Artigo de método

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

DOI:

10.3791/57736

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17 de maio de 2018

 ,  ,  , 
1National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

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Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Resumo

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A fadiga é um comum e debilitante condição que afeta a maioria dos pacientes com câncer. Até à data, restos de fadiga mal caracterizados com nenhum diagnóstico teste para medir objetivamente a gravidade dessa condição. Aqui nós descrevemos um método otimizado para avaliar a função mitocondrial de PBMC coletadas de pacientes com câncer fatigados. Usando um sistema compacto fluxo extracelular e injeção sequencial de inibidores respiratórias, examinamos estado funcional mitocondrial de PBMC medindo basal respiração mitocondrial, capacidade respiratória e fenótipo de energia, que descreve a via preferencial de energia para responder ao estresse. PBMCs frescos estão prontamente disponíveis na prática clínica usando padrão flebotomia. O ensaio todo descrito neste protocolo pode ser concluído em menos de 4 horas sem o envolvimento de técnicas bioquímicas complexas. Além disso, descrevemos um método de normalização que é necessário para a obtenção de dados podem ser reproduzidos. Os métodos de procedimento e normalização simples apresentados permitem para coleta de amostra repetida do mesmo paciente e geração de dados reprodutíveis que podem ser comparados entre os pontos de tempo para avaliar os efeitos potenciais do tratamento.

Introdução

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A fadiga é uma condição prevalente e angustiante que tem um impacto negativo sobre a qualidade de vida dos pacientes de câncer1. Até esta data, fadiga de câncer permanece mal definida e depende apenas de comunicação subjetiva pelos pacientes2. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar um teste de laboratório de diagnóstico facilmente adaptável para caracterizar objectivamente fadiga no ambiente clínico3,4.

Vários mecanismos subjacentes, incluindo disfunção da mitocôndria, têm sido propostos para causar fadiga5. As mitocôndrias são as organelas de potência, fornecendo a 95% das necessidades de energia celular através da fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante na sinalização de cálcio, apoptose, sinalização imune e regulamento de outros de eventos de sinalização intracelular6 . Da mesma forma, prejudicada bioenergética mitocondrial e defeitos na produção de energia podem contribuir para fadiga. Apoiam esta hipótese, estudos anteriores observaram mutações no DNA mitocondrial em pacientes com síndrome de fadiga crônica7. Enquanto isso ainda não está claro se a origem fisiopatológico da fadiga encontra-se dentro do sistema nervoso central ou periféricos tecidos, como músculos esqueléticos8,9, não existe actualmente nenhum método directo para avaliar com precisão disfunção mitocondrial relacionada à fadiga em células vivas, desoxigenadas.

Usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para estudar a função mitocondrial oferece várias vantagens. Primeiro, PBMCs estão prontamente disponíveis na prática clínica usando flebotomia padrão e podem ser isolados rapidamente utilizando técnicas básicas de laboratório. Em segundo lugar, coleta de sangue é menos invasiva do que a coleta de outros tecidos como uma biópsia muscular. Assim, amostras de sangue podem ser coletadas do paciente mesmo várias vezes ao longo do tempo, o que facilita a avaliação longitudinal dos efeitos do tratamento. Curiosamente, função mitocondrial em PBMCs aparenta ser bem correlacionados com status mitocondrial de rim em um modelo animal de10. Além disso, mitocôndrias de células imunes tem sido usadas como um proxy para detecção de alterações sistêmicas sob condições de diferentes doenças11,12. Mitocôndrias nas células do sistema imunológico de circulação são particularmente sensíveis a mudanças nas funções imunes e imune de sinalização moléculas tais como citocinas13,14,15. Por exemplo, tem sido observado que PBMC de pacientes com doenças inflamatórias reumáticas agudas apresentam alta de base de consumo de oxigênio14. Em contraste, o consumo de oxigênio foi reduzido em PBMCs isoladas de pacientes com condições inflamatórias sistémicas, incluindo sepse16. Sob condições inflamatórias, radicais livres produzidos por mitocôndrias disfuncionais pode contribuir mais elevado estresse oxidativo e inflamação prolongada17. O papel central da mitocôndria na produção de energia, bem como em estresse oxidativo sugere o potencial utilitário de usando a função mitocondrial como um proxy para o estudo de fadiga em pacientes de câncer 13.

