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Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

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DOI:

10.3791/57712

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27 de maio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.

Resumo

A ascensão recente em partículas vírus-like (VLP) em biomédica e pesquisa de materiais pode ser atribuída à sua facilidade de biossíntese, tamanho discreto, programação genética e biodegradabilidade. Enquanto eles são altamente favoráveis para reações de bioconjugation para a adição de ligantes sintéticos em sua superfície, o intervalo em metodologias de bioconjugation sobre estes capsids nascidos aquosas é relativamente limitado. Para facilitar a direção da pesquisa de biomateriais funcionais, devem considerar-se reações de bioconjugation não-tradicionais. A reação descrita neste protocolo usa dibromomaleimides para introduzir a nova funcionalidade no solvente dissulfeto expostas de um VIP com base em Qβ do bacteriófago. Além disso, o produto final é fluorescente, que tem a vantagem de gerar uma sonda controlável em vitro , usando um conjunto de filtro disponíveis comercialmente.

Introdução

Usar capsids virais nanométricas emergiu como um campo excitante, que visa alargar o âmbito de aplicações em pesquisa biomédica1,2,3. Recombinantes expressas partículas vírus-like (VLP) são estruturalmente derivadas de vírus, mas falta-lhes o material genético viral original tornando-os não-infecciosa nanopartículas proteicas. Como as características de superfície são geneticamente programadas e cada capsídeo é expressa forma idêntica aos antes e depois dela, é possível saber a localização e o número de cadeias de lado reativo dos aminoácidos com precisão atomística. Em muitos casos, ambas as superfícies exteriores e interiores possuem muitos tipos de solvente expostas aminoácidos, que podem ser viável acrescidos através de reações de bioconjugation - reações que formam ligações covalentes entre uma biomolécula e sintético molécula de4,5.

Reações de Bioconjugation ajudam biomoléculas de interesse têm as mais diversas funcionalidades de uma forma relativamente simples. Moléculas de interesse, tais como drogas terapêuticas6, etiquetas fluorescentes7 e polímeros8,9 podem ser pre-sintetizadas e caracterizadas antes de que estão ligados na superfície de VIPs. Um VIP particularmente comum em biomedicina e pesquisa de biomateriais foi o VIP com base em Qβ do bacteriófago, que, como recombinantes expressas, são 28 nm icosahedral capsídeo viral10. Os locais mais comuns de reação em Qβ são lisinas por uma larga margem, embora nós comunicaram recentemente a conjugação bem sucedida11 de compostos dibromomaleimide para os dissulfetos reduzidos que revestem os poros da Qβ através de uma reação de Haddleton-Baker. A reação procede com bom rendimento e, igualmente importante, sem perder a estabilidade térmica das partículas. Ao mesmo tempo, esta reação gera fluorescência induzida por conjugação, que pode ser usada para rastrear a absorção destas partículas em células. Neste trabalho, demonstramos a conjugação de polietileno glicol (PEG) sobre a superfície da Qβ através da reação de Haddleton-Baker, que resulta em um fluoróforo amarelo brilhante. Estas partículas podem ser rastreadas então como eles estão tomados por células. O protocolo aqui ajudará pesquisadores gerar novo peguilado fluorescente nanopartículas proteicas baseadas em Qβ, apesar de seus princípios são aplicáveis a um dos muitos outros VIPs contendo solventes dissulfetos expostos.

