Artigo de método

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 de setembro de 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcrição exata é necessária para a expressão fiel da informação genética. Surpreendentemente, porém, pouco é conhecido sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição. Para preencher esta lacuna no conhecimento científico, nós aperfeiçoamos recentemente o ensaio de círculo-sequenciamento para detectar erros de transcrição durante o transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis de elegans. Este protocolo irá fornecer aos pesquisadores uma nova ferramenta poderosa para mapear a paisagem de erros de transcrição em células eucarióticas para que os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição podem ser elucidados em detalhes sem precedentes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O genoma fornece um modelo biológico preciso de vida. Para implementar esta planta corretamente, é importante para o genoma para ser transcrito com grande precisão. No entanto, a transcrição é improvável que seja livre de erros. Por exemplo, a ARN-polimerase tem sido conhecido para ser propenso em vitro1,2, e recentemente foi demonstrado que cometem erros na vivo assim3,5,6, particularmente quando confrontado com DNA danos7,8,9,10. Tomados em conjunto, estas observações indicam que os erros de transcrição ocorrem continuamente em todas as células vivas, sugerindo que poderia ser uma potente fonte de proteínas mutantes.

Este processo, denominado transcriptional mutagênese, difere de mutagénese clássica de duas maneiras. Em primeiro lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição afetam células mitóticas e pós mitóticas, como eles não dependem de replicação do DNA. Estudar os mecanismos que a fidelidade da transcrição de impacto, portanto, proporcionará insights valiosos sobre a carga de mutação das células mitóticas e pós mitóticas. Curiosamente, erros de transcrição recentemente têm sido implicados na promoção da agregação de proteínas11,12,13 e tem sido a hipótese para contribuir para ambos de carcinogênese10 e o desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias14.

Em segundo lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição são transitórios na natureza. Sua existência temporária é particularmente desafiadora porque erros de transcrição torna extremamente difícil de detectar. Por exemplo, enquanto vários laboratórios desenvolveram ensaios repórter valioso para o estudo de mutagénese transcriptional, estes ensaios só são capazes de medir erros de transcrição em um número limitado de contextos e de4,de organismos modelo15. Para superar essas limitações, muitos pesquisadores se voltaram para a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-seq), que teoricamente permite erros de transcrição que gravassem em todo a transcriptoma de qualquer espécie. No entanto, estes estudos são facilmente confundidos por artefatos de construção de biblioteca, tais como erros de transcrição reversa, erros de amplificação da PCR e a natureza propensa de sequenciamento em si. Por exemplo, reversa transcriptases cometer um erro de aproximadamente todas as bases de ~ 20.000, enquanto ARN-polimerase (RNAPs) é esperado para fazer apenas um erro cada 300.000 bases5,6. Porque a taxa de erro de transcrição reversa sozinha anões a taxa de erro de polymerases do RNA no interior das células, é virtualmente impossível de distinguir os erros de transcrição verdadeira de artefatos causados pela preparação biblioteca em dados de RNA-Seq tradicional ( Figura 1a).

Para resolver este problema, desenvolvemos uma versão otimizada do círculo-sequenciamento (Cirseq, ou C-seq doravante) ensaio5,16. Este ensaio permite ao usuário detectar erros de transcrição e outras variantes raras no ARN em todo o transcriptoma5. O ensaio da circular-sequenciamento leva este nome porque uma etapa chave neste ensaio gira em torno de circularização de RNA. Uma vez que as metas de RNA são circularizou, são reversos transcrito em uma forma de círculo rolante, para produzir moléculas de cDNA linear que contêm várias cópias do mesmo modelo do RNA. Se um erro estava presente em um desses modelos, esse erro também estaria presente em cada repetição única contida dentro da molécula de cDNA. Em contraste, os erros introduzidos por transcrição reversa, amplificação por PCR ou sequenciamento tendem a surgir aleatoriamente e assim estará presentes em apenas uma ou duas repetições. Assim, gerando uma sequência de consenso para cada molécula de cDNA, e distinção entre erros aleatórios de erros que ocorrem em todas as repetições, artefatos de construção de biblioteca podem efetivamente ser separados de erros de transcrição de verdade (Figura 1b).

