Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения простой сотовой фракционирование субцеллюлярные разделение цитоплазмы и ядерных белков в человека свежие и замороженные кишечное биопсии.
Abstract
Цель настоящего Протокола заключается в фракционировать кишечных тканей человека, полученные по эндоскопии в ядерные и цитоплазматические отсеки для локализации анализа специфических белков или белковых комплексов в различных тканей государств (т.е., здоровый против болезни). Этот метод полезен для фракционирования обоих образцов свежие и замороженные кишечных тканей; Это легко доступны для всех лабораторий и не отнимает много времени.
Introduction
Белки участвуют в почти все биологические функции в клетке и любые изменения в их структуры, количества или расположение может привести к патогенным сценарий. Ткани образец фракционирование методы являются полезным подходом для снижения сложности заболевания связанные с анализа белка. Некоторые исследования используют информацию о локализации протеина или обогатить белка от конкретных клеточных отсек, так это протокол для воспроизводимых фракционирование интакт белками полезно ответить на некоторые вопросы, биологические. Определение локализация внутриклеточных белков и мониторинг их полигамное перераспределения или взаимодействий в базальной и условиях заболевания поможет определить заболевание связанные функциональные различия1,2. Таким образом этот метод призван можно воспроизвести фракционировать кишечных тканей биопсий, свежие и замороженные, на ядерные и цитоплазматические субцеллюлярные отсеков.
Кишечное биопсии образцы обычно получаются во время эндоскопические процедуры3 (рис. 1) и может эффективно использоваться для количественного определения белка или иммунопреципитации исследований. Поскольку образцы ткани из кишечного эпителия будет содержать белки, которые могут быть непосредственно вовлечены в патогенез болезни4, кишечное биопсии образцы являются весьма ценным источником для успешной идентификации конкретных кишечных заболеваний белки. Образцы хранимой замороженные, пациент тканей вместе с клинической информации являются полезными ресурсами для анализа белка, и простой и воспроизводимой пробоподготовки является ключевым вопросом для предоставления ячейки полигамное информации с использованием ограничения количества замороженных ткани5.
Есть несколько коммерчески доступные наборы для разделения фракций сотовой, но они дороже и вообще больше времени, чем протокол, представленные здесь. Протоколы, основанные на несколько шагов градиентного центрифугирования и непрерывной градиенты ранее использовались также для фракционирования различных клеточных отсеков в различных тканях6,7. Однако поддержание согласованности непрерывного градиентов часто является трудной задачей. Аналогичные протоколы, основанный на последовательном lysis мембран ранее говорилось, но они обычно требуется более двух буферов и руки на время составляет более8 .
Когда фракционирования образцы тканей, имейте в виду что ткани образцы настоящего-клеток и клеток матрица взаимодействия, которые не присутствуют в культивируемых клеток и важным при следовании белка добычу. Надлежащего разбивка между клетками и внеклеточного матрикса без ущерба для качества белка будет решающим фактором в кишечных тканей белка изоляции9. В этом протоколе ячеек и ячеек матрицы контакты сначала сломанной, выпустив клетки и позволяя буфера до отдельных ячеек. Чтобы избежать смешивания до фракционирования белков купе, разбивка контактов должны произойти, не изменяя целостность клетки или ядерной мембраны.
За счет обогащения различных протеаз в слизистой оболочке кишечника10важно контролировать деградации белка во время извлечения. Для сведения к минимуму потенциальной деградации белка, несколько ингибитор протеазы должны быть включены в буферах экстракции белка. Кроме того если выдержки будет использоваться для функциональных анализов, важно избежать денатурации белков или протеолиза, как это может привести к потере активности белков11. Для этой цели протокол выполняется при температуре 4 ° C и свежие phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) добавляется в буферы в конечной концентрации 0,1 мм перед использовать для дальнейшего подавления протеолиза.
Первым шагом в ячейке фракционирование является разрушение тканей и lysis клетки. Как упоминалось ранее, цель заключается в разбивке клетки и разрыв их открытыми с минимальным ущербом. Необходимо гомогенизированных образцов кишечных тканей, и клетки лизированы для достижения максимальной поломки мембраны клетки. В этом протоколе мы используем моторизованный толкатель смеситель сломать кишечника ткани, которая является гомогенизации в течение нескольких секунд с помощью высокой скорости vortexing действий. После гомогенизации ткани клетки инкубируют в гипотонический буфер, который будет взрыв клеточной мембраны, но будет держать ядер нетронутыми, следуют-денатурации моющего средства (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) и коротких вихревых отделить ядер от фракции цитоплазматических. После удаления цитоплазме клеточной мембраны ядер ворвались в гипертонический буфер встряхивании.