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Protocolo

1. preparação

  1. Fazer o ágar-ágar lisogenia caldo (LB) e despeje placas12.
  2. Transforme o BL21(DE3) com um plasmídeo pET28 que contém a sequência de proteínas de revestimento wtQβ.
    1. Descongele células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) em um banho de gelo. Colocar 50 μL de células em um tubo de microcentrifugadora.
    2. Adicionar 2 μL do plasmídeo em um tubo e agite suavemente o tubo. Então incube no gelo por 30 min.
    3. Calor-choque as células para 45 s num banho de água que é exatamente a 42 ° c. Coloque o tubo de volta no banho de gelo imediatamente após calor-choque e incubar durante 5 min.
    4. Adicione 950 μL de LB mídia que não contenha qualquer antibiótico.
    5. Agite a cultura a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
    6. Placa 100 μL da cultura em placas de ágar LB (com canamicina) e incube a placa durante a noite a 37 ° C. Selecione colônias brancas quando necessário.
  3. Faça mídia Super ideal caldo (SOB).
    1. Autoclave dois 2 L confusos Erlenmeyers num ciclo superdry.
    2. Em um ambiente asséptico, pesar e adicionar 20,0 g de triptona, extrato de 5,0 g de levedura, 2,469 g de sulfato de magnésio anidro, 0,584 g de cloreto de sódio e 0,186 g de cloreto de potássio para cada balão.
    3. Trazer o volume de 1 L com água ultrapura em cada balão e autoclave ao ciclo de líquido.
    4. Uma vez que a mídia SOB alcançou a temperatura após a autoclavagem, adicionar 1 mL de canamicina (100mg/mL) para cada litro de mídia e armazenar a 4 ° C.
  4. Fazer o tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
    1. Fazer 1 M potássio monobásico solução dissolvendo-se 68,045 g de potássio monobásico em 500 mL de água ultrapura.
    2. Fazer 1 M potássio dibásico solução dissolvendo 87,09 g de potássio dibásico em 500 mL de água ultrapura.
    3. Adicione 38,5 mL de solução de potássio monobásico e 61,5 mL de potássio dibásico para uma garrafa de 1 L.
    4. Ajustar o pH a 7.00, se necessário e trazer para um volume de 1 L.
  5. Faça 5 – 40% gradientes de sacarose em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
    1. Em tubos de centrífuga de 50 mL, prepare soluções com sacarose 5 – 40% (aumentando em incrementos de 5%) dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
    2. Depósito 3,3 mL da solução de sacarose 5% na parte inferior de um tubo de fundo redondo de policarbonato 38 mL utilizando uma seringa de agulha longa e repita isto para cinco outros tubos.
    3. Depositar cuidadosamente 3,3 mL da solução de sacarose 10% na parte inferior do tubo e Retire cuidadosamente a agulha como para não incomodar o gradiente. Repita para os outros cinco tubos.
       
  6. Continue a depositar camadas 3,3 mL das soluções de sacarose, aumento de 15% para 40% em cada tubo, enquanto sendo cuidadoso para não perturbar o gradiente.
  7. Quando completo, cobrir os topos dos gradientes com papel alumínio e armazene a-80 ° C.

2. a expressão de Qβ

  1. Limpe a área com água sanitária de 1:1 (etanol) banco.
  2. Faça dois fermentos de 3 mL em um ambiente asséptico adicionando única colônias de Escherichia coli BL21(DE3) em 3 mL de mídia SOB um ambiente asséptico.
  3. Cresce num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% de umidade relativa (rH) durante a noite.
  4. Inocule a cultura em mídia SOB:
    1. Tire o agitador ambos os fermentos de 3 mL e, em um ambiente asséptico, despeje cada cultura starter em um dos dois 2L perplexo Erlenmeyers com 1 L de mídia de soluço fresca em cada um.
    2. Coloque a mídia inoculada num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH.
  5. Cresce a bactéria num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH até OD600 atinge 0,9 – 1.0.
  6. Adicione 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando uma pipeta P1000 para induzir a expressão da proteína.
  7. Deixe a mídia no agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH durante a noite.
  8. Remova mídia de agitador da manhã seguinte e centrífuga usando garrafas de 1000ml a 20.621 × g por 1 h a 4 ° C para colher as células.
  9. Desprezar o sobrenadante e coletar o centrifugado.
    1. Despeje o sobrenadante para um balão com cerca de 5 mL de água sanitária para matar as bactérias. Isso é lixo.
    2. Use uma espátula para raspar o centrifugado do fundo da garrafa centrífuga e colocar a pelota em um tubo de centrífuga de 50 mL.

