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Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

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DOI:

10.3791/57733

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7 de outubro de 2018

 ,  , 
1Department of Clinical Experimental Research, Glostrup Research Institute, 2Department of Clinical Sciences, Division of Experimental Vascular Research, Lund University

Neste artigo

Resumo

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Resumo

Perícitos da retina desempenham um papel importante em muitas doenças do olho. Imuno-histoquímica coloração técnicas dos vasos da retina e microvasculares pericitos são centrais para pesquisas oftalmológicas. É fundamental escolher um método apropriado de visualizar os pericitos microvasculares. Descrevemos a imuno-histoquímica da retina Pericito microvascular coloração em crio-seções, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada usando anticorpos para fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor β (PDGFRβ) e nervo/gliais antígeno 2 (NG2). Isso nos permite destacar as vantagens e limitações de cada um dos preparativos para a visualização das retina pericitos microvasculares três tecido. Cryo-seções fornecem transsectional visualização de todas as camadas da retina, mas contêm apenas alguns cortes transversais ocasionais da microvasculatura. Toda a montagem fornece uma visão geral da vasculatura da retina inteira, mas visualização da microvasculatura pode ser problemática. Hipotônica isolamento fornece um método para visualizar a vasculatura da retina inteira pela remoção de células neuronais, mas isso faz com que o tecido muito frágil.

Introdução

Perícitos da retina são o foco de muitos laboratórios de pesquisa como estas células desempenham um papel importante na integridade da vasculatura. Condições patológicas como retinopatia diabética1, isquemia2e glaucoma3 têm características vasculares que envolvem a função de pericitos. Pericitos são encontrados nos interiores plexos capilares da retina. Artéria central da retina que abastece os ramos de retina interna em duas camadas de plexos capilares. A cama vascular interna situa-se entre as células ganglionares e camadas nucleares internas. A camada mais profunda é mais denso e complexo e está localizada entre o interior e exterior camadas nucleares4,5. Além disso, algumas partes da retina também contêm uma terceira rede denominada os capilares parapapillary radial. Estas são longas, retos capilares que se encontram entre as fibras nervosas e raramente se anastomosam com um outro ou os outros dois plexos6. Dentro da parede capilar, pericitos são incorporados na membrana do porão e linha do lado de abluminal das células endoteliais vasculares.

Até esta data, não há nenhum marcador biológico exclusivo destas pericitos que pode diferenciá-las das outras células vasculares. Fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor β (PDGFRβ) e nervo/gliais antígeno 2 (NG2) são comumente utilizados marcadores que ambos apresentam em pericitos mas também outras células vasculares. Identificação de pericitos é ainda mais complicada pela existência de subconjuntos Pericito que variam em morfologia e proteínas de expressão7. Atualmente, a melhor identificação depende de uma combinação de marcadores de proteína e o posicionamento característico do Pericito na parede vascular. Demonstramos aqui três técnicas de preparação de tecidos diferentes para coloração imuno-histoquímica PDGFRβ/NG2 de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Com cryo-seções, a retina e a esclera são cortados através do nervo óptico. Isto permite a visualização de todas as estruturas em camadas de neurônios. As distintas dez camadas da retina são aparentes como intercâmbio nucleares e axonal/dendríticas estruturas que podem ser visualizadas com manchas como hematoxilina/eosina ou nuclear fluorescente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. As exigências metabólicas diferem entre as camadas de9 e fornece um método para determinar a espessura ou a total ausência de uma camada específica (por exemplo, a perda de células ganglionares da retina é uma das marcas registradas de isquemia da retina10, 11). O sistema vascular é evidente como transversal corta através da retina, tornando possível estudar separadamente os plexos capilares dentro as respectivas camadas da retina12,13.

Mais tradicionalmente, as investigações da rede vasculatura da retina são realizadas em retinais todo-montagens. Com esta preparação do tecido, a retina é cortada e achatada como uma estrutura em forma de flor. O método é uma técnica de preparação do tecido relativamente rápida que pode realçar a vasculatura da retina de arquitetura global e, portanto, é muitas vezes aplicado na investigação da neovascularização na retina murino. Visualização bem sucedida da microvasculatura em retinas todo montado também é relatada no desenvolvimento neonatal rato e rato retina14,15,16,17,18, 19. estes estudos revelam uma atividade pericytic mais definida com áreas maiores capilar-livre no adulto em comparação com a retina neonatal14.

