Os ratos expostos ao LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar que são embalados com miRNAs. Usando um sistema de co-cultura, mostramos que exosomes lançados no fluido BAL perturbará a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas e aumentar a expressão de citocinas pró-inflamatórias que acentuam a lesão pulmonar.
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Artigo de método
Exosomes de lavagem broncoalveolar em lesão pulmonar séptico induzidas pelo lipopolissacarídeo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome da angústia respiratória (Sara) representam um grupo heterogêneo de doenças pulmonares, que continua a ter uma alta taxa de morbidade e mortalidade. A patogénese molecular de ALI está sendo melhor definido; no entanto, devido à natureza complexa da doença terapias moleculares ainda precisam ser desenvolvido. Aqui nós usamos um modelo de rato induzida de lipopolissacarídeo (LPS) de lesão pulmonar aguda séptico para delinear o papel do exosomes na resposta inflamatória. Usando este modelo, fomos capazes de mostrar que os ratos expostos a LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar dos pulmões que são embalados com miRNA e citocinas que regulam a resposta inflamatória. Ainda mais usando um sistema de modelo co-cultura, mostramos que exosomes lançados de macrófagos interromper a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas. Estes resultados sugerem que 1) conversas cruzadas entre inatas células imunes e estruturais através do vaivém exosomal contribuem para a resposta inflamatória e rompimento de barreira estrutural e 2) segmentação destes miRNAs pode fornecer uma nova plataforma para tratar ALI e SDRA.
Introdução
ALI e Sara é as formas de vida-ameaçando de insuficiência respiratória com hipoxemia grave causada por edema pulmonar não-cardiogênico, que afeta cerca de 1 milhão pessoas no mundo anualmente1. A etiologia da SDRA inclui lesão direta para os pulmões de infecções ou aspiração e uma variedade de insultos indiretas. Na última década, tem havido uma maior compreensão da patogênese molecular da SDRA, no entanto, tratamentos alvo específicos para SDRA estão ainda a ser desenvolvido,2,3.
Foram desenvolvidos vários modelos animais de lesão pulmonar aguda que fornecem....
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Protocolo
O protocolo global requer 2 dias, incluindo o primeiro dia da indução de sepse e isolamento do fluido BAL de animais e o segundo dia para isolamento de exosomes do mouse BALF. Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso no centro médico do VA de Atlanta e institucional Cuidado Animal.
1. modelo de lesão pulmonar aguda séptico Mouse
- Use 6-8 semanas - velho selvagem-tipo C57BL/6J camundongos machos (20 a 22 g de peso) para o animal modelo e executar todos os procedimentos utilizando técnicas assépticas e instrumentos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo fórceps e a tesoura por 20 min a 121 ....
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Resultados
Para induzir lesão pulmonar séptico, os ratos foram tratados com LPS intraperitoneal (15 mg/kg). Dentro de 24 horas da administração de LPS, neutrofílico influxo foi visto nos pulmões, conforme mostrado na figura 1A. Fluido de mouse BAL foi desenhado, seguido pelo isolamento e purificação de exosomes. Morfologia do LBA exosomes foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (figura 1B).
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Discussão
Modelos de mouse de doenças são comumente usados para avaliar a função fisiológica de genes específicos e para reduzir o custo de experimentação2. A lesão pulmonar aguda séptico descrita aqui imita a resposta inflamatória nos seres humanos com SDRA. Este modelo é relevante para investigar a patogénese molecular, desenvolvimento de biomarcadores e testar potenciais novas terapias5.
Sistemas de co-cultura são relevantes para estudos em vivo
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Divulgações
Este trabalho foi apoiado pela revisão de mérito VA 2I01BX001786-06A1 financiamento para RS.
Agradecimentos
Os autores declararam que não há conflito de interesses.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| lipopolissacarídeo | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| kit de isolamento de miRNA mirVana | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| meio essencial mínimo (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Solução de Trysina-EDTA(0,05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Os exossomos foram marcados com PKH67 através de PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrífuga | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Beckman Coulter | 344058 | ||
| Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR em tempo real rápido | Thermo Fisher | ||
| microscópios eletrônicos de transmissão (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Microscópio Olympus BX41 Olympus | BX41 |
Referências
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.
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Reimpressões e permissões