Estudos anteriores, examinando a função mitocondrial utilizaram técnicas bioquímicas, medição do potencial de membrana mitocondrial ou isolamento de populações de células específicas que não podem ser facilmente adaptável ao ambiente clínico5, 14,18. Nos últimos anos, o desenvolvimento de ensaios de fluxo extracelular permitiu aos pesquisadores facilmente e com precisão, examinar as mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) em resposta às injeções automatizadas de inibidores respiratória19,20 , 21 , 22. no entanto, a maioria desses estudos é projetada para tipos específicos de células e o grande formato de alto rendimento pode não ser aplicável em um ambiente clínico. Este manuscrito, descrevemos um protocolo otimizado para examinar a função mitocondrial para uso clínico.

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Protocolo

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O estudo atual (NCT00852111) foi aprovado por institucional Review Board (IRB) do National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Os participantes inscritos no presente estudo foram homens euthymic, 18 anos de idade ou mais velhos, que foram diagnosticados com câncer de próstata não-metastático, com ou sem prévia prostatectomia e estava programado para receber a terapia de radiação de feixe externo (RT). Potenciais participantes foram excluídos se eles tinham uma doença progressiva que pode causar fadiga significativa, doença psiquiátrica dentro dos últimos cinco anos, tive hipotireoidismo não corrigido ou anemia, ou tinha uma segunda malignidade. Indivíduos que usavam sedativos, esteroides ou agentes anti-inflamatórios não-esteroides também foram excluídos. Amostras de sangue de controle saudáveis foram obtidas na medicina NIH departamento de transfusão de doadores saudáveis sob um protocolo aprovado IRB (NCT00001846). Todos os participantes são recrutados no Magnuson Clinical Research Center no NIH. Escrito assinados informado consentimentos foram obtidos antes da participação do estudo.

1. preparação de medição de função mitocondrial (1º dia do experimento)

  1. Hidratar o cartucho do Sensor (ver Tabela de materiais; aproximada duração: 5 min).
    1. Retire o cartucho do Sensor da embalagem. Adicionar a solução de Calibrant 200 μL em cada poço da placa de utilidade e, em seguida, encha cada fosso com solução de Calibrant 400 μL.
    2. Placa de Sensor retorno para a placa de utilitário, que agora tem a solução de Calibrant nele. Hidrate o cartucho numa incubadora não-CO2 37 ° C durante a noite.
      Nota: O Sensor cartucho precisa ser hidratado por um mínimo de 4 h e máximo de 72 h.

2. preparação da amostra clínico (2º dia do experimento)

  1. Fadiga de medida usando o item de 13 funcional avaliação de doença terapêutica crónica - fadiga (FACIT-F)2,23,24 na linha de base (antes da iniciação de RT), ponto médio e conclusão de RT e 1 ano pós-RT.
    1. Use um 0 - 4 escala para cada resposta a um item, onde 0 representa "nada" e um 4 indica que o entrevistado refere-se à instrução correspondente "muito obrigado". Escores totais devem variar de 16-53, com menor pontuação refletindo fadiga de alta intensidade.
    2. Defina fadiga como uma contagem de FACIT-F inferior a 43, com uma pontuação de FACIT-F de ≥43, indicando ausência de ou de fadiga não clinicamente significativo2.
      Nota: O placar de 43 melhores FACIT-F divide escores de fadiga de pacientes com câncer e a população em geral2.
    3. Incluem os seguintes 13 itens da escala de fadiga FACIT: 1) sinto-me cansado; 2) Sinto-me fraco tudo acabado; 3) eu me sinto apático ("desbotada"); 4) Sinto-me cansado; 5) eu tenho dificuldade para iniciar as coisas, porque estou cansada; 6) eu tenho dificuldade para terminar as coisas, porque estou cansada; 7) tenho energia; 8) eu sou capaz de fazer minhas atividades habituais; 9) preciso dormir durante o dia; 10) eu estou cansado demais para comer; 11) preciso de ajuda para fazer minhas atividades habituais; 12) estou frustrado por estar muito cansado para fazer as coisas que quero fazer; e 13) tenho que limitar minha atividade social, porque estou cansado.
  2. Isolar o PBMC de amostras de sangue coletadas recentemente (aproximado de duração: 1h).
    1. Coletar 8 mL de sangue em um tubo de preparação de células mononucleares (ver Tabela de materiais).
      Nota: Amostras de sangue devem ser processadas até 2 horas após a coleta. A qualidade de PBMC pode ser comprometida se as amostras de sangue são processadas mais de 2h após a coleta da amostra.
    2. Centrifugar a 1.750 x g, durante 30 min à temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferi a camada nublada para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar até 15 mL de PBS e inverter 5 vezes.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Retire cuidadosamente e desprezar o sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com a adição de 10 mL de PBS e inverter 5 vezes.
    4. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o líquido sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Transferi os PBMCs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    5. Centrifugar a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Retire o sobrenadante e ressuspender em RPMI-1640 completo (RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 10mm penicilina/estreptomicina).
  3. Revestimento de placas de célula para células não-aderente (aproximado de duração: 30 min).
    1. Preparar a solução adesiva de células e tecidos (ver Tabela de materiais) diluindo a solução estoque em bicarbonato de sódio de 0,1 M pH 8,0. A solução deve ser em 3,5 μg/cm2 de área de superfície.
      Nota: Esta solução contém proteínas de polifenólicos extraídas do marinho mexilhão, Mytilus edulis. Estas proteínas são componentes-chave da colagem secretada pelo mexilhão para ancorar-se às superfícies. Achamos que a célula-Tak funciona melhor com PBMC.
    2. Adicionar 100 μL de solução diluída adesiva a cada poço e incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente. Lavar três vezes com água Desionizada e ar seco.

