Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Eletrofisiologia é usada como uma ferramenta de diagnóstico em doenças neuromusculares como miopatias, plexopatias, neuropatias, doenças da junção neuromuscular e doenças do neurônio motor. Em esclerose amiotrófica lateral (ALS), em que são afetados principalmente os neurônios motores, o dano axonal e de paralisia muscular¹ são refletidas em amplitudes CMAP reduzidas na eletroneuromiografia (NCS). Na doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT) ambos degeneração axonal e desmielinização podem ser estimados em nervos periféricos usando o NCS². Esta técnica pode ser usada para confirmar o diagnóstico, bem como para avaliar a progressão de doença^3,4. NCS permitem a estimativa da patologia axonal, que é deduzida a partir da magnitude do potencial de ação amplitude⁵, e a extensão da desmielinização - que resulta em velocidade de condução reduzida, prolongada latências distais, ou bloco de condução ⁶.

Medição de CMAP é um método rápido e sensível para avaliar a condução nervosa em humanos e ratos. Considerando que em pacientes NCS são realizadas rotineiramente em vários locais para gravar diferentes dos nervos e músculos, em camundongos, as medições CMAP normalmente são feitas apenas para o nervo ciático avaliar a funcionalidade do nervo dos membros posteriores. No entanto, em alguns estudos animais seria vantajoso para registro CMAP tanto no primeiro plano - e membros posteriores, por exemplo, a seguir a progressão da doença diferencial entre frente - e membros posteriores em modelos do rato ALS.

Aqui, apresentamos um método para gravação CMAPs partir os forelimbs de ratos utilizando eletrodos de agulha. Além disso, nós fornecemos uma abordagem para medir CMAPs de membros posteriores, da mesma forma com eletrodos de agulha. A medição do CMAPs de membros posteriores com eletrodos de anel foi apresentada anterior^7,8. A gravação do CMAPs usando eletrodos de agulha é um método de medição rápido, não requer corte do pelo e o procedimento de medição hind - e patas dianteiras leva apenas 10 min por animal para um pesquisador experiente. Além disso, esta abordagem minimamente invasiva é viável para medidas repetidas permitir o acompanhamento longitudinal de múltiplos nervos em animais.

Todos os animais estavam alojados em condições normais de acordo com as diretrizes do KU Leuven - Universidade de Leuven e orientações europeias associadas (União Europeia Directiva 2010/63/CE relativamente a experiências em animais). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ético local do KU Leuven.

1. anestesia e preparação animal

1. Induzi a anestesia no mouse com inalação de oxigênio/isoflurano. Usar 4% de isoflurano para a indução da anestesia e 2-3% para a manutenção em 2,5 L/min de fluxo de oxigênio. Ajustar a porcentagem de isoflurano para a manutenção da anestesia de acordo com a condição do mouse, ou seja, ratos pequenos e fracos exigem menos anestésicos. Confirme a anestesia adequada, por exemplo, aplicando pressão suave do membro posterior andando almofada para verificar a ausência de um reflexo de retirada de dor.
2. Controle a temperatura do corpo de rato usando uma placa de aquecimento termostática a 37 ° C para evitar a diminuição da temperatura corporal durante a anestesia.
3. Ajuste o mouse com o cone do nariz para a manutenção da anestesia. Certifique-se de que o animal tem entrega suficiente de oxigênio, verificando que o cone do nariz não bloquear vias aéreas e que o animal está respirando constantemente.
4. Durante a gravação, verificar se o mouse é suficientemente anestesiado, observando a taxa de respiração (aproximadamente 1 Hz em anestesia) e a ausência de um reflexo de retirada na pressão suave. Aumente a concentração de isoflurano manualmente se a anestesia não é suficientemente forte.
5. Após as medições, deixe o mouse para recuperar na chapa de aquecimento ou no calor de uma lâmpada infravermelha até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal, para aproximadamente 2-5 min. Não deixe o mouse autônoma e na companhia de outros ratos até recuperou totalmente da anestesia.

