Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Summary

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Abstract

Bactérias, dentre os mais importantes agentes causadores de várias doenças de planta, secretam um conjunto de proteínas efetoras em célula de planta hospedeira para subverter o sistema imunológico de planta. Durante a infecção efetores citoplasmáticos são entregues para o citosol de anfitrião através de um tipo sistema do secretion de III (T3SS). Após o parto para a célula da planta, o effector(s) alveja o compartimento específico para modular processos de célula do host para a sobrevivência e replicação do patógeno. Embora tenha havido algumas pesquisas sobre a Localização subcellular das proteínas efetoras nas células hospedeiras para entender sua função na patogenicidade usando proteínas fluorescentes, investigação da dinâmica dos efetores injetados diretamente de bactérias tem sido um desafio devido à incompatibilidade entre o T3SS e proteínas fluorescentes.

Aqui, descrevemos nosso método recente de um sistema de proteína verde fluorescente de superfolder divisão otimizado (sfGFP^OPT) para visualizar a localização de efetores entregadas via o T3SS bacteriana na célula hospedeira. O sfGFP11 (11^th β-vertente de sfGFP)-etiquetado effector secretada através o T3SS pode ser montado com uma organela específica alvejada sfGFP1-10^OPT (1-10^th β-vertente de sfGFP) líder para emissão de fluorescência no local. Este protocolo fornece um procedimento para visualizar o sinal de fluorescência sfGFP reconstituído com um proteínas efetoras de Pseudomonas syringae em uma organela especial nas instalações de Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

Introduction

As plantas são organismos sésseis que encontram inúmeros patógenos invasores, incluindo bactérias, fungos, vírus, insetos e nematoides em todo seu ciclo de vida. Entre as phytopathogens, os patógenos bacterianos Gram-negativos tais como Pseudomonas spp. e Ralstonia spp., infectar suas plantas hospedeiras, inserindo-se através de feridas ou aberturas naturais, como os estomas e Hidatódio¹. Para colonizar com sucesso plantas hospedeiras, patógenos bacterianos evoluíram para desenvolver uma variedade de fatores de virulência². Quando as bactérias invadem uma planta hospedeira, eles injetam uma série de pro....

Protocol

Nota: Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. preparação de materiais vegetais (4 semanas)

1. Preparação para as plantas de N. benthamiana
   1. Semeie 2 sementes de s. benthamiana na superfície do solo de cada pote, cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e permitir que as sementes germinar em um 25 ° C, 60% câmara de crescimento de umidade com um ciclo de 16/8-h claro/escuro fotoperíodo.
   2. Depois de duas semanas, escolher e descartar a menor mudas em cada vaso e continuar a crescer plantas sob as mesmas condições de crescimento como aplicado para a germ....

Results

A estrutura do β-tambor de GFP é composta por onze β fios e pode ser dividida em dois fragmentos, a vertente de^th (GFP11) 11 e de 1-10^th strand (GFP1-10^OPT). Embora nenhum dos dois fragmentos fluorescentes por si, Self montado sfGFP pode emitir fluorescência quando os dois fragmentos existem nas proximidades (figura 1A). Neste sistema, sfGFP1-10^OPT-expressando Arabidopsis ou N. benthamiana plantas .......

Discussion

O protocolo descrito aqui é usado para monitorar a localização exata das proteínas efetoras injetado pelo T3SS bacteriana em célula de planta hospedeira ao ser infectado. Anteriormente, o sistema GFP de separação foi usado como uma ferramenta para estudar a Localização subcellular das proteínas de mamíferos^23,36, Salmonella T3E localização e entrega de Agrobacterium VirE2 através da T4SS para o planta células³⁷. Para apli.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
forte Arabidopsis< / forte >			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmídeo			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-tagged Vetor compatível com gateway para sistema de entrega de efetor baseado em T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoramento espaço-temporal de efetores de Pseudomonas syringae via secreção tipo III usando fragmentos de proteína fluorescente dividida. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à canamicina (25 ug / ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à Gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente à gentamicina (25 ug / ml)
< forte > cepas bacterianas < / forte >
< em > Agrobacterium tumefaciens < / em > GV3101			Csaba Koncz e Jeff Schell, O promotor do gene TL-DNA 5 controla a expressão específica do tecido de genes quiméricos transportados por um novo tipo de vetor binário de Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente à gentamicina (50 ug/ml) e rifampicina (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deleções no repertório de genes efetores de secreção tipo III de Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 revelam sobreposição funcional entre os efetores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente à rifampicina (100 ug / ml)
< forte > componentes de mídia < / forte >
< forte > meio de germinação de plantas < / forte >			Adicionar 2.165g / L Murashige & Skoog em pó, 10 g/L de sacarose em água. Ajustar para pH 5,8 e adicionar 2,2 g/L de fitagel. Autobezerro.
Murashige & Meio Skoog incluindo vitaminas	Duchefa Biochemie	M0222	Armazenar a 4 °C.
Sacarose	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB meio			Adicione 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl à água. Para meios sólidos, adicione 15 g/L de microágar. Autoclave.  Deixe a solução esfriar a 55 graus; C e adicione antibiótico, se necessário.
Triptona	BD Bioscience	211705
Extrato de levedura	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro ágar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L de peptona de protease #2, 1,5 g/L de K2HPO4, 15 g/L de ágar para água. Autoclave. Esfriar para 55 &graus; C e adicione 15 ml/L de glicerol estéril, 5 ml/L de MgSO4 ao meio. Adicione antibióticos, se necessário.
Peptona de proteose	BD Bioscience	212120
Anidro K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Manitol-Glutamato (MG) meio líquido			Adicione 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutâmico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl e 0,2 g/L de MgSO4 à água. Ajuste para pH 7
Manitol	Duchefa Biochemie	M0803
Ácido L-glutâmico	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampão			10 mM MES (2-(N-morfolino)-ácido sulfônico etano), 10 mM MgCl2, 150 µ M acetosiringona. pH 5,6; Prepare um novo tampão antes de usar.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Prepare 100 mM (pH 5,6) em água. Esterilize por filtro.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Preparar 100 mM de massa em água. Autoclave.
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406	Prepare estoque de 150 mM em DMSO.
Microscópio confocal equipamentos/materiais
710 sistema confocal de varredura a laser	Carl Zeiss
Axio observador Z1 microscópio invertido	Carl Zeiss
Iodeto de propídio	ThermoFisher	P1304MP