Outra maneira de Visualizar é a microvasculatura retiniana após isolamento hipotônica. Esta técnica de preparação do tecido resulta em embarcações de sangue retinais e capilares sendo liberados das células neuronais. Este tipo de imagem bidimensional da rede vascular retiniana isolada é geralmente realizado após a digestão de tripsina da retina20 e usado para avaliar as anormalidades vasculares da retinopatia diabética, incluindo capilar e perda de Pericito degeneração de21,20,22. O método de isolamento hipotônica oferece as investigações do gene vascular da retina e respostas regulatórias de proteína, como tem sido feito com RT-PCR e ocidental mancha23,24,25. Nós fornecemos aqui um protocolo para a coloração imuno-histoquímica livre flutuante da vasculatura da retina hipotônica isolada, como uma alternativa para a digestão do trypsin para examinar os pericitos microvasculares.

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Protocolo

O protocolo foi otimizado e demonstrado em ratos adultos machos albino. Em todos os procedimentos experimentais, os animais foram tratados de acordo com os regulamentos na instrução ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research. Os animais foram sacrificados por dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.

1. preparações de tecido Retinal do rato

  1. Cryo-seção
    1. Fazer fendas cm de ~0.5 anterior e posterior na pálpebra rato com um bisturi.
      1. Opcional: Usar um queimador de diatermia, marca o olho no ângulo interno para orientar o olho de forma uniforme durante a incorporação e permitir criostato vertical de corte através do nervo óptico.
    2. Pegue o olho com fórceps e incline cuidadosamente para o lado para expor o tecido circundante. Enucleate do olho, fazendo cortes com uma tesoura de dissecação no tecido conjuntivo e muscular.
      Atenção: Não puxe o olho muito difícil pois uma pressão excessiva sobre o nervo óptico pode causar descolamento de retina.
    3. Coloque o olho brevemente em formol 4% em tampão fosfato salino (PBS) para estabilizar antes de fazer um furo inicial no limbo da córnea aplicando uma ligeira pressão com a ponta de um bisturi.
    4. Sob um microscópio, corte com tesoura de dissecação para remover a córnea e remover a lente com pinça antes de submergir em formol 4% em PBS para 2 – 4 h ao limbo da córnea.
    5. Enxágue sequencialmente em tampão de fosfato do Sörensen com 10% de sacarose e 25% de sacarose.
    6. Incorpore no médio Yazulla, preparado com gelatina de 3% de suínos pele e 30% albumina de ovo de galinha.
      Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui com armazenamento de tecido a-20 ° C.
  2. Toda a montagem
    1. Fazer ~0.5 anterior e posterior cm fendas na pálpebra rato com um bisturi.
    2. Pegue o olho com fórceps e incline cuidadosamente para o lado para expor o tecido circundante. Enucleate do olho, fazendo cortes com uma tesoura de dissecação no tecido conjuntivo e muscular.
      Atenção: Não puxe o olho muito difícil pois uma pressão excessiva sobre o nervo óptico pode causar descolamento de retina.