Представленные здесь используется соответствующий метод для субцеллюлярные фракционирование свежих и замороженных кишечное биопсии, которые были получены в ходе эндоскопических процедур и колеблется от 2 до 10 мг в весе. Протокол просто и воспроизводимость и может быть выполнена с использованием основного лабораторного оборудования и реагентов в соответствии с час.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование был одобрен Советом по этике госпиталя Крусес университета и анализы после того, как информированное согласие было получено от всех субъектов или их родителей.
1. Биопсия коллекция
Примечание: Биопсии образцов от дистальной части двенадцатиперстной кишки больных получены во время рутинной диагностики эндоскопии, управляющий биопсия этого диапазона между 2 и 10 мг в весе. Биопсию тканей является комплекс ткани, состоящий из различных типов клеток включая эпителиальные, иммунной и эндотелиальных клеток. Клинические гастроэнтерологов выполняют эндоскопии клинической установлено следующее.
- Место биопсии на стерильную фильтровальную бумагу сразу после эндоскопии.
- Используйте щипцы для передачи биопсий в 1,5 мл пробирок, смочите их с PBS и поместить его в cryotube.
- Держите трубы на льду, до тех пор, пока они прибудут в лаборатории.
- Начало обработки свежих биопсий немедленно.
- Для замороженных биопсий вспышки заморозить биопсии, содержащие трубы и хранить в жидком азоте до использования.
Примечание: Важно сохранить образец заморожен до тех пор, пока холодная дополнениями буфер 1 добавляется.
2. буфер подготовка
Примечание: Перед началом, следующим дополнение буферы.
- Добавить 1 мм DTT (конечная концентрация) и протеазы и фосфатазы ингибитор коктейль (1 x конечная концентрация) в гипотонический буфер 1 и гипертонический буфера 2 (Таблица 1).
- Приготовьте 1,5 мл буфер 1 и 150 мкл буфера 2 на сэмпл. DTT будет предотвратить окисление образцов.
- Подготовьте мыть буфера ядра, добавив 1% моющего средства (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) до конечной концентрации 0,1% уже дополнен буфер 1. Готовим 1 мл буфера ядра мыть на сэмпл.
3. Биопсия гомогенизации
-
Свежий биопсии
- Место одноразовые пестиком в моторизованных смеситель. Убедитесь, что толкатель достигает нижней части трубки.
- Возьмите биопсия из cryotube и поместите его в 1,5 мл с пипеткой наконечником.
- Добавьте 200 мкл буфера дополнениями 1 1,5 мл.
- Однородный биопсии с толкателем, до тех пор, пока ткань полностью нарушена и держать его на льду.
- После того, как все биопсии гомогенизированные перейдите к шагу 4.
Примечание: Одноразовые бабы должны быть изменены между биопсии.
-
Замороженные биопсии
ВНИМАНИЕ: Осторожно жидкого азота; контакт с на кожу или в глаза жидкого азота может привести к травме замораживания. Защите глаза и руки всегда при работе с жидким азотом.- Примите некоторые жидкого азота в коробку для хранения cryotubes, извлеченные из бака азота.
- Найти биопсии в баке азота и место cryotube в поле с жидким азотом. Повторите этот шаг для всех биопсии.
- Передать биопсии с cryotube 1.5 мл.
Примечание: Биопсий будет прилагаться к замороженные трубы. Толкать биопсии с наконечником стерильной пипеткой, так что она будет отделить от трубки. - 200 мкл дополнениями буфера 1.
- Однородный ткани с помощью пестика и раствора до тех пор, пока ткань полностью нарушена, поддержание температуры на 4 ° C на протяжении всей процедуры.
Примечание: Не позволяйте биопсий размораживать перед добавлением буфера.
4. цитоплазме изоляции
- Инкубируйте гомогенизированные биопсии на льду за 10 мин.
- 10 мкл 1% моющего средства (nonyl phenoxypolyethoxylethanol), для каждого образца до конечной концентрации 0,05%.
Примечание: Клетки будет набухать и лопнуть от осмотического лизис как моющего нарушит клеточной мембраны. - Инкубируйте на льду на 5 минут.
