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Medicine

二维 x 射线血管造影应用硅橡胶注射液检测细血管结构

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/57732
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Seoul National University College of Medicine, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Hanyang University Medical Center, Hanyang University College of Medicine

Summary

本研究提出了一种简单的二维血管造影方法, 使用硅橡胶注射化合物和软组织 x 线系统检查精细的血管结构。

Abstract

血管造影是研究各种研究领域血管结构的重要工具。本研究的目的是介绍一种简单的血管造影方法, 利用硅橡胶注射剂和软组织 x 线系统检查未固定的新鲜组织的精细血管结构。本研究特别关注用于重建手术的皮瓣区。本研究采用血管造影与硅橡胶注射化合物在各种实验条件下使用 sprague-dawley 大鼠。首先, 将 mL 化合物与稀释剂混合15毫升。然后, 制备 1.5 ml 的固化剂, 并在大鼠颈总动脉中插管24g 导管。然后将三通塞子连接到导管上, 与制备的固化剂混合后, 立即注入不透明剂, 不发生溢出。最后, 当试剂凝固时, 将采集标本, 并使用软组织 x 射线系统获得血管造影图像。该方法表明, 高质量的血管造影显示精细的血管结构可以很容易和简单地获得在很短的时间内。

Introduction

检查血管结构, 如动脉和静脉是一个重要的领域感兴趣, 特别是在重建手术。在这一领域, 皮瓣手术被广泛进行。因此, 血管造影成像被积极地用于研究新鲜组织的皮瓣区域、血管巨细胞和血管供应1。具体而言, 一直在努力观察精细血管, 包括细血管, 如穿孔器 (从深层血管到达皮肤的血管中出现的血管) 和窒息血管 (连接邻近血管瘤体之间的血管)2.这两种血管在穿孔瓣重建领域具有重要意义, 是3、4 研究的主要重点。

血管造影中使用了各种材料。首先是印度墨水, 它有助于观察血管的严重解剖。然而, 它是辐射的, 所以无法获得血管造影图像。更常用的不透明材料是氧化铅和钡。然而, 毒性是氧化铅的一个关键缺陷, 由于其粉末状, 与水混合时使用起来并不方便。钡无毒;然而, 这并不是很可行, 因为应该在稀释后使用。这两种不透明材料都不能交叉毛细血管;因此, 如果必须分析整个血管结构, 则有必要将其分别注射到动脉和静脉 5.此外, 这两种材料在解剖过程中会导致染料泄漏, 因此应与明胶结合。含氟明胶和钡明胶混合物至少需要一天时间才能凝固1,6,7。

计算机断层扫描 (ct) 血管造影是另一种广泛使用的方法, 可帮助查看三维 (3d) 结构8。然而, 静脉不能有效地可视化5。在这种方式, 明确可视化的精细血管, 如窒息脉是困难的, 除非使用特定的设备。对更昂贵的设备的需求可能是一个缺点, 因此 ct 血管造影不能在所有实验室中使用。相比之下, 软组织 x 线系统相对便宜, 操作更容易。该系统是观察软组织的最佳选择, 可以提供比简单的 x 射线系统更高质量的软组织图像。虽然软组织 x 射线系统本身不能显示三维图像, 它可以帮助可视化精细的血管结构比 ct 血管造影更清楚。因此, 我们在许多实验中使用了软组织 x 射线系统, 特别是在各种皮瓣模型和基本解剖2,9。

最后, 使用硅橡胶注射复合血管造影具有诸多优点。由于各种颜色代理是准备的, 它可以注入和显示可区分的颜色, 如印度油墨。因此, 同时研究总解剖和血管造影是可能的。它既可以通过毛细血管, 也可以让静脉可视化, 使精细血管结构的检查成为可能。与明胶混合物不同, 硅橡胶注射复合物在短时间内凝固, 约 15分钟, 无需任何额外的程序。图 1中的原理图图像总结了整个过程。

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Protocol

所有程序, 包括动物科目, 都已得到首尔国立大学医院动物护理和使用机构委员会 (iacuc 10-0184 号) 的批准。该方案对皮瓣血管的研究进行了优化。这个例子是基于我们以前的报告中的四域皮瓣模型。