Se usado corretamente, o ensaio de seq-C pode ser usado para detectar com precisão a taxa de base substituições, inserções e exclusões no RNA ao longo da transcriptoma de qualquer espécie (por exemplo, ver Traverse e Ochman17). Por exemplo, nós usamos o ensaio C-seq para fornecer medidas de todo o genoma da taxa de erro de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans com uma única resolução base5 (inédita observações). Originalmente usado para sequenciar com precisão as populações de vírus de RNA, esta versão otimizada do ensaio C-seq foi racionalizado para minimizar as condições adversas durante a preparação da biblioteca que contribuem para os artefatos de construção de biblioteca. Além disso, usando um número de kits comercialmente disponíveis, a taxa de transferência do ensaio é muito melhorada, além de sua facilidade de utilização. Se usado corretamente, este teste pode detectar com precisão a milhares de erros de transcrição por replicar, melhorando desse modo extremamente em anteriores estudos6. Em geral, este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar transcriptional mutagênese e permitirá ao usuário a ganhar novos insights sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição em uma ampla gama de organismos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação

  1. RNases são onipresentes; Portanto, limpe a área de trabalho completamente pulverizando-o para baixo com um reagente de descontaminação (por exemplo,, RNase afastado) e 70% de etanol. Pulverizador para baixo qualquer pipetas, canetas ou tubo racks para remover as possíveis fontes de contaminação de RNase.
  2. Para aumentar a prevenção de RNases contamine as amostras, vestir uma bata ou camiseta de manga longa durante a experimentação. Evite o contacto entre as luvas e o interior dos tubos de que será usado, especialmente quando recuperá-los a partir de uma caixa ou saco.
  3. Antes a transcrição reversa, mude frequentemente as luvas.
    Nota: Para obter melhores resultados, não pause o experimento antes a transcrição reversa.

2. célula e cultura Animal e coleção

  1. Coleção e o crescimento de saccharomyces cerevisiae
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada do fermento, primeiro inocular uma única colônia de S. cerevisiae em 3 mL de extrato de levedura contendo médio, adenina, peptona e dextrose (YAPD) e incube-lo durante a noite a 30 ° C, em um tambor de rolamento.
    2. Pela manhã, repicar a cultura em 50 mL de meio YAPD para uma densidade óptica (OD) de 0,1 e crescer as células até atingirem uma overdose de 0,5-0,7 (~ 7 x 106 células/mL).
    3. Recolher a cultura inteira 50 mL (aproximadamente 350 x 106 células) em um tubo cónico de 50 mL e girar as células para baixo por 3 min a 2.100 x g. Retire o meio YAPD cuidadosamente e lavar o sedimento de uma vez com PBS 1x.
    4. Em seguida, resuspenda o pellet em 480 µ l de tampão de Lise, 48 µ l de SDS 10% e 480 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1), pH 6,8. Vórtice da amostra em velocidade maxima por 5 s e a transferência para uma tampa de rosca de 1,5 mL do tubo com 750 µ l de grânulos de zircônia gelada (fornecido com o kit). Prossiga para a etapa 3 deste protocolo para a lise celular e a extração de RNA total.
      Nota: Todos os reagentes necessários para passo 2.1.4 constam o fermento recomendado kit de extração de RNA. Estes reagentes funcionam igualmente bem para leveduras, vermes e voa para que após a coleta do fermento (passo 2.1), vermes (passo 2.2) ou moscas (passo 2.3), uma abordagem unificada pode ser usada para gerar bibliotecas C-seq (passos 3 – 10).
  2. Cultura de Caenorhabditis elegans e coleção
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada de vermes, deposite 30 vermes adultos num prato fresco do ágar manchado com bactérias OP50.
      Nota: Cinco chapas são suficientes para 1 replicar.
    2. Cultura os vermes por 4 dias e recolher os vermes delicadamente lavando os pratos com 5 mL de mídia M9 e os vermes em um tubo cônico único 50ml da piscina.
    3. Gire os vermes para baixo a 100 x g por 2 min criar uma pelota. Desacelere a centrífuga na menor velocidade possível, para não perturbar a pelota.
    4. Suavemente move os vermes em um tubo de 1,5 mL, lavá-los duas vezes em 1,5 mL de mídia M9 e centrifugar o tubo a 100 x g por 1 min remover as bactérias e gerar pellets limpo 100 µ l de vermes.
    5. Resuspenda as minhocas em 480 µ l de tampão de Lise, 48 µ l de SDS 10% e 480 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio. A amostra em velocidade maxima por 5 s e transferência para uma tampa de rosca de 1,5 mL contendo µ l 750 de grânulos de zircônia gelada de tubo de vórtice. Prossiga para a etapa 3 deste protocolo para a lise dos vermes e a extração de RNA total.
  3. Coleção e cultura de drosophila melanogaster
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada de moscas, moscas de 20 – 25 em frascos que contêm glicose ou uma mídia baseada em melaço da cultura. Alíquota as moscas mais de 3 frascos, então, que cada frasco contém aproximadamente 8 moscas.
    2. Para coletar as moscas, coloque o frasco em um balde de gelo até as moscas são sedadas. Em seguida, recolhê-los com um pincel em um tubo de 1,5 mL. Não recolhem as moscas por tratamento de CO2 .
    3. Deixe as moscas quentes à temperatura ambiente (RT) e adicionar rapidamente uma mistura do premade de 500 µ l de tampão de Lise, 50 µ l de SDS 10% e 500 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio ao tubo. Use um micropestle para moer até as moscas com aproximadamente de 15 cursos, acompanhados por uma firma de torção de movimento quando o pilão atinge o fundo do tubo.
    4. Despeje a mistura de moscas e mídia de Lise em uma tampa de rosca de 1,5 mL tubo contendo µ l 750 de grânulos de zircônia gelada e o vórtice que na velocidade máxima por 5 s. prosseguir para a etapa 3 deste protocolo para a Lise das moscas e a extração de RNA total.