- Вихревой кратко и центрифуги на 400 x g при 4 ° c на 2 мин.
- После vortexing удалить супернатант и передача его в новой чистой 1,5 мл трубки; Это будет цитоплазматических дроби. Не выбрасывайте гранулы.
5. Ядерная изоляции
- Ресуспензируйте гранулы из предыдущего шага с 200 мкл буфера ядра мыть.
- Центрифуга для трубки для 2 мин на 400 x g и 4 ° C.
- Отменить супернатант и стиральная повторить еще два раза.
Примечание: Моет удалит цитоплазматических загрязнение в ядерной фракции. - После третьей стирки Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера 2.
- В качестве альтернативы встряхнуть образца на 4 ° c на 30 мин, Проинкубируйте образцы на льду и вихревой каждые 5 мин.
- После встряхивания, центрифуга образца для 10 мин на максимальной скорости (> 12000 x g) и 4 ° C.
- После vortexing передача супернатант в новой чистой 1.5. мл. Это будет ядерной дроби.
6. белка количественная оценка
Примечание: Количественно белки с комплектом белка пробирного кислоты (BCA) bicinchoninic. Концентрация белка во фракциях будет варьироваться от 0,5 до 5 мкг/мкл, ниже в ядерной фракции (см. таблицу 2 на концентрацию белка, полученный от 2 мг биопсии).
- Подготовить калибровочной кривой с следующие суммы (мкг) бычьим сывороточным альбумином (БСА)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Подготовка реагентов, необходимых для использования 100 мкл финальный микс BCA на сэмпл.
- Пипетка 2 мкл каждого белковых фракций в 96 хорошо тарелку, добавить смесь BCA и следуйте инструкциям производителя для чтения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает эозином гематоксилином кишечное биопсии секции с нетронутыми ворсинки и склеп структур.
Представитель результаты ядерные и цитоплазматические фракционирования, используя этот протокол показаны на рисунках 2 и 3. В эксперименте, показано на рисунке 2, (Fh) свежие и замороженные (ФЗ) биопсии были одновременно фракционированный после протокола, представленные здесь, и Западная помарка была выполнена с использованием 20 мкг каждого образца. В таблице 2показаны концентрации белка в каждой фракции и биопсии, и концентрации белка различаются не очень свежие и замороженные ткани. Урожайность белка, извлеченные из биопсии 2 мг составляет около 3-4 мкг/мкл в цитоплазматических фракции и приблизительно 1,5 мкг/мкл в ядерной фракции. Чтобы проверить чистоту фракций, HSP90 и тубулин были использованы как цитоплазматических элементы управления и HDAC1 и H3 ядерного контроля13. Можно отметить, что HSP90 и тубулин первичной расположен в цитоплазме и HDAC1 и H3 находятся в ядре с очень минимальной смешивания между двумя фракциями. Чтобы оценить ли протокол влияет на смерть клетки, мы также смыл на наличие каспазы-3. Рисунок 2оба образцы представляют очень минимальной пятнать caspase 3 подтверждения, что процедура не влияет на путь смерти клетки даже после вспышки замораживания биопсии. Он также был проанализирован если белка изменения сохраняются после процедуры, так что белки могут быть использованы для вниз по течению функциональных анализов. PhosphoSTAT1 используется для окраски как замороженные биопсии, используемые в этом фракционирования пришли от индивидуума с кишечные воспалительные состояния; Это не касается свежих биопсии. Как и ожидалось, phosphoSTAT1 расположен в цитоплазме замороженных биопсии, подтверждающий, что белок изменения сохраняются после ректификации.
Воспроизводимость метода с использованием замороженных биопсий показан на рисунке 3. Западная помарка была выполнена после фракционирование трех независимых замороженные биопсий, и фракции чистых с минимальными отсек протеин смешивания (рис. 3A): HSP90 расположен в цитоплазматических дроби и HDCA1 в ядерной фракции. Кроме того было также смыл XPO1 белок, который присутствует в обеих фракций ядерные и цитоплазматические14 . Можно отметить, что уровень XPO1, количественно ImageJ стабильны в каждой фракции (рисунок 3B), подтверждающий воспроизводимость результатов, используя различные биопсии.
