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).">Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).">Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).">Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684(2017).">Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684(2017).
  34. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235(2017).">Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235(2017).
  35. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).">Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).">Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405(2018).">Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405(2018).
  38. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).">Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584(2007).">ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584(2007).
  40. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).">Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).">Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

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