3. purificação de RNA total

Nota: neste momento, todos os três protocolos convergem, e uma abordagem unificada pode ser usada para gerar bibliotecas C-seq.

  1. Aperte firmemente a tampa e fixe o tubo um reaccional com um adaptador ou fita adesiva. O tubo na velocidade máxima por 10 min lisar as amostras de vórtice. Em seguida, centrifugar a amostra a 16.100 x g por 5 min separar os solventes orgânicos da fase aquosa.
  2. Cuidadosamente remova 400 – 500 µ l da fase aquosa sem perturbar a interfase branca, nublada e adicioná-lo para um tubo cônico de 15 mL contendo 1,9 mL de tampão de ligação. Misturá-los vortexing.
  3. Adicionar 1,25 mL de etanol 100% e misturar a amostra vortexing. Transferência de 700 µ l da amostra para um cartucho de filtro montado em um tubo de coleta e girar a amostra a 14.500 x g por 30 s. Repita até que todos da amostra é passado através do cartucho.
    Nota: neste momento, a amostra pode rodar ligeiramente opaca. Se muitas células, worms ou moscas foram lysed, precipitados poderiam aparecer que pode entupir o filtro.
  4. Lave o filtro uma vez com 700 µ l da solução de lavagem 1 e duas vezes com 500 µ l de solução de lavagem 2 ou 3. Termine as lavagens girando as amostras a 14.500 x g por 2 min remover qualquer excesso etanol.
  5. Transfira o refil do filtro para um tubo de golfinho de 1,5 mL e adicionar 108 µ l de solução de eluição escaldadas (65 ° C).
    Nota: Nunca expor amostras do RNA para temperaturas superiores a 65 ° C, antes de uma transcrição reversa, como fazer então vai provocar citosina para eventos de desaminação uracil que são impossíveis de distinguir de erros de transcrição.
  6. Degradar a contaminação de DNA em RNA isolado (ver passos 2.1 – 3.4) adicionando 11 µ l de 10 x 4 µ l de DNase, 2 µ l de inibidor de RNase e DNase eu de buffer que 8 U e incube-os a 37 ° C por 30 min.
  7. Depois da digestão, adicione 11 µ l de reagente de inactivação de DNase. Vórtice a mistura e deixe descansar na RT por 5 min. Em seguida, centrifugar a amostra a 15.000 x g durante 3 min para o reagente de inactivação de pelotas e coletar 110 µ l do sobrenadante sem perturbar o sedimento. Transferi o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL.
    Nota: O reagente de inactivação de DNase pode ser bastante difícil para pipeta corretamente, então visualmente inspecionar a ponta da pipeta após cada ação pipetagem. Se o reagente de inactivação torna-se demasiado viscoso para pipeta, adicione 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) igual a 1/5 do volume restante.
  8. (Verificação de qualidade) Medir a concentração do RNA total usando um espectrofotômetro. Então Reserve 1 µ l de RNA total e diluí-la a uma concentração de 10 ng / µ l em água (NF) livre de nuclease. Execute o RNA em um instrumento de análise de nucleotídeo apropriada com uma fita de RNA sensibilidade elevada para garantir que o RNA não é degradado e tem um valor de eRIN de pelo menos 8.5 ou superior (Figura 2B).