3. purificação de Qβ

  1. Ressuspender as células com ~ 20 a 30 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
  2. Verifique se a ressuspensão tem sem pedaços e lisar as células usando um processador de microfluidizer de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Lise as células pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas.
  3. Centrifugue o lisado em garrafas de 250 mL centrífuga a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
  4. Descartar a pelota e medir o volume de sobrenadante em mL. Multiplique esse valor por 0,265 e adicionar essa quantidade de g de sulfato de amônio para o sobrenadante.
  5. Misture a 4 ° C, durante pelo menos 1 h em um prato misture a 200 rpm para precipitar-se a proteína.
  6. Centrifugue em frascos de 250 mL a 20.621 x g, durante 1 h a 4 ° C.
  7. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com cerca de 10 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
  8. Adicione volumes iguais de clorofórmio/n-butanol de 1:1 para a amostra bruta e mistura num Vortex durante alguns segundos.
  9. Centrifugue em tubos de 38 mL a 20.621 × g por 30 minutos a 4 ° C.
  10. Recupere a camada aquosa superior utilizando uma pipeta Pasteur. Seja cauteloso para não tomar qualquer do gel como camada que se formou entre a camada aquosa e orgânica.
  11. Descongelar o seis gradientes de sacarose pré-fabricados de 5-40% e carregar cerca de 2 mL do extrato para cada um.
  12. Se a 99.582 x g, durante 16 h a 4 ° C, com desaceleração livre.
  13. Brilha uma luz emitindo luz de diodo (LED) em cada tubo e uma faixa azul deve tornar-se visível. Recupere essas partículas com uma seringa de agulha longa.
  14. Ultrapellet as partículas a 370.541 x g, durante 2,5 h a 4 ° C.
  15. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o transparente de partículas purificadas com tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).

4. quantificação e confirmação do produto

  1. Use o ensaio de Bradford para quantificar o produto13.
  2. Reduzindo a execução e não de redução de sódio Dodecil sulfato de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar o produto14.
    Nota: Reduzir SDS-PAGE é usado para confirmar o peso molecular da proteína do revestimento; não-reduzir SDS-PAGE é para confirmar a estrutura de ordem superior.

5. conjugação DB compostos em Qβ

  1. Reduza a dissulfetos na Qβ.
    1. Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) (TCEP) de fosfina em 1 mL de água ultrapura, tornar-se uma solução estoque de 100 x.
      Nota: Prepare TCEP fresco antes da redução.
    2. Adicione 200 µ l de Qβ (5 mg/mL) em um tubo de microcentrifugadora.
    3. Siga pela adição de 20 µ l de solução-mãe de 100 x TCEP.
    4. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Re-ponte dissulfeto reduzido usando dibromomaleimide polietileno glicol (PEG-DB).
    1. Dissolva 0,0017 g de dibromomaleimide-polietileno glicol (PEG-DB) em 100 µ l de DMF.
    2. Adicione 680 µ l de solução de fosfato de sódio de 10 mM (pH 5,00).
    3. Adicionar reduzida Qβ na solução de DB-PEG e observar o processo de mistura sob uma lâmpada de UV 365 nm. A fluorescência amarela brilhante pode ser visualizada imediatamente com um 365 nm portátil UV lâmpada em cima da mistura.
    4. Deixe a reação prosseguir durante a noite em temperatura ambiente (RT) em um espeto.
  3. Purificar a mistura de reação pelo filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) três vezes usando 1X PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
  4. Monitore a conjugação, não reduzindo SDS-PAGE e eletroforese em gel de agarose nativo.
    Nota: VIPs executar como partículas intactas em gel de agarose nativo, e eles são separados com base em sua carga, tamanho e forma.