1. 建立翻盖条件

注: 重要的是要产生血管变化的大鼠皮瓣模型4至5天之前可见估计6,7。

  1. 使用7周大的雄性 sprague-dawley 大鼠, 体重200-250 克。
  2. 用异氟醚对大鼠进行诱导和2-2.5% 的诱导和2-2.5% 的维护。进行脚趾捏戒断反射测试, 以确认麻醉的深度是足够的。 注射美洛昔康 5 mgskg 皮下减压。
  3. 用动物剪发器和脱毛霜 (硫代乙酸, 80%) 来沙头。准备一个无菌手术场与10% 的 povidone-iodine 和无菌悬垂, 以保持无菌条件, 在整个过程中。在眼睛上涂上兽医软膏, 以防止干燥。保持所有仪器的无菌状态。
  4. 建立合适的皮瓣条件。
    1. 标记从下腹部到背部的环状皮瓣设计, 尺寸为 4 x 12 厘米, 位于灵皮过程和阴茎之间的皮瓣中心 (图 1)。
    2. 用手术刀片做标记的切口。
    3. 用剪刀解剖皮瓣, 包括皮肤和扁桃体。
    4. 在下腹部解剖血管蒂 [双侧深环状胫骨 (dci) 血管和双侧浅上腹部 (sie) 血管], 并使用手术百叶窗和显微手术器械暴露血管蒂。
    5. 根据所需的条件维护或结扎血管。
    6. 使用手术刀片或剪刀沿背侧中线分割皮瓣。
    7. 将皮瓣放置在原来的位置, 用皮肤订书机固定。
    8. 在手术伤口上涂抹外用软膏 3天, 并通过每天口服一次, 为期3天的口服美洛昔康提供术后镇痛。
    9. 确认大鼠恢复足够的意识, 以保持胸骨的清醒。把老鼠放回笼子里, 把它搬到住宅区。给每只老鼠涂一个伊丽莎白时代的项圈。

2. 仪器的准备

  1. 准备一个24g 导管和一个三通旋塞。
  2. 准备蚊虫钳、小剪刀、手术刀和手术刀片。
  3. 制备血管造影剂 (硅橡胶注射剂)。
    1. 将着色剂化合物与无菌标本收集杯中的稀释剂混合。确保在一只大鼠 (sprague-dawley 大鼠, 200-250 g) 中的色剂化合物和 mL 稀释剂的15毫升, 按重量计算的数量相等。
    2. 注射前立即加入每5% 重量或混合物溶液体积的固化剂: 在一只大鼠 (sprague-dawley 大鼠, 200-250 克) 中添加 1.5 ml 的固化剂。

3. 大鼠动脉准备

  1. 使用异氟烷麻醉大鼠 (诱导 3-5%, 维护 2-2.5%)。进行脚趾捏戒断反射测试, 以确认麻醉的深度是足够的。
  2. 用动物剪发器和脱毛霜 (硫代乙酸, 80%) 来拉脖子。
  3. 暴露颈总动脉10。
    1. 在肩周骨之间做一个2厘米的中线切口。
    2. 使用蚊虫钳和钝剪刀更深入地解剖, 直到唾液腺复合体暴露。
    3. 收回唾液腺, 并直接纵向解剖全血肌。
    4. 解剖周围的颈总动脉。
  4. 用黑色丝钩住颈总动脉的头和尾侧, 并将其贴上。
    1. 在近端缝合线上打领带, 保持牵引力, 以保持动脉的肿胀。
    2. 在尾侧准备一个丝质缝合线, 以固定24g 导管。

4. 插管

  1. 用24g 导管封堵准备好的颈动脉。
  2. 拧紧在尾端的预先制作的领带, 并注意不要在注射过程中取出导管。
  3. 准备固化剂 (步骤 1.3.2)。
  4. 将三通旋塞牢固地连接到插入的导管。
    1. 使用空注射器添加负压, 确认将血液回流导管。

5. 注塑

  1. 注入硅橡胶注射化合物, 直到眼睛和脚的颜色发生变化。
    注: 随着注入液的进展, 颜色变化应出现 (每只大鼠的注射量约为25-30 毫升)。
  2. 锁定三通旋塞, 并等待, 直到代理凝固。
    1. 请注意不要用药剂污染, 尤其是在从三通塞子上取出注射器时。使用保护屏障, 如纱布或乙烯基, 将注入空间与周围环境分开。
      注意: 任何污染都很难分析血管造影图像, 因为该化合物是无线电不透明的。
    2. 确认心跳和呼吸停止。停止麻醉。
    3. 以剩余的剂作为参考 (大约需要 15分钟) 观察硬度。

6. 样品的采集

  1. 使用手术刀片在皮瓣外1厘米处进行切口, 以防止皮瓣内的任何血管结构受损。
  2. 从步骤 1.4 (在圆环平面下) 沿先前解剖的平面解剖, 并使用剪刀收获包括皮瓣和血管蒂在内的组织 (血管结构包括在皮瓣中)。
  3. 使用5-0 丝缝线将皮瓣的蒂蒂结扎, 并将皮瓣与身体分离。注意不要破坏血管结构。