4. o mRNA enriquecimento

  1. Realizar o enriquecimento de mRNA com um miniprep mRNA kit (veja a Tabela de materiais). Adicione 140 µ l de água de NF para a amostra para um volume total de 250 µ l. Em seguida, adicionar 250 µ l de 2x do tampão de ligação, homogeneizar a amostra vortexing e adicionar 15 µ l de grânulos de oligo (dT).
  2. Misturar a amostra pipetando-lo acima e para baixo e incube-a 65 ° C por 2 min. Em seguida, coloque a amostra no RT por 10 min. Finalmente, centrifugar a amostra a 16.100 x g por 2 min para os complexos do grânulo: mRNA de Pelotas.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 500 µ l de solução de lavagem. Transferir a solução para uma coluna de rotação e girá-lo para 1 min a 15.000 x g. Descartar o escoamento e lavar a amostra com um adicional 500 µ l de solução de lavagem. Em seguida, gire a amostra por 2 min a 15.000 x g para remover qualquer excesso etanol de filtros a rotação.
  4. Transfira o filtro de rotação para um tubo de golfinho e resuspenda o pellet em coluna com 80 µ l de solução de eluição escaldadas (65 ° C). Incubar a amostra por 1,5 min 65 ° c e Elui-lo girando-o por 1 min a 15.000 x g.
  5. Medir a concentração de RNA purified usando um espectrofotômetro ou ferramenta semelhante que permite a quantificação da concentração de RNA e de qualidade.

5. RNase III fragmentação e RNA limpar

Nota: (Importante) para preparar a moléculas de RNA circulares apropriadas para a geração de bibliotecas C-seq, o RNA deve ser fragmentado para cerca de 60 – 80 bases de comprimento. Enquanto os métodos anteriores usaram uma fragmentação química de fragmento de RNA, fragmentação química com os metais pesados apresenta danos para as amostras de RNA que podem ser interpretadas como erros de transcrição durante a análise final. Para contornar este problema, refugiam-se na fragmentação usando RNase III para gerar pequenos fragmentos. Uma vantagem adicional desta abordagem enzimática é que ele cria extremidades compatíveis necessárias para ligadura, obviating a necessidade para um fim-reparo após a fragmentação química.

  1. Configurar a reação de fragmentação de RNA com 1 µ g de RNA purificado, 10 µ l de tampão de reação, 5 µ l de RNase III e NF suficiente água para trazer o volume até 100 µ l (veja a Tabela de materiais). Adicionar a enzima última e pipetar a mistura acima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar. Incube a amostra a 37 ° C por 25 min, o que tende a produzir fragmentos de RNA de aproximadamente 60-80 bases de comprimento.
  2. Uma vez concluída a incubação de 25 min, limpar a reação imediatamente com um oligo limpar e concentrador kit (veja a Tabela de materiais) para evitar qualquer digestão mais. Adicione 200 µ l de tampão de oligo-vinculação à amostra, homogeneiza-vortexing e adicionar 800 µ l de etanol 100%. Misturar a amostra vortexing e transferi-lo para uma coluna de rotação fornecida em um tubo de coleta.
  3. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 s e lave-o com 750 µ l de tampão de lavagem para remover RNase III. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 s, descartar o escoamento e lavar a amostra mais uma vez com 750 µ l de tampão de lavagem como descrito acima. Após a segunda passagem tem sido descartada, centrifugar a coluna a 15.000 x g por 2 min remover qualquer excesso etanol.
  4. Transferir a coluna para um tubo 1,5 mL e eluir a amostra em 24 µ l de água NF girando-a 10.000 x g por 1 min.
  5. Seleção de qualidade: Tomar 2 µ l dos fragmentos de RNA purificados e diluí-la 2 dobras adicionando 2 µ l de água NF a ela. Execute o RNA fragmentado em uma fita de tela para garantir que o RNA fragmentado é na faixa de 50 – 100 bases de comprimento (Figura 2C).