3. mitocondrial função medição

  1. Preparação de meios de ensaio (aproximado de duração: 10 min).
    Nota: Mídia de ensaio deve ser preparadas no dia do experimento.
    1. Adicione L-glutamina, piruvato e glicose à base de mídia (mesmos componentes como modificado águia de Dulbecco médio (DMEM), mas sem bicarbonato de sódio, glicose, glutamina ou piruvato de sódio) para fazer o ensaio de mídia. Aquecer a mídia a 37 ° C, então ajuste o pH para 7,4.
      Nota: As concentrações de glicose, piruvato e L-glutamina são geralmente as mesmas concentrações em meios de crescimento normal, mas podem ser ajustadas baseadas no ensaio.
  2. Prepare-se para o teste de estresse de Mito PBMCs (aproximado de duração: 2h).
    1. Placa suficiente PBMCs do passo 2 para cada poço para alcançar a confluência de 80-90%. Em nossa experiência, de 1,5 x 105 células/poço produziu os resultados mais consistentes.
      Nota: Poços A e H são poços de fundo e devem conter apenas meios de ensaio com nenhuma célula. Em poços B a G, recomendamos chapeamento poços de pelo menos 3-6 por amostra do paciente para dar conta valores atípicos.
    2. Gire os pratos para baixo a 200 x g por 2 min permitir que as células aderir ao fundo dos poços. Lave as células uma vez com mídia de ensaio. Nesta etapa remove soro e bicarbonato de sódio a mídia de crescimento.
      Nota: Na nossa experiência, a etapa de lavagem remove tipicamente 20-30% das células.
    3. Adicione mídia de ensaio 180 µ l em cada poço, incluindo poços de fundo A e H. Incubar em uma incubadora de 37 ° C não-CO2 por 45-60 min.
  3. Executando o teste de Stress do Mito
    1. Reconstitua drogas no Mito Stress Kit com mídia de ensaio da seguinte forma:
      1. Oligomicina: Adicione mídia de ensaio μL 252 dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.
      2. FCCP: Adicione 288 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenona: Adicionar 216 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 25 μM.
    2. Vórtice reconstituído drogas durante aproximadamente 1 minuto. Dilua em soluções de trabalho.
      Nota: As concentrações das soluções de trabalho devem ser tituladas e pre-determinadas antes do experimento, dependendo do tipo de célula. Por PBMC, encontramos que 1 μM de oligomicina, 1 μM Compararia e 0,5 μM antimycin A / o melhor trabalho de rotenona.
    3. Pipete as drogas para cada porta no cartucho sensor sequencialmente:
      1. R: Porto pipeta 20 μL de 10 μM oligomicina, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.
      2. Porta b: pipeta 22 μL de 10 μM Compararia, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.
      3. C Porto: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para uma concentração final em cada poço de 0,5 μM.
  4. Selecione "teste de estresse do Mito" um instrumento de fluxo extracelular. Siga o prompt de instrumento e insira o cartucho de sensor. O aparelho executará automaticamente a calibração do sensor. Insira a placa de células após a calibração do sensor e o instrumento vão terminar o resto do ensaio. Dinâmica de oxigênio é medida a 530 nm (excitação) / 650nm (emissão), e a concentração de prótons é medida a 470 nm (excitação) / 530 nm (emissão).