7. 捕获血管图像

  1. 展开标本, 确保它不折叠, 并轻轻地把它放在手术悬垂使用钳子。
  2. 拍一张影像。
    1. 将躺在薄膜盒上的样品转移到样品加载空间。
    2. 将软组织 x 光系统设置为 60 kvp、5 ma 和5秒的曝光。
  3. 使用自动开发机器在暗室中开发薄膜。
  4. 以尽可能高的分辨率扫描影片。

8. 分析图像6、7、11

  1. 根据流动和直径的连续性来区分动脉和静脉。
    1. 从椎弓根动脉的流入开始, 集中在正在检查的目标血管上。
    2. 通过先打开图像, 用软件测量直径。
      1. 单击 "直线"按钮, 并在刻度栏上绘制一条长度相同的线。
      2. 打开分析设置比例菜单, 并将比例栏的值输入到"已知距离".
      3. 单击 "直线"按钮, 并在需要测量其直径的容器上绘制一条线。
      4. 打开分析测量菜单并确认长度。
  2. 分析考虑皮瓣存活面积的血管形态。

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Representative Results

通过遵循该方案, 对 sprague-dawley 大鼠的皮瓣血管进行了检查。根据我们之前的报告, 标记了从下腹部到背部的一个测量 4 x 12 厘米的环状皮瓣。每个标本都处于不同的血管状况。

所有的皮瓣都是根据深环状腹腔动脉 (dcia) 和静脉升高, 然后与来自不同位置的动脉增压。以1组为对照组, 第2组为同侧浅上腹部动脉 (siea) 增压, 第3组为对侧 siea 增压, 第4组为对侧 dcia 增压。因此, 每个皮瓣的血管造影显示不同的模式。如果将整个皮瓣分为四个区域作为标准, 主血管向皮瓣区域充电, 则血管造影剂已到达向增压动脉以外的下一个远端区域充电的主血管。扩张的窒息静脉也被观察到, 但在正常皮肤血管造影中没有发现 (图 2)。

在其他情况下, 硅橡胶注射血管造影清楚地显示出良好的血管结构。在这里, 该方法是有利的, 因为大鼠静脉是如此薄, 不容易可视化与血管造影。高质量的血管造影图像显示扩张的窒息静脉, 即使在特定条件下, 看动脉供应和静脉引流从不同的来源 (例如, 动脉, 如同侧 dcia 或静脉, 如对侧浅表上腹部静脉) (图 3)。

Figure 1
图 1: 整个过程的架构.该面板显示了所需皮瓣条件的事先准备和心动过四-5天后的血管造影表现, 使用以下过程: 血管造影剂制备, 注射, 标本采集, 和图像捕捉。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 大鼠皮瓣术后第4天皮瓣的典型血管造影.正常的皮肤代表了右下主干区原来的四个血管区域皮瓣。皮瓣包括四个血管区, 包括双侧深环状髋关节 (dci) 和浅下腹部 (sie) 血管区 (黄色正方形)。所有组都有一个共同的血管蒂, 深环状胫骨动脉和静脉 (dcia & v)。此外, 每个皮瓣有不同的增压动脉。第2组为同侧浅上腹部动脉 (siea) 增压, 第3组与对侧 siea 叠加, 第4组与对侧 dcia 叠加。第4组表现出不同的存活皮瓣区域和血管造影模式。由于增压动脉与原血管蒂 (diea & v) 的距离, 更远的主要血管被剂 (黄色箭头) 对比。最后, 连接血管领地的扩张的窒息脉是可见的 (白色箭头)。i = 同侧;c = 对侧。刻度栏 = 1 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 其他具有代表性的结果.所显示的皮瓣由同侧深环状腹腔动脉 (dcia) 提供, 并由对侧浅上腹部下静脉 (siev) 排出。(左上角)这个面板显示了收获皮瓣的总摄影。同侧表现为充血性改变, 但皮瓣坏死不发生。皮瓣的中间部分和远端三分之二显示出完全的生存。(左下角)血管造影显示详细的精细血管结构, 包括扩张的窒息脉, 连接相邻的血管区域。(右图)放大血管造影将动脉 (红色箭头) 和静脉 (蓝色箭头) 区分为血管的连续性和直径。一般来说, 静脉比动脉显示更大的直径。dcia = 深环状胫骨动脉;siev = 浅表上腹部下静脉;白色箭头 = 扩张的窒息静脉。刻度栏 = 1 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