2. medição de CMAP nos membros dianteiros e traseiros

Figura 1. Posicionamento dos eletrodos para medições CMAP. A posição dos eléctrodos é apresentada para hind-(A) e membros dianteiros (B). Os eletrodos são numerados da seguinte forma: 1: ânodo e 2: cátodo estimulando eletrodos, 3: eletrodo gravação ativo, 4: eletrodo de referência e 5: eletrodo de aterramento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Use os eletrodos de agulha 27G para medições de CMAP membro posterior e membro anterior. Veja a Figura 1 para lugares recomendados de posicionamento do eletrodo.
2. Coloca eletrodos sobre o membro posterior como segue.
   1. Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento na posição de bruços. Estender o membro posterior no joelho e anexar a pata sobre a superfície de trabalho usando fita adesiva (figura 1A).
   2. Colocar os eletrodos de estimulação por via subcutânea, em ambos os lados do entalhe sciatic com uma distância de aproximadamente 2 cm (1 = ânodo e 2 = cátodo) entre os eletrodos. Levante a pele para inserir a agulha perpendicularmente através da pele e empurrar aproximadamente 5 mm da agulha sob a pele sem perfurar a musculatura subjacente.
   3. Da mesma forma, coloque o eléctrodo de gravação (3) por via subcutânea, alinhando o músculo gastrocnêmio. Inserir o eléctrodo de referência (4) por via subcutânea, ao lado do tendão de Aquiles em um ângulo de 30 graus e deixe de 2 a 5 mm da agulha sob a pele. Coloque o eléctrodo de terra (5) por via subcutânea no lado do mouse em uma maneira similar como os eletrodos de estimulação, mas a posição deste eletrodo não é crítica para a medição.
3. Coloca eletrodos sobre as patas dianteiras como segue.
   1. Posicione o mouse sobre a almofada de aquecimento na posição supina e usar fita adesiva para estender as duas patas dianteiras dos lados do corpo (figura 1B).
   2. Colocar os eletrodos de estimulação (1 = ânodo e 2 = cátodo) por via subcutânea em ambos os lados do membro anterior para alinhar com o nervo do plexo braquial. Levante a pele para inserir a agulha perpendicularmente através da pele e empurrar aproximadamente 5 mm da agulha sob a pele sem perfurar a musculatura subjacente.
   3. Coloque o eletrodo de gravação (3) por via subcutânea na parte superior do músculo bíceps braquial, levantando a pele. Coloque o eletrodo de referência (4) sobre as pastilhas ambulante na profundidade de 3 mm em um ângulo de 30 graus. Coloque o eléctrodo de terra (5) por via subcutânea no lado do mouse.
      Nota: Eletrodos estão em estreita proximidade um do outro nesta configuração. Impedir a tocar uns aos outros como isto distorce a gravação de eletrodos.

3. aquisição de dados

1. Começar a estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente na unidade de controlador e rode o botão do controlador de intensidade para aumentar o estímulo. Estimule todos os axônios usando 1 pulso/s com duração de 0,1 ms estímulo. Selecione a frequência correta e a duração de menus suspensos no software.
2. Para chegar a estímulos supramaximal (5-20 mA; em desmielinizantes condições até 60 mA), aplicar estímulos crescentes, girando o botão do controlador de intensidade até a amplitude da resposta CMAP cessa de aumentar. A partir daí, aumente ainda mais o estímulo de 20% para garantir que a amplitude do CMAP atingiu sua resposta máxima. Fim da estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente novamente.
3. Use a ferramenta de marcador para indicar os seguintes pontos na gravação: iniciação do estímulo, a iniciação da resposta, pico máximo positivo e máximo pico negativo (Figura 2).
4. Determine a latência (em ms) como um atraso a partir do início do estímulo para a iniciação da resposta (Figura 2). Defina o início da resposta como o ponto mais antigo, onde a amplitude começa a aumentar. Use a latência para avaliar desmielinização nos axônios.
5. Medir a amplitude (mV) do negativo máximo de pico positivo máximo (Figura 2). Use a magnitude da amplitude para correlacionar o número de axônios funcionais.

Figura 2. Imagem representativa da resposta CMAP. Uma resposta CMAP descritiva, indicando os locais utilizados para o cálculo da amplitude e latência (A). Latência é determinada pelo atraso a partir da estimulação para o início da resposta CMAP. Amplitude pico-a-pico é medido a partir do negativo máximo ao máximo pico positivo da onda bifásica. Gravações representativas de um animal não-transgênicas saudável (B) e um animal doente com latência prolongada e amplitude reduzida (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Como o exato posicionamento dos eléctrodos pode afetar o valor do resultado da gravação, substituir os eléctrodos e medir a mesma coragem para três vezes usando supramaximal estímulo para garantir que a maior resposta é obtida. Use a média de gravações.

Medidas eletrofisiológicas da CMAPs utilizando eletrodos de agulha é um método minimamente invasivo e muito sensível a seguir a função neuromuscular ao longo do tempo. A técnica descrita aqui, permite a avaliação da condução nervosa de membro anterior em ratos e assim, fornece insights sobre a funcionalidade do nervo.