6. RNA circularização e rolamento círculo de transcrição reversa

  1. Para circularizar os fragmentos de RNA, calor-desnaturar 20 µ l da amostra a 65 ° C por 1 min e coloque-o no gelo imediatamente por 2 min. Em seguida, adicione 4 µ l de RNA T4 ligase buffer, 4 µ l de ATP de 10 mM, 1 µ l de inibidor de RNase, 1 µ l de água NF de 10x e 8 µ l de 50% polietileno glicol (PEG).
  2. Homogeneizar a amostra vortexing, em seguida adicionar 2 µ l de 10 U / µ l de RNA de T4 Ligase I. Mix a amostra novamente pipetando- e incube a 25 ° C, durante 2 h em um thermocycler com a temperatura da tampa fixada em 30 ° C.
  3. Após 2 h, adicionar 10 µ l de água de NF para a amostra e limpar a amostra com um kit de limpeza e concentração de oligo de acordo com as especificações do fabricante. Eluir a amostra em 20 µ l de água de NF.
  4. Para reverter a transcrever as moléculas de RNA circulares, adicionar 4 µ l de dNTPs 10 mM, 4 µ l de hexâmeros aleatória de 50 ng / µ l e 9 µ l de água NF a 9 µ l de RNA. Misture tudo bem pipetando, desnaturar a amostra a 65 ° C por 1 min e coloque-o no gelo por 2 min. loja o RNA restante como back-up.
  5. Adicionar 8 µ l de tampão de síntese primeiro-costa x 5, 2 µ l de 0,1 mM DTT e 4 µ l de 200 U / µ l reverse transcriptase e misture tudo por pipetagem. Incube a amostra a 25 ° C por 10 min, seguido de uma incubação de 20 min a 42 ° C com a tampa fixada em 5 ° C superior à temperatura de incubação.
    Nota: Um transcriptase reversa com capacidade de deslocamento do fio deve ser usado nesta etapa para permitir uma transcrição reversa do círculo rolante.
  6. Adicionar 10 µ l de água de NF para a amostra e limpar com o kit de limpeza e concentração de oligo de acordo com as recomendações do fabricante. Eluir a amostra em 42 µ l de solução de eluição.
  7. Seleção de qualidade: Diluir 2 µ l do cDNA single-stranded em 2 µ l de água NF e executar este exemplo em um instrumento de análise de nucleotídeo com uma fita de RNA de sensibilidade elevada. Se a transcrição reversa funcionou corretamente, uma biblioteca de moléculas de cDNA, que variam de cerca de 60 – 1.500 bases de comprimento, deve ser visível. Idealmente, a maioria dos cDNA é na faixa de 500-1.000 bases (Figura 2d).

7. segunda vertente cDNA síntese e reparo do fim

  1. Use um kit de síntese segundo vertente para gerar uma biblioteca de cDNA double-stranded. Colocar as amostras no gelo e adicionar 30 µ l de água de NF para 38 µ l de sua amostra. Em seguida, adicione 8 µ l de 10 x segundo Strand Buffer e 4 µ l da segunda enzima Strand e misturar a amostra pipetando suave antes de sua incubação a 16 ° C para 2,5 h.
  2. Limpar as amostras com o oligo limpar concentração kit e acordo com as recomendações do fabricante para reações de 100 µ l e eluir as amostras em 38 µ l de água de NF.
  3. Configurar a reação final-reparação adicionando 20 µ l de água de NF para 35,5 μL de cDNA double-stranded, 6,5 µ l de tampão de reação final reparar e 3 µ l do Mix de enzima de preparação final. Verifique o amortecedor da reação para precipitados brancos e dissolvê-los pela mão-aquecimento se estiver presente.
  4. Misture a reação final-reparação pipetando e incube-lo a 20 ° C por 30 min, seguido por uma segunda incubação 30 min a 65 ° C. Regule a temperatura da tampa thermocycler a 5 ° C superior à temperatura de incubação.