硅橡胶注射复合血管造影可以很容易地进行, 不需要昂贵的设备, 并提供了许多优点。与患者的术前和术中评估不同, 使用动物和尸体进行的实验可以提供有关具体条件的详细信息, 从而能够进行更加多样化和深入的研究。使用大鼠的皮瓣模型对临床医生特别有价值,因为在临床应用 6、7、11之前可以观察到各种情况下的变化。例如, 当增压或超导应用于一个长皮瓣, 这可以解决远端缺血性坏死, 预测在皮瓣区域的结果是可能的;因此, 将这些技术应用于临床实践是可能提高皮瓣的生存率的 (图 2)。在尸体解剖的情况下, 可以同时进行解剖和血管造影评估, 最大限度地提高尸体的使用12。

硅橡胶注射剂比其他不透明材料更容易处理。将硅橡胶注射剂和稀释剂事先混合并在注射前直接添加固化剂是主要的工艺。与其他成像方法一样, 应注意避免注射过程中的溢出。为了避免溢出, 我们建议在插管后使用安全领带和带导管的三通。如果有溢漏, 试样可能会被不透明的辐射剂污染, 从而降低其作为血管造影图像的质量。正如所讨论的, 硅橡胶注射剂的优点是它在混合后快速凝固, 大约15分钟后。但是, 实验通常在这段时间内完成。因此, 我们建议一次只混合一只老鼠所需的量, 即使在进行多个实验时也是如此。复合凝固后的 x 线成像性能应在新鲜组织变性之前进行。

硅橡胶注射化合物的分子量小到足以通过毛细血管;因此, 没有必要将该制剂分别注射到静脉中, 这是另一个优势。相反, 铅氧化物明胶混合物或钡明胶混合物必须分别注射到静脉中, 以便进行静脉可视化。然而, 它们不能通过静脉中的阀门, 因此有必要进行连续插管和注射。使用硅橡胶注射剂时可以观察到从动脉到静脉的生理前流动, 但在使用其他造影剂时, 这种特性没有被观察到。

动脉和静脉都可以与硅橡胶注射化合物进行对比, 并可根据流量和直径的连续性进行区分 (图 3)。一般来说, 静脉的直径相对较大。

使用软组织 x 射线系统进行三维分析的缺点之一是, 它比使用 ct 血管造影要困难得多。虽然立体 x 线摄影可以通过软组织 x 射线系统实现, 但它不会产生 ct 血管造影13中看到的高质量的3d 图像。然而, 它仍然是优越的可视化精细的血管结构。这在使用软组织 x 射线系统而不是普通 x 射线系统时尤为明显 (图 3)。目前, 实时 ct 血管造影是用来观察三维随时间流14,15的变化。3d 实时图像不能仅使用软组织 x 射线系统来实现, 但在注射过程中, 通过使用移动 c 臂系统进行串行成像可以实现实时血管造影。虽然它的图像质量弱于软组织 x 射线系统的可视化精细的血管结构, 它可以使实时评估动态变化。我们积极向那些不能利用微 ct 或希望对微 ct 无法有效显示的细脉等细血管结构进行基础研究的研究人员推荐这种方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作 (2017r1a2b1006403) 得到了中级研究方案的支持, 由韩国政府 (科学和信息和通信技术部) 资助的国家研究基金会赠款。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-112 White color agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-117 Orange color agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-120 Blue color agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-122 Yellow color agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-130 Red color agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-132 Clear agent
MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds Flow Tech Inc. MV-Diluent Diluent
MICROFIL CP-101 For Cast Corrosion Preparations Flow Tech Inc. CP-101 Curing agent
SOFTEX X-ray film photographing inspection equipment SOFTEX CMB-2 Soft tissue x-ray system
Film  Fujifilm Industrial X-ray Film (FR 12x16.5cm)
Automatic Development Machine Fujifilm FPM 2800
Rat  Sprague-Dawley rat weighing 200-250 g
Three-way stopcock
24-guage catheter
Image J National Institutes of Health  https://imagej.nih.gov/ij/

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References

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医学 第143期 血管造影 硅橡胶注射化合物 氧化铅 钡 皮瓣区 血管造影 放射性不透明材料 血管造影剂
二维 x 射线血管造影应用硅橡胶注射液检测细血管结构
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Chang, H., Ha, J. H., Park, S. O.… More

Chang, H., Ha, J. H., Park, S. O. Two-Dimensional X-Ray Angiography to Examine Fine Vascular Structure Using a Silicone Rubber Injection Compound. J. Vis. Exp. (143), e57732, doi:10.3791/57732 (2019).

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