    3. Coloque o olho brevemente em formol 4% em PBS para estabilizar antes de fazer um furo inicial no limbo da córnea aplicando uma ligeira pressão com a ponta de um bisturi.
    4. Sob um microscópio, corte ao limbo da córnea com tesoura de dissecação para remover a córnea e remover a lente com fórceps.
    5. Separe a retina o epithelium retinal do pigment para o nervo óptico com fórceps, usando movimentos de pequena abertura para evitar grandes rasgando.
    6. Livre da retina ao nervo óptico com tesoura de dissecação e fazer quatro fendas de alguns milímetros de comprimento da periferia da retina, cabeça do nervo óptico.
    7. Espalhe a retina numa lâmina de vidro e permitem a secagem de 5 – 10 min.
    8. Corrigi em formol 4% por 20 a 30 min pingando formol na retina.
      Atenção: Não aplique diretamente na retina como ele pode separar do vidro.
    9. Enxaguar com PBS. Para obter melhores resultados, imuno-mancha diretamente após o enxágue.
  3. Isolamento hipotônica
    1. Fazer ~0.5 anterior e posterior cm fendas na pálpebra rato com um bisturi.
    2. Pegue o olho com fórceps e incline cuidadosamente para o lado para expor o tecido circundante. Enucleate do olho, fazendo cortes com uma tesoura de dissecação no tecido conjuntivo e muscular.
      Atenção: Não puxe o olho muito difícil pois uma pressão excessiva sobre o nervo óptico pode causar descolamento de retina.
    3. Faça um furo inicial no limbo da córnea aplicando uma ligeira pressão com a ponta de um bisturi.
    4. Sob um microscópio, corte ao limbo da córnea com tesoura de dissecação para remover a córnea e remover a lente com fórceps.
    5. Separe a retina o epithelium retinal do pigment na direcção da cabeça do nervo óptico com fórceps, usando movimentos de pequena abertura para evitar grandes rasgando.
    6. Livre da retina ao nervo óptico com tesoura de dissecação, coloque a retina em 1 mL de água deionizada em uma placa de 24 e agitar a 200 rpm com uma órbita de vibração de 1,5 mm por 1h à temperatura ambiente.
      Nota: Daqui em diante, a retina vai aparecer que menos definidos nas bordas.
    7. Adicione 200 U DNAse 1 para dissociar os destroços lisados celulares da vasculatura da retina e agitar durante mais 30 min à temperatura ambiente.
      Nota: Os restos podem começam a se formar em poços.
    8. Lave o mínimo 3 vezes em água desionizada por 5 min com agitação a 150-300 rpm para remover os restos da célula neuronal. A retina deve tornar-se mais transparente com cada lavagem indicativa da remoção de restos celulares neuronais.
      1. Use um fundo escuro, a olhar para a placa de 24 para ver claramente a vasculatura da retina isolada diáfana.
      2. (Opcional): se a vasculatura não aparecer livre de camadas neuronais (semi-transparente) neste ponto também adicionar mais etapas de lavagem, aumentar a velocidade de agitação ou usar uma pipeta para aspirar o líquido sobre o sistema vascular.
        Cuidado: Uma das etapas opcionais podem danificar o sistema vascular.
    9. Corrigi a 10 min em 1 mL de paraformaldeído 4% em PBS em temperatura ambiente e lave 3 vezes em PBS.
      Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui com armazenamento de tecido a 4 ° C.