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Resultados

Os derivados do dibromomaleimide podem ser sintetizados através da reação de condensação entre anidrido dibromomaleimide e aminas primárias15. Como alternativa, um método sintético suave16 usando N-metoxicarbonil ativado 3,4-dibromomaleimide aqui foi explorada por reagir com methoxypolyethylene glicol (PEG) de rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR foi usado para identificar a estrutura de compostos (

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Discussão

Comparado a purificação de proteínas menor, um único passo na purificação do bacteriófago Qβ é a centrifugação gradiente de sacarose. Após a etapa de extração de clorofórmio/n-butanol, Qβ ainda mais purified usando gradientes de sacarose 5-40%. Durante a centrifugação, as partículas são separadas com base em seus tamanhos. Partículas maiores viajam à região de densidade mais elevada, enquanto que partículas menores fica na região da baixa densidade. Qβ viaja para o terço inferior do gradiente e permanece lá enquanto impu...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

J.J.G. reconhece a Fundação Nacional de ciência (DMR-1654405) e câncer prevenção Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) pelo seu apoio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo LB (Miller) EMD Millipore1.10285.0500
Triptona, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Extrato de Levedura, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Sulfato de magnésio anidroP212121CI-06808-1KG
Cloreto de Sódio (ACS cristalino / certificado)Fisher ScientificS271-10
Cloreto de potássioFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Sistema de purificação de águaFisher Scientific4474524
Fosfato de potássio monobásicoFisher ScientificBP362-1
Fosfato de potássio dibásico anidro FisherScientificP288-500
SacaroseFisher Scientific
EtanolFisher ScientificBP2818500
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor Fisher Scientific096-041053
Sulfato de AmônioP212121KW-0066-5KG
ClorofórmioAlfa Aesar32614-M6
1-ButanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor, Balde Oscilante, AlumínioBeckman Coulter342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Conjunto
Tipo 70 Ti Rotor, Ângulo Fixo, Titânio, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Ensaio de ProteínaFisher ScientificPI23200
TRIS HydrochlorideResearch Products InternationalT60050-1000.0
TetrametiletilenodiaminaAlfa AesarJ63734-AC
Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfinaSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimida 97%Sigma Aldrich553603-5G
PolietilenoglicolAlfa Aesar41561-22
Fosfato de SódioFisher ScientificAC424375000
Acrilamida / bis-AcrilamidaP212121RP-A11310-500.0
Dodecil sulfato de sódioSigma AldrichL3771-100G
Persulfato de AmônioFisher ScientificBP179-100
FV3000 microscópio confocal de varredura a laserOlympus FV3000 
Revólver Labnet Ajustável Rotator Thomas Scientific 1190P25 
Garrafa de Alto Desempenho Sorvall de 1000 mL, PC, com Tampa de Alumínio Thermo Scientific010-1459
Frascos de Centrífuga Nalgene com Tampas, Copolímero de PolipropilenoThermo Scientific3141-0250
Nunc Tubos de fundo redondo; 38 mL; PCThermo Scientific3117-0380
2 L Frascos Erlenmeyer de boca estreita com borda resistentePyrex4980-2L
Amicon Ultra-4Millipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidizer Materials ProcessorMicroflufluidicsM-110P
Nalgene Tubos de centrífuga de fundo redondo de policarbonato de alta velocidadeThermo Garrafa Scientific3117-0380PK
, com Montagem de Tampa, PolicarbonatoBeckman Coulter41121703
Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mLEsterilizadores a Vapor da Série PolyLab80005
533LS-EGetinge533LS-E
TrueLine, Placa de Cultura de Células, Tratada, PS, 96 Poços, com TampaLabSourceD36-313-CS
Tubo de Centrífuga Cônica Falcon 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Tubo Microcentifuge: 1.5mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 Agitador OrbitalVWR Scientifc Products14005-830
Tetra Handcast systemsBio-Rad1658000FC
Polipropileno, 250 mLBeckman Coulter41121703
Espectrofluorômetro NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Long Needle Hamilton7693
Exel International Seringas de 5 a 6 cc Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balancede Ponderação InteligenteIWT_PM100
Falcon Tubo de Centrífuga Cônica de 50 mLFisher Scientific14-432-22
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 poços, 50 µ lBio-Rad456-1084
S25590Bde Balde Unidades de filtro centrífugo F144802 Tecnologia

Referências

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
  13. Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
  14. Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  15. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  16. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  17. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  18. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  19. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

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