Рисунок 1 : Свет Микрофотография кишечного эпителия секции, окрашивали гематоксилином-эозином, от приобретенных эндоскопической процедуры биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель западной помарке субцеллюлярные фракционирования выступал в свежий (Fh) и замороженные (ФЗ) биопсии. HSP90 и тубулин были использованы как цитоплазматических контроль и HDAC1 и H3 как ядерного контроля. Присутствие CASP3 и phosphoSTAT3 также были оценены.
Рисунок 3 : Фракционирования результаты трех независимых замороженные биопсии. (A) представитель западной помарке субцеллюлярные фракционирования осуществляется в трех замороженных биопсий (1, 2 и 3). HSP90 был использован как цитоплазматических управления и HDAC1 как ядерного контроля. Локализация XPO1 была также оценена. (B) относительные количественная оценка XPO1 в каждой фракции сделали использованием ImageJ программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Буфер | Компоненты | Примечания |
| Гипотонический буфер 1 | 10 мм HEPES рН 7.9 | 1,5 мл буфера/образец |
| 10 мм KCl | ||
| 0.1 nmM ЭДТА | ||
| Гипертонический буфера 2 | 20 мм HEPES рН 7.9 | 150 мкл буфера/образец |
| 400 мм NaCl | ||
| 0,1 мм ЭДТА | ||
| * Примечание: Буферов может храниться в 4ºС за месяц. | ||
| ** Примечание: Буферы должны быть дополнены ингибиторы протеиназы и фосфатазы и DTT перед использованием | ||
Таблица 1: Состав буфера.
| Свежий | Замороженные | |
| Цитоплазма | 2.975 | 4,612 |
| Ядро | 1.516 | 1.385 |
Таблица 2: Концентрация белка каждой из фракций в свежих и замороженных 2 мг биопсии, используемый в рисунке 2; концентрация представлена в мкг/мкл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для ядерные и цитоплазматические фракционирование кишечное биопсии используется протокол, описанных здесь. Очищенные белки не денатурированы и может использоваться не только в западном анализе помаркой как показано на рисунке 2 и 3 , но и в анализы, требующим родной сложенные белки, например иммунопреципитация, assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA) или родной полиакриламидный гель-электрофорез (страница).
Описан метод основывается на механической гомогенизации ткани вместе с осмотическим лизис лопнуть мембраны клетки, не затрагивая ядерной мембраны. В результате получается чистый фракционирование цитоплазмы и ядерных белков использоваться для анализа, ниже по течению. Важно контролировать деградации белков во время процесса добавления белка и фосфатазы ингибиторов. Кроме того если извлеченные протеины будут использоваться для вниз по течению функциональных анализов, это также важно, чтобы избежать денатурации и протеолиза образцов. Процессы должны осуществляться на 4 ° C и PMSF следует также добавить в буферы.
Процедура, описанная в настоящем Протоколе является простым и доступным, и время обработки образца является минимальным. Такие проблемы, как долго время обработки и использования дорогостоящих фракционирование наборы не являются ограничения в этом протоколе.
Свежие и замороженные биопсии можно использовать в этом протоколе, с замороженных биопсий, давая результаты довольно чистый и воспроизводимые фракционирования, как показано на рисунке 2 и 3. Если отсек загрязнение, время лизис клеток может быть сведена к избежать выхода ядерных в цитоплазму и мытье шаги могут быть добавлены чтобы избежать цитоплазматических загрязнения в отсеке ядерной.
Возможность использования замороженных тканей для независимого анализа ядерные и цитоплазматические белковых фракций может увеличить наши знания о кишечные воспалительные заболевания, в которых хранятся замороженные биопсии. Кроме того этот метод может быть адаптирована к другим видам ткани человека, приобретена биопсии. Количество буферов, используемых должен быть изменен в зависимости от размера биопсии.
Описанные здесь протокол предназначен для создания воспроизводимых ткани фракций; Однако некоторые внутренней изменчивости в пределах образца, включая размер и статус ткани может привести к отклонения количества белка и распределения, управляемых в каждой фракции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают помощи Ander Лопес и Мирен Telletxea видео записи и редактирования. ACR финансируется Ikerbasque стипендий и исследовательский проект от Celiacos Ассоциация де Мадрид (ACM). JRB финансируется проект ISCIII-PI16/00258 и совместное финансирование от Европейского союза ERDF/ПФ «Способ сделать Европу». Это финансируется исследовательский проект Грант 2015111068 Басков Департамента здравоохранения. IRG и Предложившем поддерживаются лектор стипендий гранты от УПВ/ЕГУ и Басков Департамента образования, соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