O CMAP amplitudes e latências foram medidas de patas dianteiras e traseiras durante o curso da doença em dois modelos de rato de ALS, SOD1 G93A9 e PrP-hFUS-WT310 (Figura 3) e em um modelo do rato do CMT, C61-PMP2211,12 (Figura 4). Modelos de rato ALS foram criados pela superexpressão de genes humanos ALS-relacionadas, ou seja um mutante SOD1 ou selvagem tipo FUS. Em ambos os modelos, os ratos desenvolvem ALS assemelhando-se a degeneração progressiva dos neurônios motores, levando à paralisia. Em controles de littermate não-transgênicas, a amplitude CMAP de hind - e patas dianteiras não mudou ao longo do tempo (Figura 3A). Por outro lado, a amplitude CMAP do nervo ciático do membro posterior foi diminuída drasticamente nos ratos SOD1 G93A, mesmo antes do início do sintoma em torno da idade de 60 dias (Considerando que os primeiros sintomas de motor são geralmente observados com a idade de três meses)13 . A amplitude foi de 90 mV nessa idade na não-transgênicos (não-tg) littermates, Considerando que em camundongos SOD1 G93A era apenas 30 mV. Havia apenas mínima queda ainda maior na amplitude como a doença progrediu para fase tardia sintomática na idade de 150 dias. O declínio na amplitude CMAP, e, portanto, a degeneração dos axônios, atrasou-se no nervo do plexo braquial de membros dianteiros em comparação com o nervo ciático dos membros posteriores. Os membros dianteiros, a progressão da doença também foi mais perceptível como o CMAP amplitude diminuiu de 70 mV-30 mV quando medidos antes e após a manifestação dos défices motor nestes ratos.

No modelo do rato de PrP-hFUS-WT3 de ALS, o aparecimento de déficits motor começa aproximadamente na idade de 28 dias,10, que coincide com o início do declínio da amplitude do CMAP. Este é um modelo mais acelerado da doença como os ratos atingir o estágio final aproximadamente com a idade de 65 dias. O declínio na amplitude CMAP ocorrido mais rapidamente no nervo ciático do membro posterior em comparação com o nervo do plexo braquial no membro anterior, o que indica uma anteriormente degeneração axonal dos membros posteriores (Figura 3D). Esta observação suporta a observação clínica em ambos estes modelos do rato como os membros traseiros estão paralisados notavelmente mais cedo do que os membros dianteiros que permanecem funcionais até os estágios finais do processo de doença.

Em geral, a latência de estímulo à iniciação do potencial de ação foi menor nos membros dianteiros em comparação com os membros traseiros (Figura 3B, E). Isto é simplesmente devido a distância mais curta entre o estímulo e os eletrodos de gravação. A latência fornece uma indicação do nível de mielinização dos axônios. Nossa observação é que latências CMAP são prolongadas durante a progressão da doença em modelos do rato de ALS, embora ALS não é uma doença desmielinizante. Isto é provavelmente devido a perda do maior, mais rápido, realizando axónio motor.

Os ratos C61-PMP22 superexpressão de 3-4 cópias do humano PMP22 e os ratos de heterozigoto recapitular um fenótipo de doença CMT1A muito suave com desmielinização leve e CMAPs reduzidas, mas com nenhum fenótipo visível11,12. Em 1,5 a 2 anos de ratos de idade C61-PMP22, as amplitudes CMAP são reduzidas e latências prolongado tanto nos membros traseiros e patas dianteiras (Figura 4). Representante gravações exibindo amplitude diminuída e resposta atrasada em comparação com uma gravação de um indivíduo sadio são apresentadas na Figura 2B, respectivamente. As latências CMAP em membros anteriores não são afetadas tanto quanto em membros posteriores. Isto é consistente com pacientes CMT1A, quanto mais frequentemente pacientes severamente CMAPs reduzidos ou indetectáveis nos membros inferiores devido à natureza fisiopatológico da CMT como um transtorno dependente do comprimento de14. Além disso, o grau de severidade da doença está correlacionado com amplitude CMAP, ao invés de velocidade latência ou condução, como amplitudes se correlacionam com o grau de integridade axonal14,15. No entanto, os resultados indicam que este método é suficientemente sensível para a detecção desmielinizantes processo tais como aqueles observados em CMT1A.

Variação na amplitude e latência foi menor em grupos não-transgênicos (coeficiente de variação 2-15 e 1-13%, respectivamente). Em todos os casos de transgénicos, havia mais variação nas medições (coeficiente de variação, 8-51% de amplitude e latência % de 1-21), que provavelmente é causada por diferenças na progressão da doença entre os animais. Em todos os casos, a variação foi semelhante nos membros dianteiros e traseiros. A variação no uso de agulha e eletrodos de superfície foi relatada para ser semelhante16.