4. normalização de dados função mitocondrial

  1. Preparar a solução de ensaio de proliferação de células (aproximado de duração: 5 min).
    1. Adicionar 48 mancha de ácido nucleico μL (500 x) e supressor de fundo 240 μL a 11,7 mL de PBS (2x). A mancha de ácido nucleico é um corante de ligação a DNA a célula-permeant, e o supressor de fundo é um corante de mascaramento que bloqueia as células mortas ou células com integridade comprometida da membrana celular de ser manchado. A combinação entre o corante de ligação a DNA e o supressor de fundo garante que as células só ao vivo estão manchadas.
    2. Adicione igual volume de solução de trabalho (180 μL) de 2x diretamente no meio de cada poço após o teste de estresse do Mito foi concluída.
  2. Incubar as células na presença de solução de ensaio de proliferação de célula em uma incubadora de 37 ° C por 45-60 min Quantify o número de células vivas (fluorescente) em um leitor de placa no 508 nm (excitação) / 527 nm (emissão) e normalizar dados OCR (aproximado de duração: 10 min) .
    Nota: além da números células vivas, os usuários podem também optar normalizar seus dados com o número total de células, a quantidade de ácido nucleico, as concentrações de proteína, etc.

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Resultados

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O teste de estresse de Mito baseia-se em medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) após injeção sequencial de vários inibidores respiratórias para mapear um perfil mitocondrial completo. Medições de OCR após cada injecção de droga pode ser usada para calcular os seguintes parâmetros relacionados com a saúde mitocondrial: OCR Basal mede-se primeiro antes de qualquer injeção de drogas para avaliar o consumo de oxigênio necessário para atender a demanda de ATP nível de repou...

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Discussão

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Fadiga em pacientes com câncer é uma condição debilitante que não está bem definida ou caracterizada1. Diagnóstico da fadiga depende inteiramente subjetivo relatórios e não há nenhum padrão atual de diagnóstico ou tratamento para essa condição, em grande parte devido à falta de entendimento em sua Patobiológico2. Dos propostos mecanismos subjacentes fadiga em pacientes com câncer, deficiência na função mitocondrial é uma das vias mais terapeuticamente targetable. Portanto, ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo é totalmente suportado pela divisão de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de enfermagem pesquisas de NIH, Bethesda, Maryland.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de Preparação de Células Mononucleares CPT BD Biosciences362761Para isolar PBMCs após flebotomia
RPMI-1640 Corning10-040Para fazer meios de crescimento para PBMCs
Soro bovino fetal (FBS)Corning35-010-CVPara fazer meios de crescimento para PBMCs
Penicilina / EstreptomicinaThermoFisher15140122Para fazer meios de crescimento para PBMCs
Cell-TakCorning354240Solução adesiva para células e tecidos; permite que as células em suspensão adiram à superfície
Solução Calibrante Seahorse XFAgilent103059-000Para hidratar cartuchos
XFp Fluxpak (miniplacas e cartuchos sensores)Agilent103022-100Contém miniplacas de cultura de células XFp e cartuchos de sensor
Mídia base XFAgilent103335-100Para fazer mídia de ensaio XF
45% solução de cultura de células D-(+)-Glucose Corning25-037-CIPara fazer XF meio de ensaio
Solução de piruvato de sódioCorning 25-000-CIPara fazer meios de ensaio XF
Solução de L-glutaminaThermoFisher25030081Para fazer meios de ensaio XF
Seahorse XFp Mito Kit de Testede Estresse Agilent103010-100Contém oligomicina, FCCP, antimicina A/rotenona
Ensaio de Proliferação Celular Direta CyQUANTThermoFisherC35011Para quantificação de células vivas e normalização
de dadosSeahorse XFp AnalyzerAgilentS7802AEAPara medir a função mitocondrial em células vivas
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (ou qualquer instrumento que possa quantificar células fluorescentes em uma placa)BioTekBTCYT5PVPara quantificação de células vivas e normalização de dados

Referências

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