2. imuno-histoquímica

  1. Coloração de cryo-seções
    1. 10 µm cryo-seções da retina gelatina-incorporado como corte vertical através do nervo óptico de corte e coloque as cryo-seções sobre uma lâmina de vidro e deixar secar (mínimo 1 h).
    2. Mergulhe a lâmina de vidro em PBS com 0,25% Triton X-100 (PBS-T) por 15 min.
    3. 1: 100, PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpos primários diluídos em PBS-T + 1% de BSA para o cryo-seção de gotejamento e incubar em câmaras de incubação de 4 ° C durante a noite.
    4. Mergulhe a lâmina de vidro 2 vezes em PBS-T por 15 min e 1: 100 anti-rato Alexa Fluor 594-ligados e 1: 100 anti-coelho FITC-lig anticorpos secundários diluídos em PBS-T com 3% de BSA para as cryo-seções de gotejamento.
    5. Incube a lâmina de vidro de 1 h à temperatura ambiente no escuro.
    6. Enxague a lâmina de vidro em PBS-T 2 x 15 min.
      Nota: Opcional: para coloração imunofluorescente duplos e triplos, coloração sequencial pode ser realizada, repetindo o procedimento de 2.1.3 2.1.6 duas e três vezes, respectivamente.
    7. Monte as cryo-seções manchadas com antidesbotamento montagem DAPI contendo médio e uma lamela.
  2. A coloração de toda a montagem
    1. Gotejamento PBS-T para a conjunto de montagem e incubar a temperatura ambiente por 15 min.
    2. Decantar e gotejamento 1: 100, PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpos primários diluídos em PBS-T + 1% de BSA e incubar em câmaras úmidas a 4 ° C durante a noite.
    3. Decantar e gotejamento em PBS-T para enxaguar a lâmina de vidro de 2 x 15 min.
    4. Decantar e gotejamento no 1: 100 anti-coelho Cy2 - e 1: 100 anti-rato Cy3-lig secundário anticorpo diluído em PBS-T com 3% de BSA para incubar 1 h em uma câmara úmida à temperatura ambiente no escuro.
    5. Decantar e gotejamento em PBS-T para lavar em 2 x 15 min no escuro.
      Nota: Opcional: para coloração imunofluorescente duplos e triplos, coloração sequencial pode ser realizada, repetindo o procedimento de 2.2.2 2.2.5 duas e três vezes, respectivamente.
    6. Montagem a montagem toda manchada com antidesbotamento montagem DAPI contendo médio e uma lamela.
  3. Coloração da vasculatura isolada hipotônica
    1. Bloco da vasculatura isolada hipotônica 1 h com agitação a 100 rpm e temperatura com 500 µ l/poço de 10% de soro de burro diluído em PBS.
    2. Incubar durante uma noite em temperatura ambiente e agite a 100 rpm com 600 µ l/poço de 1: 100, PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpos primários diluídos em soro de burro de 10% em PBS.
    3. Enxágue o retinal rede 3 x em PBS por 5 min e incubar em 1: 100 anti-rato Alexa Fluor 594-ligados e 1: 100 anti-coelho FITC-lig anticorpos secundários diluídos em 10% de soro de burro em PBS sacudir a 100 rpm e temperatura ambiente durante 1 h no escuro.
    4. Enxaguar em PBS-T por 5 min e incubar em 0,2 ng/mL DAPI em PBS-T por 15 min, seguido de lavagens de 3 x 5 min em PBS-T no escuro.
    5. Corte a ponta de uma pipeta Pasteur plástica, umedecê-la com PBS-T e usá-lo para transferir a rede da retina para uma lâmina de vidro de 4-poço de câmara.
      Nota: A etapa de umedecimento é importante evitar a vasculatura da retina degola para dentro da pipeta de Pasteur.
    6. Desdobre a vasculatura da retina. Evite tocar a vasculatura da retina com fórceps, pois isso pode causar a vasculatura tangle.
      Nota: Desdobramento pode ser feito pela inclinação do slide de câmara e para trás ou aspiração gotas de líquido sobre a vasculatura da retina.
    7. Remova o meio dos poços. A tensão de superfície do líquido vai achatar a vasculatura na parte inferior do slide.
    8. Certifique-se de desdobramento correto sob um microscópio, antes de remover o plástico poços no slide de câmara de.
    9. Monte da vasculatura manchada com meio de montagem antidesbotamento e uma lamela.

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Resultados

Os bem sucedidos protocolos fornecem três diferentes preparações da retina para a visualização de pericitos microvasculares. Cada um desses métodos usa PDGFRβ e NG2 imunorreatividade co localização e posição única de pericitos que envolvem a identificação do endotélio capilar.

Com cryo-seções, as camadas neuronais podem ser identificadas pela densidade fluorescente dos núcleos DAPI-rotulados e o interior e profunda capilares ple...

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Discussão

Apresentamos três técnicas de preparação da retina que podem ser aplicadas no estudo de pericitos da retina microvasculares. Abaixo, fornecemos uma comparação entre cada um dos métodos e destacar os passos críticos nos protocolos.

Com cryo-seccionamento, a retina é cortada em secções sagitais e, portanto, é possível obter inúmeros espécimes da retina mesma. As numerais seções resultantes deste método é fazem uma escolha ideal para a especificidade do anticorpo e testes de titulação como evita ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

A pesquisa foi financiada pela Fundação Lundbeck, Dinamarca.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Geletina de pele suínaSigma-AldrichG2625-500G
Albumina de clara de ovo de galinhaSigma-AldrichA5253-500G
Desoxirribonuclease (DNAse) I de pâncreas bovinoSigma-AldrichD5025-15KUDissolvido em 0,15 M NaCl
Albumina de soro bovino (BSA)VWR0332-100G
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-121, lote 129348
Coelho anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluoresceína (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDissolvido em
meio de montagem anti-desvanecimentoVector LaboratoriesH-1000
Meio de montagem anti-desvanecimento com vetor DAPI LaboratóriosH-1200
Nunc Lab-Tek II Corrediça de câmara de 4 poçosThermo Fisher Scientific154526
DMSO

Referências

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