8. adaptador ligadura e seleção de tamanho de bibliotecas preparadas

  1. Use um módulo de preparação de várias etapas de biblioteca para os preparativos finais da biblioteca (ver Tabela de materiais). Em primeiro lugar, diluir os adaptadores para geração 10-fold de sequenciamento em 10 mM Tris-HCl a uma concentração final de 1,5 µM. Em seguida, adicione 2,5 µ l de adaptador diluído e 1 µ l de potenciador de ligadura para cada amostra e misturá-los vortexing.
  2. Adicionar 15 µ l de Blunt/TA Ligase Master Mix, misturá-lo pipetando e incube-a 20 ° C por 15 min. Em seguida, adicione 3 µ l da enzima do reagente específico uracil excisão e -incubar a 37 ° C por 15 min. Após a ligadura é completa, adicionar 13,5 µ l de água de NF para a amostra para um volume total de 100 µ l e prossiga para a seleção de tamanho.
    Nota: É melhor selecionar tamanho de moléculas de cDNA que estão na faixa de 600-800 bases de comprimento. Se as moléculas de RNA fragmentadas foram aproximadamente 60-80 bases de comprimento, selecionando para moléculas que são 600 e 800 bases de comprimento irá garantir que a maioria das moléculas selecionadas contém pelo menos três repetições em tandem, que é ideal para o processamento a jusante e análise.
  3. Para selecionar por moléculas que são 600 e 800 bp em comprimento, adicione 30 µ l de ressuspensão grânulos magnéticos (ver Tabela de materiais), aclimatados ao RT, para cada amostra e misture por pipetagem. Transferir a amostra para um tubo de 1,5 mL e incubar RT por 5 min.
  4. Coloca a amostra num suporte magnético por 5 min separar os grânulos do sobrenadante. Transferi o sobrenadante (que contém as moléculas de cDNA desejado) para um novo 1,5 mL tubo e alienar os grânulos magnéticos (que estão ligados a moléculas de cDNA grande).
  5. Adicionar uma alíquota fresca de 15 µ l de grânulos magnéticos para cada amostras, homogeneiza pipetando e incubar durante 5 min no lugar do RT. as amostras em um rack magnético e incube-os por 5 min à RT Em seguida, Retire cuidadosamente e alienar os sobrenadantes, certificando-se para não perturbar os grânulos.
    Nota: Não elimine os grânulos magnéticos, que agora contém o cDNA de destino desejado.
  6. Adicionar 200 µ l de 80% etanol para cada uma das amostras preparadas sem perturbar os grânulos magnéticos peletizados e incube por 30 s. descartar o etanol e lavar as amostras mais uma vez com 80% de etanol. Então, totalmente remover qualquer vestígio de etanol das amostras de e secar os grânulos por 5 min, mas tenha cuidado para não secar demasiado as contas. Se os grânulos são superaquecimento, rachaduras aparecerão em Pelotas.
  7. Para eluir as amostras de grânulos, retirar os tubos do suporte magnético e adicionar 19 µ l de 10 mM Tris-HCl. Pipetar acima e para baixo várias vezes para resuspended os grânulos e incubar as amostras durante 5 min à RT Se os grânulos eram superaquecimento, incube-los para > 10 min.
  8. Coloque o suporte magnético as amostras e incube-os por 5 min separar os grânulos do sobrenadante. Cuidadosamente remova 15 µ l do sobrenadante contendo as bibliotecas de cDNA purificado, selecionados por tamanho dos tubos e transferi-lo para um tubo 1,5 mL.

