Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para estágio e dissecar a desenvolver o tecido olfativo de espécies de Drosophila . O tecido dissecado mais tarde pode ser usado para análises moleculares, como quantitativa de RT-PCR (Reverse transcrição-Polymerase Chain Reaction) ou RNA sequenciamento (RNAseq), bem como na vivo de análise como a imuno-histoquímica ou em situ hibridização.

Abstract

O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, comportamento e evolução comportamental. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sugestões químicas voláteis, além dos neurônios-hidro e thermo-sensorial. Neste protocolo, descrevemos a dissecação de desenvolver tecido olfativo periférico da espécie Drosophila adulto. Primeiro, descrevemos como fase e idade larvas de Drosophila , seguidas pela dissecação do disco da antena de primeiros estágios pupal, seguidos pela dissecação de antenas de adultos e estágios meados-pupal. Mostramos também métodos onde as preparações podem ser utilizadas em técnicas moleculares, tais como a extração de RNA para qRT-PCR, RNAseq ou imuno-histoquímica. Esses métodos também podem ser aplicados a outras espécies de Drosophila , após desenvolvimento pupal espécie-específicos são determinados e respectivas fases são calculados para envelhecimento adequado.

Introduction

O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, estudos de comportamento e evolução comportamental^{1,2,3, 4}. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sinais químicos voláteis além de neurônios sensoriais hidro - e thermo^1,5,6. O objetivo geral do presente manuscrito é demonstrar ....

Protocol

O seguinte protocolo é consistente com as diretrizes de ética estabelecidas pelo Comitê de ética de pesquisa Universidade Duke.

1. tecido preparação e encenação do desenvolvimento da Drosophila melanogaster Pupa

1. Em primeiro lugar, identifica quantas moscas serão necessárias para a dissecação. Por RT-PCR e RNAseq, colete 100-200 discos da antena e antenas de indivíduos que são necessários nas fases prepupal, de 8 h APF, 40 h/a APF e adulto. Por imuno-histoquímica, disse o indivíduo 10-20.
2. Limpar todos os materiais, incluindo almofadas de dissecação e fórceps, usando lenços com 70% EtOH. Se o material dissecado é ....

Results

O tecido olfativo em desenvolvimento dissecado pode ser usado para a extração de RNA, seguida por RT-PCR para avaliar a expressão do gene ou pode ser tomado através de protocolos de imuno-histoquímica para determinar seu padrão de expressão e a sub celular localização de genes de interesse. Nesta seção, apresentamos resultados representativos de qualquer protocolo. A Figura 1 é o representante RT-PCR quantitativo mostrando a transcrição dos genes de olfactory.......

Discussion

Este protocolo é um recurso útil para laboratórios interessados em identificar os programas genéticos e transcriptional operando no desenvolvimento de tecido olfativo de Drosophila , bem como uma análise comparativa destes programas através de Drosophila espécies. É especialmente útil se sistemas-nível transcricionais perfis de diferentes estádios de desenvolvimento são necessários como um primer para futuros estudos. O protocolo descrito aqui demonstra como estágio e isolar a desenvolver o tecido olfat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate-buffered Saline	Gibco	70011-044	Diluir a 1X em água livre de RNase
CO2 tank	Air Gas	CD R200
Dois fórceps afiados (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Soluções de isolamento de RNA Microscópio
		de dissecação
Balde pequeno com
			P20 e P200
		microfuga de 1,7 mL	Compre nuclease grátis para obter melhores resultados
Tubos de PCR de 0,2 mL
de paraformaldeído	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Diluir a 0,2% v/v em placas
			Petri
Papel de filtro de 55mm	Whatman	1001-055	Molhe com água e coloque em uma placa de Petri para manter as pupas úmidas
Incubadora
deionizado H2O			Compre nuclease livre ou trate com DEPC
Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone	Dow Corning		para ser usado para fazer almofadas de dissecação de tampas de placas Terizaki.
MicroWell Mini Bandejas com tampas	Nunc	438733	Tampas podem ser usadas para fazer almofadas de dissecação de silicone
Anticorpo anti-GFP de coelho	MBL corpor internacional	PM005	anticorpo primário
de camundongo anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	anticorpo primário
ADL195 (anti lamina, camundongo)	Dev estuda hydoma ban	ADL195-s	anticorpo primário
Alexa Fluor® 488 cabra anti-coelho IgG (H + L)	invitrogen	A11008	Anticorpo secundário
Cy3 Cabra Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Anticorpo secundário
Triton X-100, detergente de grau proteico, solução a 10%,	detergente de 648463		CALBIOCHEM
Rotador de laboratório	Thermo scientific		Rotator
Nuclease Água Livre	Growcells.com	NUPW-0125	Limpadores
de Tecido de Leve	VWR	82003-822	Para suprimentos de limpeza e dissecação
Superscript II	invitrogen	18064014	Transcriptase Reversa
QIAshredder (50)	Extração de RNA	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)	Extração de RNA	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - PLACA MULTIPOÇOS 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBPróximo PCR 2X Master Mix de alta fidelidade	qPCR	NEB	M0541S