Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.
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Artigo de método
Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Perícitos da retina desempenham um papel importante em muitas doenças do olho. Imuno-histoquímica coloração técnicas dos vasos da retina e microvasculares pericitos são centrais para pesquisas oftalmológicas. É fundamental escolher um método apropriado de visualizar os pericitos microvasculares. Descrevemos a imuno-histoquímica da retina Pericito microvascular coloração em crio-seções, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada usando anticorpos para fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor β (PDGFRβ) e nervo/gliais antígeno 2 (NG2). Isso nos permite destacar as vantagens e limitações de cada um dos preparativos para a visualização das retina pericitos microvasculares três tecido. Cryo-seções fornecem transsectional visualização de todas as camadas da retina, mas contêm apenas alguns cortes transversais ocasionais da microvasculatura. Toda a montagem fornece uma visão geral da vasculatura da retina inteira, mas visualização da microvasculatura pode ser problemática. Hipotônica isolamento fornece um método para visualizar a vasculatura da retina inteira pela remoção de células neuronais, mas isso faz com que o tecido muito frágil.
Introdução
Perícitos da retina são o foco de muitos laboratórios de pesquisa como estas células desempenham um papel importante na integridade da vasculatura. Condições patológicas como retinopatia diabética1, isquemia2e glaucoma3 têm características vasculares que envolvem a função de pericitos. Pericitos são encontrados nos interiores plexos capilares da retina. Artéria central da retina que abastece os ramos de retina interna em duas camadas de plexos capilares. A cama vascular interna situa-se entre as células ganglionares e camadas nucleares internas. A camada mais profunda é mais denso e complexo e est....
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Protocolo
O protocolo foi otimizado e demonstrado em ratos adultos machos albino. Em todos os procedimentos experimentais, os animais foram tratados de acordo com os regulamentos na instrução ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research. Os animais foram sacrificados por dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
1. preparações de tecido Retinal do rato
-
Cryo-seção
- Fazer fendas cm de ~0.5 anterior e posterior na pálpebra rato com um bisturi.
- Opcional: Usar um queimador de diatermia, marca o olho no ângulo interno para orientar o olho de forma uniforme durante a incorporação e p....
- Fazer fendas cm de ~0.5 anterior e posterior na pálpebra rato com um bisturi.
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Resultados
Os bem sucedidos protocolos fornecem três diferentes preparações da retina para a visualização de pericitos microvasculares. Cada um desses métodos usa PDGFRβ e NG2 imunorreatividade co localização e posição única de pericitos que envolvem a identificação do endotélio capilar.
Com cryo-seções, as camadas neuronais podem ser identificadas pela densidade fluorescente dos núcleos DAPI-rotulados e o interior e profunda capilares ple.......
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Discussão
Apresentamos três técnicas de preparação da retina que podem ser aplicadas no estudo de pericitos da retina microvasculares. Abaixo, fornecemos uma comparação entre cada um dos métodos e destacar os passos críticos nos protocolos.
Com cryo-seccionamento, a retina é cortada em secções sagitais e, portanto, é possível obter inúmeros espécimes da retina mesma. As numerais seções resultantes deste método é fazem uma escolha ideal para a especificidade do anticorpo e testes de titulação como evita .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa foi financiada pela Fundação Lundbeck, Dinamarca.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Geletina de pele suína | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumina de clara de ovo de galinha | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Desoxirribonuclease (DNAse) I de pâncreas bovino | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolvido em 0,15 M NaCl |
| Albumina de soro bovino (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Soro de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lote 129348 | |
| Coelho anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluoresceína (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolvido em |
| meio de montagem anti-desvanecimento | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Meio de montagem anti-desvanecimento com vetor DAPI | Laboratórios | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II Corrediça de câmara de 4 poços | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referências
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. ....
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Reimpressões e permissões