9. PCR amplificação e purificação Final do grânulo

  1. Adicionar 5 µ l de primer universal e 5 µ l de uma cartilha de índice exclusivo (consulte tabela de materiais) para cada um purificado biblioteca de cDNA e misture-os bem pipetando. Verifique o mix de mestre do polymerase para cristais e outros precipitados e aquecer a mistura de mestre com a mão até dissolver o precipitado.
    1. Adicione 25 µ l do mix mestre polimerase para a amostra, misturá-los por pipetagem e siga as ciclismo condições abaixo para a amplificação por PCR. Executar a desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s e em seguida, executar uma etapa dupla reação de PCR por denaturating as amostras a 98 ° C por 10 s e recozimento/prorrogação dos produtos do PCR a 65 ° C para 75 s (x 12), seguido por uma extensão final a 65 ° C por 5 min e uma espera indefinida a 4 ° C.
  2. Limpe as bibliotecas final adicionando 45 µ l de ressuspensão grânulos magnéticos diretamente para a reação de PCR, misturá-los por pipetagem e incube-os em RT 5 min. transferência da amostra para um tubo de 1,5 mL e colocá-lo em um suporte magnético. -Incubar durante 5 min, desprezar o sobrenadante e lavá-lo duas vezes com etanol a 80% recentemente preparada por 30 s.
  3. Após a segunda lavagem, totalmente remover o etanol da amostra e secar o sedimento de grânulo por 5 min e Elui-lo em 35 µ l de 0.1 x et. Resuspenda os grânulos pipetando-los e incubar os RT 5 min. lugar da amostra sobre o suporte magnético e depois de 5 min, transferir 30 µ l do sobrenadante para um tubo 1,5 mL. Armazenar as bibliotecas a-80 ° C.
  4. Seleção de qualidade: Diluir 1 µ l da biblioteca final em 9 µ l de água NF e executar a amostra em um instrumento de análise de DNA específico com um chip de alta sensibilidade; a maioria de cDNA deverá estar na faixa de 600-800 bp de comprimento (Figura 2e).
  5. Após a eluição, envie as amostras para sequenciamento em uma plataforma de sequenciamento em paralelo usando 250 leituras de emparelhado-fim de bp, ou 300 leituras de único-extremidade de bp.

10. bio-informática análise de dados de sequenciamento de círculo

Nota: Análise e interpretação de dados brutos da C-seq ensaio requerem um pipeline de bio-informática dedicado. Um esquema do gasoduto que foi usado para nossas análises é retratado na Figura 3. Baixe esse pipeline no https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Primeiro, apare o lê para remover sequências de adaptador e chamadas de base de baixa qualidade com cutadapt18, usando um limite de Pontuação de qualidade de 20.
  2. Em seguida, identificar as repetições codificadas pela molécula de RNA do concatemerized usando um algoritmo apropriado para detectar qualquer repetições com um tamanho mínimo de 30 nucleotídeos e um máximo de 2 incompatibilidades entre repete18. Derivam estas repetições de uma sequência de consenso e acompanhar todas as chamadas base e escores de qualidade de associado em cada posição.
    Nota: Porque a transcrição reversa pode começar em qualquer posição sobre a molécula de RNA circular, o início de uma repetição não necessariamente corresponde a extremidade 5 ' da molécula de RNA fragmentada (doravante referida como o ponto de ligadura). Nesse sentido, a sequência de consenso não irá mapear continuamente contra a transcriptoma correspondente, o que exige a identificação do ponto de ligadura.
  3. Para identificar o ponto de ligadura, mapear um concatemer da sequência de consenso contra a transcriptoma de referência usando o alinhamento de explosão, como ferramenta (BLAT)19.
    1. Concatene duas instâncias da sequência de consenso para garantir que a sequência mapeada contém pelo menos uma ocorrência ininterrupta completa da sequência inicial de RNA fragmento. Em seguida, gire a sequência de consenso para iniciar na posição de ponto previsto da ligadura.
  4. Mapear as sequências de consenso girado contra o genoma usando TopHat20 e usar os alinhamentos para detectar qualquer polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que poderiam ser confundidos com os erros de transcrição.
  5. Chamar os erros de transcrição de sequências de consenso girado mapeada e testar se os erros do candidato passam quatro testes adicionais.
    1. Primeiro, certifique-se que um erro de transcrição não sobreposição com um SNP (um requisito típico é que pelo menos 20 leituras precisam cobrir uma determinada base e não mais do que 5% do lê pode apoiar uma alternativa chamada de base).
    2. Em segundo lugar, verificar que a sequência de consenso é derivada de pelo menos 3 repetições em tandem, cada qual chama o mesmo par de base; e em terceiro lugar, certifique-se que a soma das pontuações qualidade dessa posição deve ser mais de 100.
  6. Para uma quarta e última verificar, rodar a sequência de consenso em todas as combinações possíveis (simulando todas as posições possíveis do ponto de ligadura) e mapear cada versão contra o genoma de referência usando TopHat.
    Nota: Se uma das sequências giradas encontrar uma correspondência perfeita no genoma, o ponto correspondente da ligadura é agora considerado uma correta e a chamada de erro de transcrição deve ser rejeitada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como todas as aproximações de sequenciamento em paralelo, cada experimento C-seq produz um conjunto de dados grande, difícil de manejar. Para usuários de primeira viagem, pode ser difícil lidar com esses conjuntos de dados; assim, é recomendável que todos os usuários entre em contato com um experiente bio-informático antes da experimentação. Em média, a expectativa é que os usuários irão gerar aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por execução na maioria das plataformas de sequencia...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a preparação das bibliotecas C-seq para a detecção de erros de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Este protocolo tem numerosas vantagens sobre os protocolos existentes, bem como técnicas alternativas.