As intensidades de estímulo necessário não variam entre não-transgênicos e modelos ALS (Figura 3, F). Da mesma forma, o estímulo necessário para alcançar supramaximal estímulo nestes casos era semelhante para frente - e membros traseiros e variou entre 5-12 mA. No CMT, a exigência de intensidades de estímulo aumento tem sido reconhecido17 e o mesmo fenótipo foi visto em ratos C61-PMP22 (Figura 4). O fenômeno foi explicado por impedância elétrica aumentada de endoneurial hipertrófica alterações17.

Para confirmar que a amplitude CMAP gravada a partir de membros anteriores foi devido à estimulação do nervo e não estimulação muscular, realizamos axotomy parcial unilateral no nervo do plexo braquial em 5 meses de idade não-C57BL/6Jax ratos transgénicos (masculinos e femininos) ( Figura 5). Axotomy reduzido a amplitude CMAP de 90 mV a 20 mV, indicando que a maioria dos axônios foram desconectada na operação. Não houve alteração na amplitude do membro anterior contralateral ou dos membros posteriores. Este resultado fortemente indica que a resposta detectada no bíceps braquial foi devido à estimulação do nervo e não resultou da estimulação do músculo.

Figura 3. Amplitude do CMAP, latência e estímulo necessário durante o curso da doença no hind - e patas dianteiras em ALS mouse modelos. SOD1-G93A (A–C) e PrP-hFUS-WT3 (D–F) ratos transgénicos do (tg) e não-transgênicos (não-tg) littermates foram medidos no início dos sintomas motor, na fase sintomática e na fase final-sintomático da doença processar, em dias de idade 57, 91 e 147 (d) ou em 29, 38 e 53 dias para ratos SOD1 G93A e WT3-PrP-hFUS, respectivamente. Preta: Não-transgênicas membro posterior, preto tracejado: membro anterior não-transgênicos, cinza: transgénico membro posterior, cinza tracejada: forelimb transgénico. Os resultados são apresentados como média ± SD. Amplitudes (A, D) eram estáveis ao longo do tempo, os animais não-transgênicas, tanto nos membros dianteiros e traseiros. Em animais transgénicos, amplitudes diminuíram durante o processo da doença. Latências (B, E) foram menos afetadas pela doença e foram observadas diferenças importantes entre o hind - e membros anteriores, independentemente do genótipo. O estímulo necessário (C, F) variação foi mínima em todos os grupos. Para SOD1 G93A N = 4 em todos os grupos, exceto para tg 147 d, N = 3. Para PrP-hFUS-WT3 ratos em grupos de idade 29, 38 e 53, N é para não-tg 4, 5 e 4 e tg 7, 5 e 3, respectivamente. Símbolos indicam a diferença entre os grupos da seguinte maneira: *: membro posterior não-tg x tg membro posterior, #: tg não-membro anterior vs forelimb tg, ¤: membro posterior não-tg vs não-tg forelimb, cinza *: membro posterior tg vs membro anterior de tg. ANOVA de duas vias com Tukey o teste de comparações múltiplas, *: p < 0.05, * *: p < 0,01, * * *: p < 0,001, * * *: p < 0,0001. #: p < 0.05, # #: p < 0,01, # # #: p < 0,001, # # # : p < 0,0001. ¤: p < 0.05, ¤: p < 0,01, ¤¤¤: p < 0,001, ¤¤¤: p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. CMAP amplitude, latência e estímulo necessário no hind - e patas dianteiras em camundongos CMT1A. C61-PMP22 ratos transgénicos do (tg) e não-transgênicos (não-tg) littermates foram medidos em 1,5 a 2 anos de idade. Amplitude (A) foi diminuída em hind - e patas dianteiras em ratos transgénicos. Latência (B) prolongou-se em todos os membros em camundongos CMT e mesmo sutil mudança nas patas dianteiras foi detectada com esta medida. Requisito para a intensidade do estímulo (C) foi aumentado em camundongos C61-PMP22, que se assemelha o fenótipo detectado em pacientes CMT1A. Os resultados são apresentados como média ± DP, para não-tg N = 4 e tg N = 3. ANOVA de duas vias com Sidak o teste de comparações múltiplas, * *: p < 0,01, * * *: p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Membro anterior potenciais de ação são causados pela estimulação do nervo. Para excluir a possibilidade de que a resposta CMAP observada foi causada por estimulação muscular, axotomy (parcial) realizou-se no nervo do plexo braquial. CMAP amplitude (A) e a latência (B) foram gravadas antes (pré) e 4 dias depois (pós) a axotomy do plexo braquial em ratos adultos não-transgênicos. Axotomy diminui a amplitude CMAP indicando que a resposta foi devido à estimulação do nervo. Preto: membro posterior, cinza: forelimb contralateral, cinza tracejada: membro anterior ipsilateral. Os resultados são apresentados como média ± DP, N = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.