Nos últimos 15 anos, numerosos repórter foram desenvolvidos sistemas que dependem do luciferase7,8 ou Cre-Lox ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta publicação foi viabilizada pelo financiamento do grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 e um jovem investigador do AFAR concedem (para M. Vermulst).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de purificação de RNA RiboPureThermoFisherAM1926Purificação total de RNA
Kit de purificação de mRNA GenelutePurificação de mRNASigma-AldrichMRN70-1KT
Água livre de nucleaseAmbionAM9937Eluição e diluição
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290Fragmentação de RNA
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)New England BiolabsM0204SCircularização de RNA
RibolockThermoFisherEO0381Inibidor de RNase
SuperScript III Transcriptase reversaThermoFisher18080044Transcrição reversa de círculo rolante
10 mM dNTP mixThermoFisher18427013Transcrição reversa de círculo rolante
Hexâmeros aleatórios (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127Transcrição reversa de círculo rolante
NEB Módulo de Síntese de Segunda FitaNew England BiolabsE6111SSíntese de Segunda Fita
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit para IlluminaNew England BiolabsE7370Spreparação da biblioteca de cDNA
NEB Primers de próximo índiceNEBE7335SPrimers
de PCR multiplexOligo Limpo & ConcentradorZymo ResearchD4061Limpeza de amostras de RNA e DNA
DynaMag-2 MagnetThermoFisher12321DPurificação de esferas magnéticas
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Purificação de esferas magnéticas
Eppendorf 5424 MicrocentrífugaFisherScientific05-403-93centrifugação
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Cultura de células
T100 TermocicladorBIO RAD1861096Condições de ciclo de temperatura média a alta
PTC-200 TermocicladorGMI8252-30-0001 Condições de ciclo de baixa temperatura
RNase AwayMolecular Bioproducts700S-11Esterilização
50 mL Tubo de CentrífugaCorning430290Tubo de
Centrífuga de 15 mLCorning430052sem Nuclease
EUA Scientific1615-5500Sistema de
Fita 4200 Livre de NucleaseAgilentG2991AAInstrumento de análise de nucleotídeos para controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples
Fita de tela de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5579Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples
Buffer de amostra de RNA ScreenTape Agilent5067-5577Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples
Escada de RNA ScreenTape Agilent5067-5578Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples
2100 InstrumentoBioanalisador AgilentG2939BAControle de qualidade de DNA de
fita dupla Kit de DNA de alta sensibilidadeAgilent5067-4626 Controle dequalidade para amostras de cDNA de fita dupla
Banho-mariaVWR462-0244Incubação
NanoDrop 2000/2000C EspectrofotômetroThermoFisherND-2000CDeterminação da concentração de RNA
sem Nuclease Tubos Eppendorf

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ensaio de Sequenciamento CircularFidelidade da RNA PolimeraseSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansCirculariza o de Fragmentos de RNAT4 RNA LigaseTranscri o ReversaS ntese da Segunda CadeiaLiga o de AdaptadoresSele o de Tamanho por Esferas Magn ticasAmplifica o por PCRLimpeza da Biblioteca

Artigos relacionados